荧光寿命成像技术FLIM
flim 荧光寿命用途
flim 荧光寿命用途荧光寿命是描述荧光物质在受激发后持续发光的时间长度。
荧光寿命是荧光物质的重要特性之一，具有广泛的应用领域。
荧光寿命在生物医学领域得到了广泛应用。
荧光染料被广泛用于生物标记和细胞成像，荧光寿命的长短可以用于研究生物分子的动态过程。
例如，研究人员可以利用荧光寿命来观察细胞内某些分子的运动和交互作用，以及细胞内化学反应的动态过程。
荧光寿命的应用可以帮助科学家更好地理解生命活动的本质。
荧光寿命还可用于材料科学和化学分析领域。
许多材料具有荧光特性，荧光寿命可以用来表征材料的性能。
材料科学家可以通过测量荧光寿命来研究材料的光物理性质、电子结构和能量转移过程。
此外，荧光寿命还可以用于化学分析领域，如荧光光谱分析和荧光共振能量转移等。
荧光寿命的测量可以提供样品的定量和定性信息，对于溶液浓度的测量和化学反应的动力学研究具有重要意义。
荧光寿命在环境监测和食品安全领域也具有重要应用。
例如，荧光染料可以被用作环境中污染物的探针，通过测量荧光寿命可以快速、准确地检测和监测环境中的有害物质。
此外，荧光寿命还可以用于食品安全领域，如检测食品中的农药残留和重金属污染等。
荧光寿命的应用可以提高环境监测和食品安全检测的效率和准确性。
荧光寿命还在药物研发和新能源领域得到了应用。
在药物研发过程中，荧光寿命可以用于研究药物的代谢过程、药物分子的靶向和药物释放的动态过程，为新药的研制提供重要参考。
在新能源领域，荧光寿命可以用来研究太阳能电池和光催化材料等的性能，为新能源技术的开发和应用提供支持。
荧光寿命具有广泛的应用领域，包括生物医学、材料科学、化学分析、环境监测、食品安全、药物研发和新能源等。
荧光寿命的应用可以帮助科学家更好地理解生命活动、研究材料性能、监测环境污染、确保食品安全、开发新药和推动新能源技术的发展。
随着技术的进步和应用的不断拓展，荧光寿命的研究和应用将在更多领域发挥重要作用。
荧光寿命显微成像技术
荧光寿命显微成像技术荧光寿命显微成像技术（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy，简称FLIM）是一种非侵入性的生物成像技术，通过测量物质荧光的寿命来获得关于分子结构、环境和相互作用的信息。
荧光寿命是指荧光分子从激发态退激到基态所需的时间，它受到环境因素和分子相互作用的影响，因此可以作为特征参数用于研究生物分子的动力学过程。
荧光寿命显微成像技术与传统的荧光显微镜相比，具有许多优势。
首先，荧光寿命不受荧光强度的影响，因此可以准确地测量弱荧光信号。
其次，荧光寿命可以提供关于分子的额外信息，例如分子的构象、聚集状态和与其他分子的相互作用等。
此外，荧光寿命显微成像技术还可以通过使用不同的荧光探针来标记不同的分子，实现多重标记和多通道成像，从而提高研究的信息量。
荧光寿命显微成像技术的原理是基于荧光分子的激发态寿命和退激过程。
当荧光分子受到激发光的照射时，部分荧光分子会被激发到激发态，然后在一定的时间内退激到基态并发射荧光。
荧光寿命的测量可以通过激光脉冲的时间分辨，或者使用连续激发光和时间分辨单光子计数器来实现。
通过对样品进行扫描，可以获得每个像素点的荧光寿命信息，从而构建出样品的寿命图像。
荧光寿命显微成像技术在生物医学研究中有广泛的应用。
例如，在细胞生物学研究中，荧光寿命显微成像技术可以用于研究细胞内分子的动力学过程，如钙离子的浓度变化、离子通道的活性调控等。
在分子生物学研究中，荧光寿命显微成像技术可以用于研究蛋白质的结构和功能，如蛋白质的折叠和聚集状态。
此外，荧光寿命显微成像技术还可以应用于药物筛选、细胞分化、肿瘤诊断和治疗等领域。
荧光寿命显微成像技术的发展还面临一些挑战和局限性。
首先，荧光寿命的测量需要高时间分辨率，因此需要使用高速激光和高灵敏度的探测器，这增加了设备的复杂性和成本。
其次，在实际应用中，荧光分子的寿命受到许多因素的影响，如温度、pH值、离子浓度等，因此需要对这些因素进行校正和控制。
荧光寿命成像及其在生物医学中的应用
