Southern blot

• 正面朝上放在紫外交联仪中（909室），交联固定
• ddH2O稍加漂洗后空气中自然干燥
实验步骤
六.杂交和洗膜
• 将尼龙膜放入杂交管内, 加预杂交液, 60℃封闭6小时。
• 倒出预杂交液,加杂交液,60℃杂交过夜。 • 回收杂交液 (可重复使用), 将膜放在洗膜溶
液I中,室温洗2次,每次摇动5分钟。 • 再在洗膜溶液II中(60℃预热后直接倒进表面
16 μl 2 μl 2 μl
总体积
20 μl 总体积
20 μl
37℃保温1.5h。
实验步骤
二. 1％琼脂糖电泳
两组共用一块凝胶，共7个样
1.基因组DNA10 mg
组 2.酶切样品（1）
1
3.酶切样品（2）
4.阳性对照（pSV-c-myc重组质粒经BamH I 酶切后的8.5 kb线性片段，10pg/ml, 10ml)
影响杂交的因素
4）杂交液的离子强度
低盐浓度时杂交率较低,随着盐浓度增加,杂交率增加(Na+ 的作用)
高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,当进行序列不完全同源的杂交时,必须维持杂交液与洗膜液中较高的盐浓度;
5）非特异性杂交反应：预杂交的作用
杂交前封闭膜上非特异性杂交位点,减少其对探针的非特异吸附
实验步骤
• 切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上，赶走滤纸与胶之间的气泡
实验步骤
• 再将与胶大小相同的尼龙膜放在胶上，同样不能有气泡，然后放上三张浸湿的滤纸，赶走气泡
实验步骤
• 紧贴凝胶四周各放一张X光片
实验步骤
• 小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜要紧贴滤纸，但不能让滤纸移动
实验步骤
Hale Waihona Puke 1d检测（杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色）

Southern Blot操作流程

Southern Blot 操作流程1、哺乳动物基因组DNA 的提取（或用OMEGA 试剂盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit ） 1、取约30mg 样品，加入600 ul SNET ，再加入12 ul （20.2mg/ml ）的蛋白酶K ，使蛋白酶K 的终浓度为400ug/ml ； 2、 55℃振荡过夜；3、加入0.6 ul RNaseA ，室温下孵育10 min ，后置于65℃ 10 min ；4、加入300 ul Tris 饱和酚，288 ul 氯仿和12 ul 异戊醇，室温下振荡30 min ；5、 17,000 g 离心5min ，转移上层水相（600 ul ）至一新的离心管；6、加入等体积（600 ul ）的异丙醇沉淀DNA ，于4℃下13,250 g 离心15 min ；7、小心除去异丙醇，加入1 ml 70%的乙醇。

离心5 min 后除去乙醇，室温下干燥15~20 min ；8、加入100 ul TE ，使核酸沉淀溶解。

一、酶切1、拷贝数的计算哺乳动物基因组全长3.0×109个碱基对，按插入基因单拷贝计算如下：()gplasmidof mass bpbp DNA of Insertionμ10100.39=⨯2、酶切体系基因组DNA 10 ug 10*Buffer 10 ul 酶(10U/ul) 10 ul Total100 ul3、混合后置于适宜酶切温度进行酶切反应；4、对酶切产物进行纯化，用30 ul TE 洗脱；5、制备1%浓度的琼脂糖凝胶（不加EB ）；6、将纯化后的酶切产物敞开盖子于70℃放置15 min ，以除尽残留乙醇和消除酶切后产生的粘性末端；7、电泳：1v/cm。

二、转膜1、碱变性：把胶条转移到含碱变性液的器皿中，摇床处理15 min；重复一次；2、中和：倒出器皿中的碱变性液，加入中和液，摇床处理15 min；重复一次；3、倒出中和液，加入20×SSC，摇床处理15 min；4、转膜：1）在一干净的容器中放入一包吸水纸，倒入20×SSC，浸湿；2）放上一张与胶条大小相当的sigma 3M滤纸，倒上一层20×SSC，防止产生气泡；3）将预先剪裁好的尼龙膜放入ddH2O中充分浸润2分钟；4）小心把胶条铺在滤纸上面，用玻璃棒擀平，赶走气泡；5）往胶上倒上一层20×SSC，将尼龙膜铺在胶条上，再向上倒上一层20×SSC；6）再放上一张与胶条大小相当的sigma 3M滤纸；7）用保鲜膜把胶条四周封上，在上面压上一包吸水纸，再用一个约250mg的物体压在吸水纸上面；8）转膜过夜；5、固定将膜放在用10×SSC浸湿的滤纸上面，使含DNA面朝上，放入紫外交联仪中，以1.5J，254n，2.5min的程序将DNA固定在尼龙膜上。

