第四章 外植体的选择、消毒和接种

3.易漂浮或细小的材料，可装 入纱布袋内冲洗。 4.洗衣粉、吐温可除去轻度附 着在植物表面的污物，除去脂 质性的物质。
接种材料预处理:
(1)接种材料预培养 (2)就地套袋 (3)接种材料修整 (4)冲洗
接种前准备:
1
2
3
456外植体 Nhomakorabea毒:外植体剪切:
1.叶片0.5cm×0.5cm 2.微茎尖0.2-0.5mm 3.带节茎段0.5-1.0cm 4.芽丛分离
六、外植体的褐变及其防止措施
褐变
• 褐变是指外植体在培养过程中体内的多 酚氧化酶被激后活，使细胞内的酚类物质 氧化成棕褐色醌类物质，这种致死性的褐 化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐 色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影 响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐 而死亡的现象
影响褐变的因素
• 植物种类：一般木本植物，单宁、色素含量 高的植物易发生褐变 。
(6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和 咳嗽等；
(7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。 若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。
接种前外植体消毒顺序:
第三节 培养条件
在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条 件，培养基组成、ＰＨ值、渗透压等各种化学环境条件 都会影响组培苗的生长和发育。
污染的原因及其预防措施
1、污染：植物组织培养 过程中培养基和培养材 料滋生杂菌，导致培养 失败的现象
2、污染的原因 • 一是病原菌污染（细菌、
真菌） • 二是外植体、培养基、
培养器皿带菌 • 三是操作人员未遵守操
作规程。
真菌污染
污染的预防措施
组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽 视的技术环节。预防措施有： • 防止材料带菌------选择取材时间、材料与培养、 外植体灭菌等措施； • 防止用具带菌------器皿与金属器械灭菌； • 操作室要处于无菌状态------工作室、培养室灭菌 等； • 操作人员要按照操作程序进行。 • 在培养基中加入抗菌素 • 分散接种
一、温度
温度是组织培养过程中的重要因素。 组织培养在最适温 度下生长分化表现良好， 大多数组织培养都是在23～27℃之 间进行，很多研究者采用了25±２℃的恒温条件。低于15℃ 时培养，组织会表现生长停止，高于35℃时对生长不利。
不同植物培养的适温不同。百合的最适温度是20℃、月 季是25～27℃、番茄是28℃。 温度不仅影响组培苗的生长速 度， 也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽 的形成28℃为最好， 在12℃以下，33℃以上形成率皆最低。
3．光周期 试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，
最常用的周期是16小时的光照， ８小时的黑暗，研究表明， 对短日照敏感的品种的器官组织， 在短日照下易分化，而在 长日照下产生愈伤组织，有时需要暗培养， 尤其是一些植物
的愈伤组织在暗下比在光下更好。如红花、乌桕树的愈伤组 织。
三、湿度
湿度的影响包括培养容器和环境的湿度条件。
第四，取材季节合理；
对于大多数植物而言，应在其生长的季节开始采 样。在生长末期或已进入休眠期时取样，外植体可能 对诱导反应迟钝或无反应，较难成活。
第五，考虑器官的生理状态和发育年龄；
一般认为，沿着植物的主轴，越 向上的部分所形成的器官的生长时间 越短，其生理年龄也相应越老，越接 近发育上的成熟，越易形成花器官。 反之，越向基部，其生理年龄越小。
容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。 前者 又受琼脂含量的影响。在冬季应适当减少琼脂用量， 否则， 将使培养基干硬，不利于外植体接触或插进培养基， 导致生 长发育受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，封闭度较高 的封口材料易引起通透性受阻，也导致生长发育受影响。
环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发， 一般要求 ７０～８０％的相对湿度， 常用加湿器或经常洒水的方法来 调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基 各种成分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的 正常进行；湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。
不同培养目标采用的培养温度也不同，百合鳞片在30℃ 下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率都比在25℃下的高。 桃 胚在2～5℃条件进行一定时间的低温处理， 有利于提高胚培 养成活率。用35℃处理草莓的茎尖分生组织3～5天，可得到 无病毒苗。
二、光照
组织培养中光照也是重要的条件之一。
1．光照强度 从目前的研究情况看，光照强度对外植体、 细胞的最初分裂增殖和器官的分化有重要影响。 一般来说， 光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容 易徒长。 2．光质 光质对愈伤组织诱导、培养组织的增殖以及器 官的分化都有明显的影响。 如百合珠芽在红光下培养，８ 周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下， 几周后才出现愈伤 组织，而唐菖蒲子球块接种15天后，在蓝光下培养首先出 现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。