荧光寿命成像及其在生物医学中的应用一、本文概述荧光寿命成像（Fluorescence Lifetime Imaging, FLIM）是一种基于荧光探测技术的先进成像手段，它通过测量荧光分子激发态寿命的分布来获取样本的微观信息。
本文将对荧光寿命成像技术的基本原理、发展历程、以及其在生物医学领域中的应用进行详细的阐述和讨论。
我们将介绍荧光寿命成像的基本原理和技术特点，包括荧光寿命的定义、影响因素以及测量方法等。
然后，我们将回顾荧光寿命成像技术的发展历程，探讨其从实验室研究到临床应用的发展路径。
接着，我们将重点介绍荧光寿命成像在生物医学领域中的应用，包括疾病诊断、药物研发、生物标记、以及细胞和组织功能研究等方面。
我们将讨论荧光寿命成像技术的未来发展趋势和挑战，展望其在生物医学领域中的广阔应用前景。
二、荧光寿命成像技术原理荧光寿命成像（FLIM）是一种利用荧光分子的寿命信息进行成像的技术。
与传统的强度成像不同，FLIM关注的是荧光分子从激发态返回到基态所花费的时间，即荧光寿命。
荧光寿命的长短取决于荧光分子的种类、环境以及与之相互作用的生物分子等因素。
因此，通过测量荧光寿命，我们可以获取关于荧光分子及其周围环境的详细信息。
荧光寿命成像的基本原理是利用时间分辨的荧光检测设备来记录荧光分子发出的光子到达探测器的时间。
这个时间信息可以通过时间相关单光子计数（TCSPC）技术来精确测量。
在TCSPC技术中，每个检测到的光子都会触发一个计时器，计时器在光子被检测到的瞬间开始计数，直到下一个光子被检测到为止。
通过统计大量光子的到达时间，可以构建出一个荧光寿命分布图，从而得到荧光寿命的定量信息。
荧光寿命成像技术具有较高的灵敏度和特异性，可以在复杂的生物样本中实现高分辨率的成像。
由于荧光寿命成像对荧光分子的浓度和背景光的干扰不敏感，因此可以在低信噪比的情况下依然获得可靠的成像结果。
这些优点使得荧光寿命成像在生物医学领域具有广泛的应用前景。
单光子雪崩二极管(SPAD)在荧光寿命成像(FLIM)中的应用
两种单光子雪崩二极管(SPAD)在荧光寿命成像(FLIM)中的应用荧光寿命成像(FLIM)在普通强度成像的基础上增加了一个时间维度，可以观察荧光衰减特性以及空间差别。
FLIM可以分辨染色荧光蛋白（比如GFP与YFP）与自体荧光，并且不受荧光强度变化的影响。
可以通过探测局部状况（诸如水浓度、pH值）来确定离子浓度（比如Ca2+），分辨DNA与RNA。
记录必要的时间相关的数据可以选择时间相关单光子计数（TCSPC）技术，该技术灵敏度高达单分子水平，可以探测皮秒时间精度。
TCSPC只是与FLIM匹配的选择之一。
可以结合单光子雪崩二极管(SPAD)与短脉冲激光器获得高灵敏度与高时间分辨率。
FLIM的时间分辨性能通常用仪器响应函数（IRF）表示，IRF依赖于激光脉冲宽度、光子计数探测器的时间分辨率以及TCSPC的时间分辨率。
其中最主要的是探测器，半导体激光器脉冲宽度可达100ps以下，TCSPC比如PicoHarp 300的时间分辨率小于12ps rms。
美国Perkin Elmer 的SPCM-AQR型SPAD时间分辨率大于300ps，大大高于好的光电倍增管的时间分辨率，并且探测器脉冲的瞬时位置依赖于探测光子的总数（计数率），这对于FLIM测量很成问题。
现在意大利MPD公司的新一代PDM系列SPAD探测器克服了这个问题，其时间响应特性可与微通道板MCP相媲美，其IRF几乎与计数率无关，因此非常适合FLIM测量。
以下是雏菊花粉颗粒FLIM自体荧光成像的一个例子，皮秒半导体激光器发出的波长为532nm的激光束激发样品后，产生的荧光通过540~610nm的带通滤光片进行探测。
使用时间分辨共焦荧光显微镜MicroTime 200进行测量，可以在单分子水平上进行荧光蛋白浓度的FLIM测量。
使用两个不同的SPAD探测器通道：MPD的探测直径范围为50um的PDM 50型SPAD以及Perkin Elmer 的探测直径范围为180um的SPCM-AQR-14型SPAD。
荧光寿命成像技术FLIM
生物光子学大作业作业名称：荧光寿命成像技术FLIM 姓名：曾扬舰学号：完成日期：2016.6.28荧光寿命成像技术FLIM摘要：荧光寿命显微成像技术（FLIM）技术是一种新颖的荧光成像技术，具有其他荧光成像技术无法代替的优异性能，是生物医学工程领域的研究热点。