southern杂交

Southern流程示意 Southern流程示意
基因组DNA 基因组DNA
限制性酶切
DNA限制片段 DNA限制片段
琼脂糖凝胶电泳
转膜
转移缓冲液
பைடு நூலகம்与标记探针杂交检测
盖子两层长滤纸三层湿滤纸凝胶 n+ 尼龙膜三层湿滤纸十层干滤纸 10cm吸水纸 10cm吸水纸
转膜
即将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上。而此过程最重要的是保持各DNA片段的相对位置不变。DNA是沿与凝胶平面垂直的方向移出并转移到膜上，因此，凝胶中的DNA片段虽然在碱变性过程已经变性成单链并已断裂，转移后各个DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置仍然一样，故而称为印迹（blotting）。用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙（Nylon）膜、化学活化膜和滤纸等，转膜时可根据不同需要选择不同的固相支持物用于杂交。其中常用的是 NC膜和Nylon膜。各种膜的性能和使用情况比较见各种尼龙膜性能及使用情况比较表。
与标记分子杂交
• （一）原理 • 转印后的滤膜在预杂交液中温育4-6h，即可加入标记的探针转印后的滤膜在预杂交液中温育， DNA（探针预先经加热变性成为单链DAN分子），即可进行杂分子），（探针DNA预先经加热变性成为单链预先经加热变性成为单链分子），即可进行杂交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。杂交过夜，交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。杂交过夜，然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高，然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高，杂交的严格程度越高，也就是说，严格程度越高，也就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。 • （二）步骤 • 1.将标记的将标记的DNA探针置沸水浴探针置沸水浴10min，迅速置冰上冷却1-2min，，迅速置冰上冷却，将标记的探针置沸水浴变性。使DNA变性。变性 • 2.从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料袋，剪开一角，将变从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料袋，从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料袋剪开一角，性的DNA探针加到预杂交液中。探针加到预杂交液中。性的探针加到预杂交液中 • 3.尽可能除取袋中的空气，封住袋口，滞留在袋中的气泡要尽可尽可能除取袋中的空气，尽可能除取袋中的空气封住袋口，能地少，为避免同位素污染水浴，能地少，为避免同位素污染水浴，将封好的杂交袋再封入另一个未污染的塑料袋内。染的塑料袋内。 • 4.置42℃水浴温育过夜（至少置 ℃水浴温育过夜（至少18h）。）。

Southern Blot原理及实验方法

Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。

如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。

试剂和器材一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。

中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。

20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。

以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。

2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。

6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。

二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。

取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。

2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。

3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。

防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。

4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。

5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。

6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。

Southern Blot原理及实验方法

Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。

如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。

一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。

中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。

20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。

以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。

2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。

6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。

二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。

取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。

2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA 转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。

3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。

防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。

4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。

5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。

6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。

southern 印迹法

实验七Southern印迹法[目的]１．熟悉Southern 印迹法的基本操作方法和主要步骤的工作原理。

２．了解Southern印迹的意义。

[原理]Southern印迹法(Southern Blot)是将基因组 DNA经限制性内切酶酶解、琼脂糖凝胶电泳分离，使DNA片段按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上；经碱处理凝胶使DNA变性(使双链DNA变成单链)，通过具有一定盐离子浓度溶液的虹吸作用，将凝胶中变性的单链DNA片段原位地吸印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；•经过干燥或紫外线照射处理，单链DNA片段的极性基团与支持膜上的基团结合而使DNA分子牢固地固定到转移膜上；转移后的单链DNA 分子与32P或35S标记的DNA探针按互补原理进行杂交；经放射自显影对特定位置上显现的特异DNA片段进行分析。

这种方法最初是由Southern于1975年建立的。

方法中DNA转移的方式和复印的过程一样，比较准确地保持了特异DNA顺序在电泳图谱中的位置（也可将变性的凝胶负压干燥后与特定的DNA探针进行原位杂交）。

它把电泳分离和杂交结合起来，不但能检测出特异的DNA序列片段，而且能进行定位和测定分子量。

即先以电泳后照相记录的已知分子量的DNA片段(常用Hind Ⅲ或EcoRⅠ降解的λDNA)为标准，精确测量各标准片段与电泳原点之间的距离。

以DNA的Log10kb为纵坐标，移动距离(cm)为横坐标，连接各已知条带相应的点，得到一条标准曲线。

然后测量未知条带(放射自显影后获得的特异片段)的移动动距离，在标准曲线上找出相应的Log10kb值，以此计算出其分子量大小。

[器材与试剂]一、器材1．电热真空干燥箱2．硝酸纤维素滤膜或尼龙膜3．大方瓷盘、带盖方盘、玻璃板4．滤纸、吸水纸、保鲜膜、蜡膜（Parafilm）、一次性手套等5．刀片、刻度吸管、镊子、剪刀、lkg重物二、材料电泳分离DNA的琼脂糖凝胶三、试剂1．酸变性液:0.25mol/L HCl，用分析纯的盐酸（12Mol/L）稀释2．碱变性液：0.5mol/L NaOH， 1.5mol/l NaCl（pH13.1）3．中和液：0.5mol/L Tris·HCl(pH7.5),1.5mol/L NaCl4．20×SSC: 0.3mol/Ｌ柠檬酸，3mol/L NaCl,pH7.0(配方见附录)5．10×SSC和2×SSC：用双蒸馏水稀释20×SSC储存液[实验步骤]注意：操作戴手套！1．凝胶处理:1)凝胶照像后，切去包括标记带在内的多余部分，将凝胶的一角(•点第一个样品的一侧)切去作为标记，以便于定位。

southern blot原理

southern blot原理
Southern Blotting 原理
Southern blotting 技术是由 Edwin M. Southern 在 1976 以
一种简单而有效的方法提出的，用于支持DNA含量的分析。

