Southern blot

影响杂交的因素
4）杂交液的离子强度
低盐浓度时杂交率较低,随着盐浓度增加,杂交率 增加(Na+的作用) 高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,当进行序 列不完全同源的杂交时,必须维持杂交液与洗膜液 中较高的盐浓度;
5）非特异性杂交反应：预杂交的作用
杂交前封闭膜上非特异性杂交位点,减少其对探针 的非特异吸附
实验步骤
七.洗膜
• 回收杂交液 (可重复使用), 将膜放在洗膜溶液I中, 室温洗3次,每次摇动5分钟。 • 再在洗膜溶液II中(60℃预热后直接倒进表面皿), 洗2次, 每次摇动15分钟。 • 将膜在缓冲液1中漂洗3分钟。 • 在缓冲液2中室温摇动封闭30分钟。 • 在抗体溶液中室温摇动，孵育30分钟。 • 用洗膜溶液III洗2次, 每次15分钟。 • 在缓冲液3中平衡3分钟。
5.酶切样品（1） 组 6.酶切样品（2） 二 7.基因组DNA10 mg
实验步骤
三.变性
• 将凝胶浸在5倍体积的胶变性液中, 慢慢摇 动20分钟。 • ddH2O洗2次。 • 在胶中和液中慢慢摇动15分钟。
实验步骤
四.转移 • 在搪瓷盘中加入300ml10×SSC，放上培养皿 和小玻璃板
实验步骤
实验步骤
• 用刀片在离滤纸周围约1-2 mm处，轻轻割断 保鲜膜，但不能割破滤纸。取走滤纸上的保 鲜膜
实验步骤
• 整齐地放上草纸，数张草纸一折二，草纸堆 要高出搪瓷盘边约10cm
实验步骤
• 在草纸上放上玻璃板, 压上约500g重的重物, 转移过夜
实验步骤
五.固定 • 将胶和尼龙膜一起翻过来,用铅笔深入加样 槽在尼龙膜上画上槽的位置 • 正面朝上放在紫外交联仪中，交联固定 • ddH2O稍加漂洗后空气中自然干燥
• 当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，是洗膜的终止点。 上述洗膜过程无论在哪一步达到终点，都必须停止洗膜。
实验步骤
八.检测
Fra Baidu bibliotek
• 将膜与新鲜配制的显色溶液一起在黑暗中温 育0.5-16小时。 • 当条带显色到合适的深度后, 或在膜背景变 深前, 用Tris-EDTA洗去底物液，干燥保存。
影响杂交的因素
Southern印迹杂交
southern blot
基本原理
• Southern杂交是利用标记的探针（probe） 与膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测靶 DNA片段中是否存在与探针同源的序列
• 杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用 的探针(序列已知)进行特异性的靶序列检 测
用途
• 检测样品中的DNA 及其含量 • 了解基因的状态 （是否有点突变、 扩增重排等）
实验步骤
六.杂交 • 将尼龙膜放入杂交管内, 加预杂交液,，取 经超声粉碎的鲑鱼精DNA（已溶解在水或TE 中）100℃加热变性5min，迅速加到杂交瓶 中，使其浓度达到100μ g/ml。60℃封闭6小 时。 • 倒出预杂交液,加杂交液,同样加入变性的鲑 鱼精DNA，将探针100℃加热5min，使其变性， 迅速加到杂交瓶中60℃杂交过夜。
1d
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杂交（靶DNA单链与DIG标记的c-myc探针之间以碱基互补的原 则进行杂交）
洗膜（洗去未与靶DNA结合的探针）
检测（杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色）
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实验步骤
一. 基因组DNA的限制性内切酶酶切
（1）HL60基因组DNA10μg 10×Buffer TANGO+ EcoR I（10 u / μl） 16 μl 2 μl 2 μl
• • • • • • •
一、基因组DNA的制备 二、基因组DNA的限制酶切 三、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳 四、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物 五、探针标记 六、杂交 七、洗膜与检测
试剂与器材
• 一、试剂 • 限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl，变性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl），中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）, 转移液20╳SSC（3M NaCl，0.3M柠檬酸 钠，PH7.0），标记探针， 2╳SSC，预杂交液和 杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）,0.5×洗 液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×缓冲洗液（0.1M马来 酸，0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）
• 二、器材 • 22cm×15cm瓷盘，尼龙膜或硝酸纤维素膜，滤纸， 吸水纸，紫外交联仪，摇床，X线胶片等
Southern blot 过程
基因组DNA经酶切成小片段（EcoR I或 Hind III） 电泳分开各片段（1％琼脂糖凝胶电泳） 变性（双链经碱变性解开成两条单链） 转膜及固定（DNA经毛细管作用转移到尼龙膜上，紫外交联固 定） 预杂交（减少标记探针的非特异性结合，小分子鲑精DNA为竞 争性封闭剂）
影响杂交的因素
6）杂交后的漂洗：盐浓度、温度、次数， 体积
漂洗从低严谨度→高严谨度
7）固相膜的选择
阳离子尼龙膜
预期结果
预期结果
The end,thank you!
实验流程图
基因重组 重组质粒提 与转化 取与鉴定 质粒大 量制备 探针 制备
Southern blot
细胞 培养
基因组 DNA制备 PCR
DNA浓度 测定
酶切
探针的制备
变性 随机引物
DNA聚合酶 I Klenow 片段 32P-dCTP (Dig-dUTP)， dNTPs
随机引物延伸法标记探针
基因组DNA Southern杂交
• 将3张长滤纸浸湿，逐张放在玻璃板上，用 移液管的滚动，赶走气泡
实验步骤
• 切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上， 赶走滤纸与胶之间的气泡
实验步骤
• 再将与胶大小相同的尼龙膜放在胶上，同 样不能有气泡，然后放上三张浸湿的滤纸， 赶走气泡
实验步骤
• 紧贴凝胶四周各放一张X光片
实验步骤
• 小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜 要紧贴滤纸，但不能让滤纸移动
总体积
（2）HL60基因组DNA10μg 10×Buffer R 。 Hind III（10 u / μl） 总体积
37℃保温1.5h
20 μl
16 μl 2 μl 2 μl 20 μl
实验步骤
二. 1％琼脂糖电泳
两组共用一块凝胶，共7个样品 1.基因组DNA10 mg 组 2.酶切样品（1） 一 3.酶切样品（2） 4.阳性对照（pSV-c-myc重组质粒经BamH I 酶切 后的8.5 kb线性片段，10pg/ml, 10ml)
1）待检核酸分子的浓度和长度
浓度越大,复性速度越快,敏感性↑; 分子越大,转膜越困难,敏感性↓; 转膜方法
2）探针的性质(标记效率、浓度，核酸性质)
对于单链探针,浓度越高,杂交率增加; 探针标记方法和检测方法的选择
3）杂交液体积、温度和杂交时间
体积越小,杂交动力学越高; DNA/DNA杂交适宜的复性温度为比Tm低20～25℃; 温度↓非特异性↑; 温度↑敏感性↓