频域调制、门控探测和时间相关单光子计数是FLIM的几种主要实现方法。
综述了这些计数的原理、研究现状和已取得的部分成果，比较了这三种方法的时间分辨率和成像速度等参数的优劣。
宽场FLIM更适用于延时成像和实时成像。
荧光偏振各向异性成像和内窥镜FLIM技术都是FLIM技术很有前景的应用方向。
Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy(FLIM)Why lifetime Imaging?The fluorescence lifetime is the signature of a fluorescent material ;It is the exponential decay in emission after the excitation of a fluorescent material has been stopped. FLIM is a technique to map the spatial distribution of lifetimes within microscopic images and it allows measurements in living cells as well as in fixed.Because of the fact that some phenomena do affect fluorescence lifetimes, the lifetime is used to detect these phenomena leading to various applications such as; lon imaging ,oxygen imaging, probing microenvironment, and medical dlagnosis.Frequency domain methodThe homodyne frequency domain FLIM method requires amodulated light source and a modulated detector.In the LIFE system these are the LED and the intensified CCD camere. Both are modulated at exactly the same frequency,but with an adjustable diffrence in phase.These two parameters depend on the fluorescence lifetime of the sample and the modulation frequency and are measured to calculate the flurescence lifetime in each pixel of the image.1、基本概念荧光是分子吸收能量后使得其基态电子被激发到单线激发态后由第一单线激发态回到基态时所发生的辐射复合发出的光。
荧光寿命数据的相量分析及其应用
荧光寿命数据的相量分析及其应用*林丹樱† 牛敬敬 刘雄波 张潇 张娇 于斌 屈军乐‡(深圳大学物理与光电工程学院, 光电子器件与系统教育部/广东省重点实验室, 深圳 518060)(2020 年4 月15日收到; 2020 年5 月14日收到修改稿)荧光寿命显微成像技术(fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM)具有特异性强、灵敏度高、可定量测量等优点, 被广泛应用于生物医学、材料学等领域的研究. 为使FLIM技术更好地适用于高通量数据的快速分析, 近年来涌现出多种荧光寿命分析的新算法. 其中, 相量分析法(phasor analysis, PA)通过将时间域的拟合转化为频率域的直接计算来获得荧光寿命值, 与传统的最小二乘拟合法相比, 不仅更加简便快速,适用于低光子数情形, 而且便于使数据内容可视化和对数据进行聚类分析, 因此越来越受到科研人员的青睐.