它最常被用于鉴定由多种DNA碱基构成的特定序列，以及鉴定和检测特定DNA 序列的存在、比较、分析及其分布。

它通过将DNA模板分离出来，再将DNA模板用聚合酶链反应(PCR)扩增以获得足够多的DNA模板，最后将经过扩增的DNA模板遇到一种特殊的处理，以使它与一张特殊的膜片或者膜片上的特定序列结合。

Southern blotting 包括以下几个步骤：1). 将DNA样本用双链酶将双链DNA分割成小的片段；2). 将分离出来的小DNA片段用一种特殊的方法分子印迹(molecular blotting)到一张特殊的膜片上；3). 将特定的标记物(比如特定的核酸或抗体)与经过分子印迹的DNA片
段结合；4). 将结合物暴露在感光材料上，从而将其结果显示出来。

Southern blotting 技术可以用于检测DNA片段的量、品种、分布、多样性及数量。

这种技术具有准确性高、特异性好、操作简单、检测效率高的优势。

Southern blotting 技术可以用于：1). 鉴定特定的DNA序列；
2). 鉴定DNA片段的长度；3). 检测突变；4). 检测某种重组；5). 筛选特定基因序列；6). 检测融合基因；7). 研究基因组学；8). 检测特定的核酸，如RNA、miRNA、siRNA等。

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如何确定转基因拷贝数(Southern Blot法和荧光定量PCR方法)

如何确定转基因拷贝数（Southern Blot法和荧光定量PCR方法）发布: 2010-01-22来自: 易生物实验阅读数：5391次鉴定转基因植物的第一步就是要确定被转基因已经稳定的整合到了染色体上。

第二步任务就是评估有多少个转基因拷贝，以及每个转基因的表达水平如何。

一般经过上游表达载体的设计构建以及下游转化体系的建立、转化品系的筛选鉴定等一系列步骤后，即获得T 0 代转基因植物。

在转化过程中，外源DNA 随机插入植物内，插入的拷贝数和位点都不固定。

插入外源基因的拷贝数低（1或2个）能较好的表达，插入的拷贝数多则会导致表达的不稳定甚至基因沉默现象。

因此，检测T0代植物的外源基因的拷贝数是研究其分子特性的基础步骤之一。

1、Southern Blot法Southern Blot是一种常用的DNA定量的分子生物学方法。

其原理是将待测的DNA 样品固定在固相载体（硝酸纤维膜或尼龙膜）上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA 的位置上显示出杂交信号，通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数。

Southern法准确性高、特异性强，但存在费时费力的缺点。

另外，由于Southern法检测不经过靶片段的扩增（PCR），一般每个电泳通道需要10-30 μg的DNA ，在实际操作中就需要较大量的植物材料来提取DNA ，而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后一般都比较细弱，不宜大量取样。

如果外源基因在插入时发生基因重组，造成限制性酶切位点丢失，Southern 法也无法检测到。

这些因素都制约了Southern法在T0代植物中检测外源基因拷贝数的应用。

2、荧光定量PCR方法利用新型、灵敏、高通量的实时荧光定量PCR方法可以用于测定原始品系中转基因的绝对拷贝数。

实时荧光定量PCR技术是一种较新的DNA 定量方法。

其定量的基本原理是在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如：SYBR GREEN I）或特异性的荧光探针（如：Taqman 探针），实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数：CT值（Cycle Threshold）；通过将已知浓度标准品的CT值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量样品的浓度。

southern blot的中文操作步骤

一. 地高锌-DNA 标记1. 用51-4全长质粒做模板,用BspQ I 和Sca I双酶切,NEBBuffer：10 μLBspQ I： 3 μLSca I ： 2 μL质粒：60ul水：25μL100μL体系先放于37℃的培养箱10小时,然后于50℃水浴, BspQ I作用的温度为50℃, Sca I作用温度为37℃.2.胶回收全长片段(3.2kb)1．100μL酶切产物加loading buffer全上样，电泳后回收3000bp左右的片段。

2．称重加入3倍体积的QG（1g/3mL），50℃水浴10min融胶,其间颠倒2-3次。

3．将液体转移至柱子，13000rpm/min 1min，弃滤液。

4．加入500μLQG，13000rpm/min 1min，弃滤液。

(去除痕量的融胶)5．加入750μL PE，静置5min，13000rpm/min 1-2min.6．13000rpm/min空离2min7．置一新EP管上，加入40μL ddH2O，静置10min，13000rpm/min 1min，收集滤液备用。