接种操作:
横插法与竖插法:
接种室要严格消毒
接种时有一个敞口的过程，是极易引起污染的时期，主要 由空气中的细菌和工作人员本身引起，因此，接种室要严格进 行空间消毒。接种室内保持定期用1％~3％的高锰酸钾溶液对 设备、墙壁、地板等进行擦洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭 菌外，还可在使用期间用70％的酒精或3％的来苏儿喷雾，使 空气中灰尘颗粒沉降下来。
• 基因型： • 外植体的生理状态：一般幼龄材料，幼嫩器
官和组织，春季取外植体，褐变发生较轻 。 • 培养基的成分：培养基中6－BA或KT能促进褐
变发生，而生长素类如IAA可减轻褐变发生。 • 材料转移时间：
褐变的防止措施
• 选择适宜的外植体及最佳培养基：适当 降低培养基无机盐浓度，降低PH值，降 低细胞分裂素水平等，可显著减轻培养 物褐变
玻璃化现象的预防措施
• 适当控制培养基中无机盐浓度 • 适当控制培养基中蔗糖和琼脂浓度 • 适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度 • 增加自然光照，控制光照时间 • 控制好温度 • 改善培养皿的气体交换状况 • 在培养基中添加其他物质
培养阶段易出现的其他问题
白花苗
文献资料:
1.苹果无融合生殖矮生砧木的组织培养 2.矮牵牛花药培养及植株再生研究 3.水稻花药组织培养中绿苗率的提高 4.分蘖洋葱的组织培养与快速繁殖 5.半夏组织培养快繁技术研究 6.月季的茎段培养与快繁 7.樱桃番茄的组织培养与快速繁殖 8.哈密瓜组织培养和离体快繁 9.羽扇豆的组织培养 10.花烛的组织培养与快速繁殖 11.柿树的叶片培养和快速繁殖 12.菊苣花瓣的组织培养
假设污染率为95%： 100块材料，接种于100支试管，即1块/支。
得率为：P=（1-95%）100=5块无菌材料 ❖ 200块材料，接种于100支试管，即2块/支。
P1（2污）=95% 95%=90.25% P2（1污1得或1得1污）=2 95%5%=9.5% P3（2得）=5% 5%=0.25% 若得到1支试管的无菌材料，至少要接种： 1/0.25%=400支，即接种800块材料，能得2块无菌 材料。 若按3块/支接种，需做8000支试管培养基，接入2.4万 块材料，才能有1支试管的（得3块）无菌材料。
pＨ值大小调整可用０.１Ｍ的ＮaＯＨ和０.１Ｍ的ＨＣl 来调整。１ml的ＮaＯＨ可使pＨ值升高０.２单位，１ml的 HCL可使值降低０.２单位。调节时一定要充分搅拌均匀。
六、气体
氧气是组织培养中必需的因素。 瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材 料。 通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥， 夏季易引起污染。固体培养基可加进活性炭来增加通气度,以 利于发根。 培养室要经常换气，改善室内的通气状况。 液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要 考虑容器的类型、培养基等。
无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培 养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质 或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定 的代表性，以提高成功的几率，增加其实用价值。
第二，选择健壮的植株；
组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株 上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代 谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功。此现象可能 是由于外植体内部的植物激素水平能够在接种后得以维持 所致。
无菌操作可按以下步骤进行：
(1)在接种4h前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外灯进行灭菌； (2)在接种前20min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯； (3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿托鞋等； (4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后擦拭 工作台面；
(5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过 火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；
第三，选择合适的部位；
植物组织培养几乎在植物体的各个部位都获得了成功， 这些部位包括：茎尖、茎段、皮层及维管组织、髓细胞、表 皮、块茎的储藏薄壁细胞、花瓣、根、茎、子叶、鳞茎、胚 珠和花药等。
但是不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条 件反应是不一致的，有的部位诱导分化率高，有的部位很难 脱分化，或者在分化频率很低。
第二节 外植体的消毒、接种
从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地 带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便 会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的 表面灭菌处理。
已消毒的外植体经无菌操作，接到培养基上， 这一过程叫做接种。
外植体接种的一般步骤：
外植体的修剪 流水冲洗 浸润灭菌 接种
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第四章 外植体的选择、消毒和接种