本文详细阐述了相量分析法的基本原理及运用方法, 并在此基础上介绍了该方法在细胞代谢状态测量、蛋白质相互作用研究、细胞微环境测量, 以及辅助病理诊断和提高超分辨成像分辨率等方面的应用, 着重讨论了PA法在这些FLIM应用实例中的优势所在, 为相关领域的研究提供有益的参考. 最后, 对荧光寿命数据的相量分析及其应用的发展方向进行展望.关键词：荧光寿命显微成像, 数据分析, 相量分析法, 生物医学应用PACS：87.64.–t, 87.64.M–, 87.64.kv, 87.85.Pq DOI: 10.7498/aps.69.202005541 引 言随着荧光标记技术的快速发展, 荧光显微成像技术已成为生物医学研究领域不可或缺的工具之一. 荧光寿命作为荧光的一个重要参量, 反映了荧光分子从激发态回到基态的退激发速率, 是荧光分子的固有特性, 其变化能非常灵敏地反映荧光分子所处微环境(如细胞微环境中的温度、黏度、pH值、离子浓度等)的变化情况[1]. 同时由于荧光寿命的测量可不受荧光探针浓度、激发光强度、光漂白等因素的影响, 相比强度测量更有利于实现定量化, 因此探测样品中荧光寿命的分布和变化的荧光寿命显微成像技术(fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM)常常被应用于定量测量细胞内的一些生物物理和生物化学参数[2,3], 或气溶胶的黏度测量等[4]. 另一方面, 许多荧光团分子具有相似的荧光光谱, 假如利用它们对样品中不同的结构进行特异性标记, 直接从光谱上很难分离, 但利用它们荧光寿命不同的特点, 可借助FLIM技术对其荧光进行区分, 从而实现多结构的同时标记和成像. 这些特点使得FLIM在生命科学研究中有着越来越广泛的应用.一般而言, FLIM中荧光寿命的测量方法有时域法与频域法两类, 其中频域法使用周期调制的连续光激发样品, 检测荧光信号相对激发光的振幅和相位变化来计算样品的荧光寿命; 时域法采用高重复频率的飞秒脉冲激光激发样品, 利用门控技术、* 国家重点研发计划(批准号: 2017YFA0700500)、国家自然科学基金(批准号: 61775144, 61975131, 61620106016, 61525503, 61835009)、广东省高等学校科技创新(重点)项目(批准号: 2016KCXTD007)、广东省自然科学基金(批准号: 2018A030313362)和深圳市基础研究项目(批准号: JCYJ20170818144012025, JCYJ20170818141701667, JCYJ20170412105003520)资助的课题.† 通信作者. E-mail: dylin@‡ 通信作者. E-mail: jlqu@© 2020 中国物理学会 Chinese Physical Society 扫描相机技术、时间相关单光子计数(time-correlated single photon counting, TCSPC)技术等记录脉冲过后荧光信号的衰减过程并拟合或计算荧光寿命. 因此, 不管对于哪种类型的FLIM, 荧光寿命数据的处理都是非常关键的一环. 例如, 时域法荧光寿命数据最常用的处理方法是非线性最小二乘(nonlinear least-squares, NL-LS)拟合法,即选择一种衰减模型(单指数、双指数或多指数衰减)对每个像素点的测量数据进行曲线拟合, 然后分析出各衰减组分的荧光寿命值. 但是这种方法要求衰减模型的选择要合适, 同时要求每个像素点要采集足够多的光子数(通常 >1000)才能够进行有效拟合[5]. 这就使得基于这种数据处理方法的FLIM技术在应用上受到了相应的限制. 例如, TCSPC-FLIM通常需要在激发光较弱的情况下进行成像, 以避免相邻两个脉冲之间检测到的光子数多于1而导致的光子堆积问题, 因此要求每个像素点采集足够多的光子数就需要延长采集时间, 由此带来的问题就是获得一幅荧光寿命图像的时间相对较长, 成像速度受限, 无法应用于一些荧光寿命变化速度较快的场合.