用2ul测OD值.(51-4含量:0.28ug /ul)3. 探针反应用H2O 或Tris buffer溶解模板(胶回收的51-4),不能用TE,因为EDTA会抑制探针反应.步骤:1.取4ul 51-4胶回收产物,加双蒸水至16 ul.2. 100℃沸水中放置10min变性,冰上骤冷.3. 混匀DIG-High prime,取4ul DIG-High prime加到上述变性DNA溶液中,混匀,短暂离心,37℃孵化20小时4. 65℃水浴10min二.标记效率的检测1.倍比稀释探针探针反应后的探针量为23000ng .1000ng 模板→20h →probe 2300ng/20ul≈100ng/ul①第一次稀释：10ul probe①加入90ul DNA dilution buffer(10ng/ul)②第二次稀释：5ul ②加入45ul dilution buffer (1ng/ul)③第三次稀释：(2) Control DNA (5ng/ul)的倍比稀释吸取5 ul Control DNA (5ng/ul)加入20 ul的DNA dilution buffer(1 ng/ul)2.点膜(1)取1 ul Control DNA D2-D8点于尼龙膜上,与其相平行的一排点上地高辛标记的DNA D2-D8,最后各点一个dilution buffer.如下图所示.O O O O O O O O ControlO O O O O O O O DigD2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 dilution buffer将尼龙膜放于滤纸上,在其上再放一张等大的滤纸,于80℃烤箱烘烤2 hour.拿出于室温放置.(2)将膜转移到含有20ml washing buffer的封口袋中,室温振摇2min,弃尽washingbuffer(3)加10 ml 1XBlocking solution振摇孵育30 min, 弃尽Blocking solution(4)加10 ml 稀释了104倍的antibody solution振摇孵育30 min,弃antibody solution(5)加10 ml 1Xwashing buffer 洗膜两次,2X15 min,弃washing buffer(6)加10 ml 1Xdetection buffer振摇平衡2-5 min(7)将膜取出放入有双层薄膜的一层薄膜上,加约4滴的CSPD ready-to-use 横跨尼龙膜表面,将袋子的第二层膜盖在含探针DNA的一层薄膜上,尽量不能有气泡.(8)室温孵育5 min(吸尽过量的液体,将薄膜四边封口)(9)37℃孵育10 min(10)进入暗室,压膜一定时间,把压好的片子先放于以1:9稀释好的100 ml的显影液中显影5 min左右,拿出来放入定影液中定影5 min左右,用水冲洗干净,白光下照相.3.探针结果分析A.D6的荧光强度为理想的标记DNA,如:DNA样品按上述方法稀释的,实际上含有20ng/ul标记探针.B.D5 出现荧光,是足量的标记DNA,如: DNA样品按上述方法稀释的,实际上约含有7 ng/ul标记探针C.D4出现荧光,标记DNA不够(确定DNA探针量后再进行下一步)D.计算出探针浓度后看需要多少的探针溶液来杂交,如:D6做探针时,每ml杂交buffer用1.25ul的20ng/ul DNA探针溶液在Southern blot检测DNA,D5做探针时,每ml杂交buffer用3.75ul的7 ng/ul DNA探针溶液(25 ngDNA 探针) 在Southernblot检测DNA,D4不能当探针,重做一个.三. 探针杂交southern blot DNA探针的杂交流程在琼脂糖上分离DNA样品条带(30min-2h)↓转移DNA到尼龙膜上(southern blot)A.脱嘌呤和变性DNA(1h)B.用毛细管转移DNA到尼龙膜上(过夜)C.烘烤固定DNA(30 min-2h)↓用DIG-Easy Hyh进行预杂交(30 min)↓DIG-labeled DNA与DNA进行杂交A.孵育标记了DNA探针的尼龙膜(4-16h)B.洗膜,将未杂交的探针洗掉(45 min)1.DNA的电泳分离(1)用TBE配置一块琼脂糖凝胶,胶越薄越好.(注:为了得到理想结果,在胶里不能放EB染色或跑过的buffer,(Ethidium)乙啡啶,假如电泳条带跑的不够长可能会引起背景不均匀的问题. (2)点上少量目的DNA,一般地,目的DNA的浓度要低,如:每个泳道点2.5-5ug人类基因组DNA 或假如基因组比人类DNA还复杂的,每个泳道就跑10ug以上或每个泳道跑<1ng的质粒DNA (3)点上分子量的Marker,相应的每泳道点上5ul的DIG-labeled DNA Marker.(注:需要量依赖于杂交产量,确保点的Marker量足够显示出样品同样位置的条带.(4)跑胶直到DNA分离的很好,用30-50V电压跑胶大约5h左右.(5)为了评价目的DNA 的质量,以0.25-0.5ug/ml EB染色,在紫外灯下成像.(15-30 min)2.把DNA转移到尼龙膜上1).凝胶里变性DNA:用变性溶液(0.5M NaOH,1.5M NaCI)浸没凝胶2X15 min,室温温和振摇,之间用无菌双蒸水冲洗凝胶.2).中和:用中和液(0.5M Tris-HCI,PH 7.5;1.5M NaCI )室温浸没凝胶振摇2X15 min ，之间用无菌双蒸水冲洗凝胶3).用20XSSC平衡凝胶,振摇至少10 min4).按照下述进行blot,避免产生气泡:●放一张已经沾有20XSSC溶液的Whatman 3 MM纸于桥上,然后往槽里放20XSSC●把凝胶放在浸湿了的Whatman 3 MM纸上,用无菌吸管在凝胶与纸之间吸走所有气泡●剪一块与凝胶大小的尼龙膜●放这张膜于含有DNA的凝胶上,按上述方法用移液器消除气泡●然后再加上一层Whatman 3 MM纸,一叠纸巾,一快玻璃板和一个重200-500g的重物,完成印记转移的三明治模式.5).印记过夜在20XSSC溶液里转移，如图示(5cm)封口膜或X片20×SSC6).当印记还湿润时,用下面方法固定DNA到印记上●用2XSSC(不含SDS)简单冲洗膜●在80℃烘考此膜1h.7).膜可继续下面实验或者保存干燥印记(用两张Whatman 3 MM纸包裹密封)4℃保存.3.用DIG easy Hyb进行印记杂交1．杂交●注意：在任何时候都不要让膜干燥。

southern blot的中文操作步骤

一. 地高锌-DNA 标记1. 用51-4全长质粒做模板,用BspQ I 和Sca I双酶切,NEBBuffer：10 μLBspQ I： 3 μLSca I ： 2 μL质粒：60ul水：25μL100μL体系先放于37℃的培养箱10小时,然后于50℃水浴, BspQ I作用的温度为50℃, Sca I作用温度为37℃.2.胶回收全长片段(3.2kb)1．100μL酶切产物加loading buffer全上样，电泳后回收3000bp左右的片段。

2．称重加入3倍体积的QG（1g/3mL），50℃水浴10min融胶,其间颠倒2-3次。

3．将液体转移至柱子，13000rpm/min 1min，弃滤液。

4．加入500μLQG，13000rpm/min 1min，弃滤液。

(去除痕量的融胶)5．加入750μL PE，静置5min，13000rpm/min 1-2min.6．13000rpm/min空离2min7．置一新EP管上，加入40μL ddH2O，静置10min，13000rpm/min 1min，收集滤液备用。

用2ul测OD值.(51-4含量:0.28ug /ul)3. 探针反应用H2O 或Tris buffer溶解模板(胶回收的51-4),不能用TE,因为EDTA会抑制探针反应.步骤:1.取4ul 51-4胶回收产物,加双蒸水至16 ul.2. 100℃沸水中放置10min变性,冰上骤冷.3. 混匀DIG-High prime,取4ul DIG-High prime加到上述变性DNA溶液中,混匀,短暂离心,37℃孵化20小时4. 65℃水浴10min二.标记效率的检测1.倍比稀释探针探针反应后的探针量为23000ng .1000ng 模板→20h →probe 2300ng/20ul≈100ng/ul①第一次稀释：10ul probe①加入90ul DNA dilution buffer(10ng/ul)②第二次稀释：5ul ②加入45ul dilution buffer (1ng/ul)③第三次稀释：(2) Control DNA (5ng/ul)的倍比稀释吸取5 ul Control DNA (5ng/ul)加入20 ul的DNA dilution buffer(1 ng/ul)2.点膜(1)取1 ul Control DNA D2-D8点于尼龙膜上,与其相平行的一排点上地高辛标记的DNA D2-D8,最后各点一个dilution buffer.如下图所示.O O O O O O O O ControlO O O O O O O O DigD2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 dilution buffer将尼龙膜放于滤纸上,在其上再放一张等大的滤纸,于80℃烤箱烘烤2 hour.拿出于室温放置.(2)将膜转移到含有20ml washing buffer的封口袋中,室温振摇2min,弃尽washingbuffer(3)加10 ml 1XBlocking solution振摇孵育30 min, 弃尽Blocking solution(4)加10 ml 稀释了104倍的antibody solution振摇孵育30 min,弃antibody solution(5)加10 ml 1Xwashing buffer 洗膜两次,2X15 min,弃washing buffer(6)加10 ml 1Xdetection buffer振摇平衡2-5 min(7)将膜取出放入有双层薄膜的一层薄膜上,加约4滴的CSPD ready-to-use 横跨尼龙膜表面,将袋子的第二层膜盖在含探针DNA的一层薄膜上,尽量不能有气泡.(8)室温孵育5 min(吸尽过量的液体,将薄膜四边封口)(9)37℃孵育10 min(10)进入暗室,压膜一定时间,把压好的片子先放于以1:9稀释好的100 ml的显影液中显影5 min左右,拿出来放入定影液中定影5 min左右,用水冲洗干净,白光下照相.3.探针结果分析A.D6的荧光强度为理想的标记DNA,如:DNA样品按上述方法稀释的,实际上含有20ng/ul标记探针.B.D5 出现荧光,是足量的标记DNA,如: DNA样品按上述方法稀释的,实际上约含有7 ng/ul标记探针C.D4出现荧光,标记DNA不够(确定DNA探针量后再进行下一步)D.计算出探针浓度后看需要多少的探针溶液来杂交,如:D6做探针时,每ml杂交buffer用1.25ul的20ng/ul DNA探针溶液在Southern blot检测DNA,D5做探针时,每ml杂交buffer用3.75ul的7 ng/ul DNA探针溶液(25 ngDNA 探针) 在Southernblot检测DNA,D4不能当探针,重做一个.三. 探针杂交southern blot DNA探针的杂交流程在琼脂糖上分离DNA样品条带(30min-2h)↓转移DNA到尼龙膜上(southern blot)A.脱嘌呤和变性DNA(1h)B.用毛细管转移DNA到尼龙膜上(过夜)C.烘烤固定DNA(30 min-2h)↓用DIG-Easy Hyh进行预杂交(30 min)↓DIG-labeled DNA与DNA进行杂交A.孵育标记了DNA探针的尼龙膜(4-16h)B.洗膜,将未杂交的探针洗掉(45 min)1.DNA的电泳分离(1)用TBE配置一块琼脂糖凝胶,胶越薄越好.(注:为了得到理想结果,在胶里不能放EB染色或跑过的buffer,(Ethidium)乙啡啶,假如电泳条带跑的不够长可能会引起背景不均匀的问题. (2)点上少量目的DNA,一般地,目的DNA的浓度要低,如:每个泳道点2.5-5ug人类基因组DNA 或假如基因组比人类DNA还复杂的,每个泳道就跑10ug以上或每个泳道跑<1ng的质粒DNA (3)点上分子量的Marker,相应的每泳道点上5ul的DIG-labeled DNA Marker.(注:需要量依赖于杂交产量,确保点的Marker量足够显示出样品同样位置的条带.(4)跑胶直到DNA分离的很好,用30-50V电压跑胶大约5h左右.(5)为了评价目的DNA 的质量,以0.25-0.5ug/ml EB染色,在紫外灯下成像.(15-30 min)2.把DNA转移到尼龙膜上1).凝胶里变性DNA:用变性溶液(0.5M NaOH,1.5M NaCI)浸没凝胶2X15 min,室温温和振摇,之间用无菌双蒸水冲洗凝胶.2).中和:用中和液(0.5M Tris-HCI,PH 7.5;1.5M NaCI )室温浸没凝胶振摇2X15 min ，之间用无菌双蒸水冲洗凝胶3).用20XSSC平衡凝胶,振摇至少10 min4).按照下述进行blot,避免产生气泡:●放一张已经沾有20XSSC溶液的Whatman 3 MM纸于桥上,然后往槽里放20XSSC●把凝胶放在浸湿了的Whatman 3 MM纸上,用无菌吸管在凝胶与纸之间吸走所有气泡●剪一块与凝胶大小的尼龙膜●放这张膜于含有DNA的凝胶上,按上述方法用移液器消除气泡●然后再加上一层Whatman 3 MM纸,一叠纸巾,一快玻璃板和一个重200-500g的重物,完成印记转移的三明治模式.5).印记过夜在20XSSC溶液里转移，如图示(5cm)封口膜或X片20×SSC6).当印记还湿润时,用下面方法固定DNA到印记上●用2XSSC(不含SDS)简单冲洗膜●在80℃烘考此膜1h.7).膜可继续下面实验或者保存干燥印记(用两张Whatman 3 MM纸包裹密封)4℃保存.3.用DIG easy Hyb进行印记杂交1．杂交●注意：在任何时候都不要让膜干燥。