因此, 针对这些问题, 研究者们开发出了其他的算法, 例如相量分析(phasor analysis, PA)[6]、极大似然估计(maximum likelihood estimate, MLE)[7]、一阶矩(the first moment, M1)[8]、贝叶斯分析(Bayesian analysis, BA)[9]、压缩感知(compressed sensing, CS)[10]等, 这些方法可通过降低寿命分析对光子数的要求从而间接地提高FLIM技术的成像速度[11]. 其中, PA法通过将时域信息变换到频域, 可直接计算得到荧光寿命值,简单快速, 无需拟合, 且在低光子数情况下也能得到比较准确的寿命值, 适合于快速FLIM成像. 另一方面, PA法生成的相量图能将具有相似荧光衰减特性的荧光团分子所对应的像素点显示在相邻区域, 形成一定的簇状分布, 这种特点使得利用该方法可以更方便地对数据进行可视化和聚类分析,因此结合PA法的FLIM技术(phasor-FLIM)越来越受到科研人员的青睐, 在生命科学和生物医学研究中应用越来越广泛.本文首先详细阐述phasor-FLIM的基本原理及使用方法, 并在此基础上介绍该技术应用于细胞代谢状态测量、蛋白质相互作用研究、细胞微环境测量以及辅助病理诊断和提高超分辨成像分辨率等方面的最新研究进展, 最后对其发展前景进行展望.2 Phasor-FLIM的基本原理如前所述, FLIM技术中荧光寿命的测量通常分为频域法和时域法[1,6]. 这两种方法在数学意义上互为傅里叶变换, 但它们获取荧光寿命信息的方式不同, 得到的数据内容和形式不同, 从而数据处理方法一般也不同. 频域法一般使用正弦调制的连续光激发样品, 测量得到的是具有相同频率的荧光信号, 但由于荧光寿命的影响, 荧光信号的振幅和相位相比激发光均发生了变化, 因此通过计算荧光信号相对激发光的振幅调制度变化和相位延迟可计算得到荧光寿命. 而时域法则需要采用高重复频率的飞秒脉冲激光激发样品, 利用前面提到的门控技术、扫描相机或TCSPC技术等直接或间接记录脉冲过后的荧光衰减过程, 得到的是荧光强度(或光子数)随时间的变化关系, 因此一般可通过曲线拟合得到荧光寿命.PA法最先被用于处理频域FLIM技术得到的荧光寿命数据, 其相量由频域FLIM测量得到的解调系数和相位延迟来构建, 是原始数据的直接表达[12]. PA法同样适用于时域FLIM数据的分析,但需要先将时域的荧光衰减变换到频域. 由于时域FLIM中的TCSPC-FLIM目前应用最为广泛,因此PA法在该技术中的应用也是报道得最多的.以下分别介绍这两类技术中PA法分析荧光寿命的基本原理, 并结合荧光相量图的特点阐述其典型的应用思路.2.1 频域法FLIM及其相量分析在频域FLIM中, 激发光常采用正弦调制的连续光源, 如激光、氙灯、LED灯等, 激发光强可描述为其中E(0)和E(t)分别为起始时刻和t时刻的激发光强度, M E = a/A为激发光的强度调制度(a和A分别是激发光的振幅和平均强度, 如图1(a)所示), w为调制的角频率. 利用该激发光激发标记有荧光团的样品后, 所检测到的荧光也是正弦调制的, 且其频率与激发光相同, 但强度调制度会降低,相位也有一定延迟. 如果荧光衰减符合单指数衰减规律, 则荧光光强可描述为相应地, I (0)和I (t )分别为起始时刻和t 时刻的荧光强度, M F = b /B 为荧光的强度调制度(b 和B 分别是荧光的振幅和平均强度, 如图1(a)所示), f 为相位延迟或相移. 通过测量相移f 和解调系数M = MF /M E , 即可计算出相应的荧光寿命, 即:可以证明[12,13], 当荧光的衰减过程符合单指数衰减规律(即I (t ) = I (0)e –t /t , t 为寿命)时, (3)式和(4)式算得的寿命t f 和t m 是相等的, 理论上只需要计算其中一个即可. 但假如荧光的衰减过程是两个或多个单指数衰减过程的组合(即双指数衰减或多指数衰减), 则情况更加复杂, 通常需要先在不同调制频率w i 下重复测量多组f i 和M i , 并通过以下公式先计算出等效相移和解调系数再求解寿命, 即:其中f i 为第i 个调制频率测得的光强占总光强的比例.1984年, Jameson 等[13]利用相量的概念对频域法FLIM 得到的数据进行几何表示, 他们利用单个像素点对应的解调系数M 和相移f 来构建一个相量, 即以M 作为该相量的模, 以f 作为该相量的辐角, 则可以认为相量与像素点是一一对应的, 相量图上一个相量的端点就代表了一个像素点的全部荧光寿命信息(如图1(b)所示). 