Southern blot基本概述

Southern blot基本概述一、目的学习Southern blot技术及其应用二、概述1975年E.Southern发明了将DNA切开，电泳分离，再变性，印迹到硝酸纤维（NC）滤膜上，用探针进行杂交，检测DNA的方法。

自显影或显色用于DNA分析。

以32P标记放射性探针为例，放射自显影观察结果。

互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。

杂交过程是高度特异性的，可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。

杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。

该检测对象可以是克隆化的基因组DNA，也可以是细胞总DNA 或总RNA。

根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。

分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性或非放射性标记的探针与被固定的模板杂交，经显影或现色后检测出目的DNA 或RNA 分子所处的位置。

根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类： Southern 杂交、Northern 杂交、点杂交、缝隙及原位杂交。

核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性，因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。

因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用，而且在临床诊断上的应用也日趋增多。

Southern 杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA 片段中是否存在与探针同源的序列。

本实验包括基因组DNA 限制性内切酶切，DNA电泳及转膜，杂交及检测三部分。

三、基因组DNA限制性内切酶酶切（一）、试剂及材料1.EcoRl内切酶及反应buffer2.基因组DNA或PCR产物等样品3.去离子水4.eppendorf管及Tip头5.PCR仪6.标记笔、无粉手套等（二）、操作步骤：1.设置50ul反应体系，在200ulEP管中加入：10ug基因组DNA x ul去离子水49-xul10×buffer 5 ulEcoRl 4 ul2.充分混匀，离心20S。

Southern印迹技术应用与注意事项

（Edwin Mellor Southern UK）
随后于1977年，Alwine等人应用类似方法用于检测经琼脂糖凝胶或聚丙烯酰
胺凝胶（PAGE）电泳中分离的特定RNA，此方法又称为Northern blot（Northern
印迹）。 1979年Towbin等再将该方法扩展到特定的蛋白质检测或分析上，成为Western blot（Western 印迹）
从而检测特定DNA分子的含量。
三、操作步骤
酶切位点、探针设计
根据酶切位点进行样本的酶切，低压电泳分离 DNA 片段
杂交过夜，洗膜并显色
实验前
样本准备
酶切电泳
转膜固定
杂交显色
DNA提取及处理,探针标记
文本
处理电泳之后的凝胶，转膜，固定DNA
三、操作步骤-酶切位点，探针设计
酶切位点设计原则：
备）；
4) 杂交：弃去预杂交液，往杂交瓶中加入新的Hyb 高效杂交液（10 mL/100㎜2），再加入 6 μL变性好的探针（5-20 ng/ mL杂交液），混匀，置于杂交炉中42℃杂交过夜。
洗膜及DIG信号检测
1) 杂交后，室温下，20 mL 2×SSC+0.1%SDS 洗膜5 min，重复一次 2) 将0.1×SSC+0.1%SDS洗液置于65℃水浴锅中预热后，加入20 mL 进杂交瓶中，65℃洗涤15 min，重复一次； 3) 将膜取出，置于平板中，加入20 mL 洗涤缓冲液中轻轻晃动5 min，倒掉液体； 4) 加入100 mL 阻断液反应30 min（在摇床上轻轻摇动），倒掉液体； 5) 加入20 mL 含有抗体的缓冲液，摇动孵育30 min后，倒掉液体； 6) 再加入100 mL洗涤缓冲液洗涤15 min，倒掉液体后，重复此步骤一次； 7) 加入20 mL检测缓冲液，平衡5分钟； 8) 将膜放在盛有底物显色液的盒中（10 mL显色液/100 mm2），15-25℃避光孵育3-5h； 9) 当显色到适合效果后用水洗膜5 min，扫描结果。

southern blot原理

southern blot原理Southern blot是一种分子生物学技术，用于检测DNA序列的特定位置。

它是由爱德华·南部（Edward M. Southern）于1975年发明的，因而得名。

Southern blot技术的原理是基于DNA的亲和性杂交和电泳分离。

需要提取待检测的DNA样本，并在实验室条件下将其切割成片段。

然后，将这些DNA片段通过电泳分离。

电泳是一种利用电场将带电粒子（如DNA片段）分离的技术。

通过电泳，DNA片段根据其大小被分离成不同的带状图案。

接下来，将DNA片段转移到固体支持介质上，通常是一张特殊的纸或膜，如尼龙膜。

这个步骤通常称为转移。

转移可以通过将介质浸泡在缓冲液中，然后将电场应用于系统中来完成。

DNA片段通过电泳的方式从凝胶中转移到膜上，并形成与凝胶中的DNA带状图案相对应的DNA带状图案。

在转移完成后，膜上的DNA被固定在那里，并需要进行固定。

这通常通过使用紫外线照射或加热等方法来实现。

固定DNA片段后，可以开始进行亲和性杂交。

亲和性杂交是Southern blot技术的关键步骤之一。

在这一步骤中，需要准备一个DNA探针，它是一个与待检测DNA序列互补的DNA片段。

DNA探针可以通过合成或从其他来源获得。

然后，将DNA探针标记上标记物，以便在后续步骤中进行检测。

标记物可以是放射性同位素、荧光染料或酶等。

在亲和性杂交过程中，将标记的DNA探针加入含有被固定DNA片段的膜的溶液中。

DNA探针与被固定的DNA片段发生亲和性结合，形成DNA双链。

接下来，需要洗去未结合的DNA探针。

这可以通过多次用高盐浓度的缓冲液洗涤膜来实现。

洗涤过程中，未与固定的DNA片段结合的DNA探针会被洗掉，而与固定的DNA片段结合的DNA探针会保留在膜上。

将膜进行检测，并得到目标DNA序列的信息。

检测可以使用放射性探针的放射线显像、荧光探针的荧光显像或酶标记物的化学发光等方法。

通过检测，可以确定在膜上的哪些位置存在目标DNA序列。

Southern_blot实验方法与步骤

实验名称： Southern blot一、实验目的1．学习核酸杂交的基本过程和操作。

二、实验原理将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。

如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。

三、试剂与仪器（一）器材：糖瓷盘，台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪，摇床，X线胶片。

（二）试剂：限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl变性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl）中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）,转印迹液SSC（3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0）标记探针，20×SSC，预杂交液和杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）2×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS)1×缓冲洗液（0.1M马来酸0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）1×封阻液[1％(W/V)封阻剂溶于]1×马来酸溶液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.51×检测液（0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5）抗－地高辛－碱性磷酸酶。

四、实验步骤1、制备DNA分子（PCR）2.琼脂糖凝胶电泳分离DNA3电泳结束后，将胶小心从电泳槽中取出，用手术刀将胶中没有DNA样品的四周部分略做修剪，然后将胶放入0.25 N HCl中脱嘌呤，当胶中的溴酚蓝变为黄色取出4将胶从HCl溶液中取出，用ddH2O涮洗两次，然后放入碱变性液（0.5 M NaOH）中处理45 min，使胶中的ds-DNA变为SS-DNA。

Southern blot实验报告

医学分子生物学实验技术实验报告实验名称： Southern blot一、实验目的1．学习核酸杂交的基本过程和操作。

二、实验原理1. Southern blot实验原理根据DNA变性和复性发展的一种实验技术，就是分子杂交（hybridization)。

指两条来源不同但具有同源性的核酸单链在一定条件下，根据碱基互补的原则缔结成双链分子。

Southern杂交是指一种利用标记的探针与膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。

其主要步骤包括：⑴基因组DNA的限制性酶切；⑵DNA 酶切片段的电泳分离和转移；⑶杂交及检测。

三、实验步骤1、基因组DNA的限制性内切酶酶切1.1按如下方案进行基因组的酶切HL60基因组DNA 10 mg 5 ul10×Buffer E 2 ulEcoR I（10 u/ml） 2 ulddH20 11ul总体积 20 ul37℃保温1.5小时。