该相量在实轴和虚轴的分量可用Weber 符号表示[14], 即:对于单指数衰减情形, 由(3)式和(4)式可得到cos f = M , 因此可以得到:即以坐标(G , S )表示的相量端点被约束在圆心位于(0.5, 0)处、半径为0.5的半圆上. 半圆上的每个点表示不同的寿命, 寿命值从左到右递减, 其中(1, 0)表示接近零的寿命, (0, 0)表示无限长的寿命, 如图1(b)所示.I (t )=I (0)∑jαj e −t /τj 而如果一个像素点处的荧光衰减过程为多个单指数衰减过程的叠加(即 ,其中t j 表示第j 个单指数衰减组分的寿命, a j 表示该组分的占比), 则根据衰减组分间的线性叠加性质, 其在相量图上对应的相量端点应位于半圆以内[15], 即多指数衰减过程对应的G 和S 应为:1C o u n t s Arrival time(b)(a)(d)(c)图 1 荧光寿命的测量方法及相量分析(PA)法示意图 (a)频域法测量原理示意图; (b)单指数衰减的寿命相量示例图; (c)双指数衰减的寿命相量示例图; (d)时间相关单光子计数(TCSPC)测量原理示意图Fig. 1. Schematic diagram of fluorescence lifetime measurement and phasor analysis (PA): (a) Frequency domain method; (b) life-time phasor of single-exponential decay; (c) lifetime phasor of bi-exponential decay; (d) time-correlated single photon counting (TC-SPC) method.几何意义上, 多指数衰减过程对应的相量端点应位于其各个单指数衰减组分对应的寿命相量端点连接组成的集合内. 如图1(c)中, 双指数衰减过程对应的寿命相量端点(蓝色)落在半圆以内, 位于两个单指数衰减组分对应的寿命相量端点(绿色)的连线上, 且与两端点的距离(p 1, p 2)由两个组分的占比(a 1, a 2)决定.2.2 时域法FLIM 及其相量分析PA 法同样适用于时域法FLIM 数据的分析.这里以目前应用最广泛的TCSPC-FLIM 技术为例. 如图1(d)所示, TCSPC 将每一次脉冲信号作为一个信号周期, 每个周期内当探测到第一个荧光光子时就在其到达时间对应的时间通道中进行计数, 经过多次累积即可建立一个反映荧光衰减过程的光子数-时间分布直方图, 用于求解荧光寿命.2008年, Digman 等[16]将Weber [14]于1981年提出的荧光脉冲响应的傅里叶分析方法用于TCSPC 技术, 并使用以下关系式计算相量端点坐标, 也可以将每个像素的全部荧光衰减信息转换为相量图上的单个点, 即:其中G (w )和S (w )分别是荧光脉冲响应傅里叶频谱的实部和虚部, 这里用作寿命相量的两个分量;I (t )是脉冲过后t 时刻的荧光光强, w 是脉冲激光的角频率, T 是周期长度(实际可取动态范围),n 是谐波的阶次, 一般情况下取基频分量, 即n =1. 因为TCSPC 是在N 个离散的时间通道t k 中记录荧光衰减分布直方图的, 因此上述积分运算可转化为求和计算:其中C k 是第k 个时间通道记录的光子数,I =∑Nk=1C k 是所有时间通道记录的总光子数.如果荧光脉冲响应呈单指数衰减规律, 则代入(11)式可得G (w )和S (w )与荧光寿命t 的关系为:可以验证, G , S 仍然满足(8)式的关系, 即单指数衰减情形下以坐标(G , S )表示的相量端点仍被约束在圆心位于(0.5, 0)处、半径为0.5的半圆上, 与频域法得到的相量图一致.