2、电泳分离2.1保温期间，浇一块凝胶板：称0.6g琼脂糖加60ml1xTAE，微波炉低火加热1分钟，让琼脂糖完全溶解，稍微冷却后，加6 ulGelRed，浇在封好的并已插上梳子的凝胶板上，移去气泡，室温放置40分钟以上。

2.2 DNA酶切后加1/5体积6x加样缓冲液。

2.3 取阳性对照10ul，含c-myc 4.7 kb线性片段300pg，加1/5体积6x加样缓冲液。

2.4取基因组DNA10ug，加ddH2O至10 ul，加1/5体积6x加样缓冲液。

同时去自己抽提的基因组DNA20ul，加1/5体积6x加样缓冲液。

2.5将凝胶放入电泳槽中，加入1xTAE，直到液面高出凝胶1mm，将以上各样品小心加入样品槽中，两组共用一块凝胶，共7个样，从左至右依次为：1未酶切自己基因组，2未酶切老师基因组，3 酶切老师基因组，4阳性对照（4.8kb线性c-myc），5酶切老师基因组，6未酶切老师基因组，7未酶切自己基因组。

Southern-Blot-实验流程(包括原理细节)

Southern Blot 实验流程（包括原理/细节）一、DNA 的提取人和哺乳动物细胞基因组DNA的分离通常是在有EDTA、Sarkosye等一类去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚、氯仿抽提，经RNase 处理和纯化来提取DNA。

(1)取单层细胞，经无钙、镁PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞悬液经PBS洗2次,弃上清，取细胞沉淀。

(2)加入2ml细胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1% SDS)充分混匀，加入蛋白酶K 至终浓度为0.5～1g/L、Sarkosye终浓度为0.5%，混匀裂解蛋白呈糊状。

(3)50℃水浴2h，转入37℃水浴过夜，次日加入等体积饱和酚，轻轻颠倒混匀，以防止DN A断裂，约3min。

12000r/min 离心15分钟（室温）(4)取水相，再加入等体积酚/氯仿(1:1),同样颠倒混匀，去除蛋白质12000 r/min 离心15分钟（室温）(5)再重复步骤(4)，再用等体积酚/氯仿(1:1)抽提一次(6)取水相，再加入等体积氯仿，去除酚及蛋白质，颠倒混匀12000 r/min 离心15分钟（室温）(7)取水相，加入2倍体积的预冷无水乙醇，沉淀DNA，混匀-20℃放置1小时12000 r/min 离心15分钟（室温）(8)用70%乙醇洗涤一次，按上法离心将沉淀真空干燥10分钟。

(9)加入RNase A至终浓度100mg/L，37℃水浴消化1小时，消化污染的RNA。

(10)加入蛋白酶K 至终浓度0.4g/L、Sarkosye至终浓度0.5%，混匀，50℃水浴2小时，加入NaAC至终浓度10mmol/L。

(11)用等体积饱和酚各抽提一次，步骤同前。

(12)吸上清，加入氯仿/异戊醇(24:1)，按上法再抽一次。

(13)取水相，加入2倍体积预冷无水乙醇，-20℃1小时。

(14)取沉淀用70%乙醇洗一次，真空干燥10分钟后溶于少量TE中，4℃贮存。

Southern blot实验方法与步骤

•Southern blot实验方法与步骤用于检测重组DNA，也可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA片段。

用于基因诊断，也可验证检测片段的分子量大小。

将基因组DNA经限制性内切酶酶切，进行琼脂糖电泳，把分离后定位在凝胶上的不同分子量的DNA经碱变性处理，将凝胶中变性的DNA转移至一固相支持滤膜。

利用标记的某一DNA、RNA或寡核苷酸与固着于滤膜上的DNA发生同源性杂交，利用放射自显影（化学发光法或显色法）检测。

（一）器材：台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪或80℃烤箱，摇床，X线胶片。

（二）试剂：限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl，变性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl），中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）, 转印迹液20�wSSC （3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0），标记探针， 2�wSSC，预杂交液和杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）,0.5×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×缓冲洗液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）,1×封阻液[1％(W/V)封阻剂溶于1×马来酸溶液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5）]，1×检测液（0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5），抗－地高辛－碱性磷酸酶。

注意：若基因组DNA过低，要以较大体积进行限制酶消化，消化完毕后，可以通过乙醇沉淀、浓缩DNA片段，加少量DNA加样缓冲液点样。

2、消化好的样品点样于0.7％琼脂糖凝胶进行电泳；注意：为保证DNA均匀分散于加样孔，应缓慢将样品加至加样孔。

DNA印迹杂交 southern blot

DNA印迹杂交（southern blot）是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。

一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA 片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。

主要应用于转基因鉴定，遗传病诊断，DNA图谱分析，PCR产物分析。

服务内容
（1）DNA提取及浓度测定
（2）探针合成
（3）Southern Blot实验
客户提供
（1）组织、细胞样品或DNA
（2）制备探针用的模板DNA或提供探针序列
我们提供
（1）Southern Blot X光片
（2）实验结果扫描图
（3）实验结果分析和统计
（4）完整的实验报告单。