而如果荧光脉冲响应是呈多指数衰减的, 则同样根据线性叠加关系可知, 坐标(G , S )表示的相量端点也位于半圆以内, 其中双指数衰减过程对应的相量端点也在其两个单指数衰减组分对应的相量端点连线上, 与频域法得到的结论一致.2.3 相量图的特点及其典型应用思路如前所述, 对于满足单指数衰减规律的情形,荧光寿命相量图上以坐标(G , S )表示的相量端点被约束在圆心位于(0.5, 0)处、半径为0.5的半圆上, 而多指数衰减过程的相量端点则位于半圆以内, 具体地说, 是位于各单指数衰减组分相量端点连接组成的集合内. 例如, 对于双指数衰减情形,其寿命相量端点位于两个单指数衰减组分相量端点的连线上, 且位置与两个组分的占比有关. 相量图的这些特点, 使得其在荧光寿命数据的定量分析、可视化和聚类分析方面有很大优势.如前所述, 荧光寿命反映的是荧光分子从激发态回到基态的退激发速率, 因此当处于激发态的荧光分子所处的微环境不同, 或者荧光分子与其他分子发生相互作用和能量转移时, 荧光寿命会发生灵敏的变化. 所以, 许多荧光团存在两个甚至两个以上的衰减速率, 分别对应于荧光团的不同状态, 例如细胞内的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)处于自由态时(主要位于细胞质中)的荧光寿命为几百皮秒(t 1), 与蛋白质绑定后处于结合态时(主要位于线粒体中)的荧光寿命则达到几纳秒(t 2)[6].2005年Brid 等[17]利用干扰NADH/NAD+比例的代谢药物氰化钾(Potassium cyanide, KCN)阻断细胞的呼吸作用, 证明了细胞中自由态和结合态NADH 的占比与NADH / NAD+比例有关, 从而提出利用FLIM 测量自由态和结合态NADH 的比例, 来间接获得活细胞内的NADH/NAD+比例.NADH 与其氧化形式NAD+作为生物体内许多氧化还原反应的辅酶参与生命活动并相互转化, 它们之间的平衡反映了氧化磷酸化和糖酵解的比率, 因此NADH/NAD+比例及其变化可用于监测细胞代谢方式的变化. 对于细胞内NADH/NAD+比例的探测, 传统的方法有酶循环法、毛细管电泳法、质谱分析法等, 但这些方法只适用于对细胞提取物进行检测. 直接对细胞内NADH/NAD+比例进行探测也可以采用荧光强度成像的方法, 这是因为NADH 发荧光而NAD+不发荧光. 但由于荧光团浓度的不均一性以及自由态和结合态NADH 荧光量子产率的不同, 基于强度成像的NADH/NAD+测量结果通常存在较大误差. Brid 等[17]的工作为定量监测活细胞内NADH/NAD+的比例提供了一种新的思路, 即通过FLIM 定量测量自由态和结合态NADH 的比例来间接获得NADH/NAD+比例. 他们的研究还表明, 当NADH/NAD+比例发生变化时, 自由态和结合态NADH 的荧光寿命值(即t 1和t 2)几乎保持恒定, 变化的是它们各自的占比(即a 1和a 2). 多指数衰减情形的寿命相量与其各个单指数衰减组分寿命相量之间的线性关系,使得采用了PA 法分析荧光寿命的phasor-FLIM 特别适合于在已知单指数衰减组分寿命的前提下, 对多组分尤其是双组分中不同组分的占比进行定量分析. 所以, phasor-FLIM 的典型应用之一, 就是根据寿命相量端点的位置对NADH 两种寿命组分的占比进行定量分析, 从而用于细胞代谢状态的测量[18−27].此外, 在利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)对蛋白质相互作用进行研究的FLIM-FRET 实验, 以及一些利用FLIM 研究细胞微环境参量变化的场合, 也会涉及到双指数衰减甚至多指数衰减及其组分占比的变化, 因此phasor-FLIM 在这些应用中的报道近几年也多了起来[28−34].其次, PA 法生成的相量图中, 具有相似荧光衰减特征的像素点所对应的相量端点会显示在相近的位置, 因而形成一定的簇状分布(如图2(a)和图2(b)所示), 称为“相量簇”. 同一个相量簇对应于具有相似荧光衰减特性的多个像素点, 但这些像素点在样品中的分布可以是不连续的, 和它们的空间分布并没有直接联系. 利用该特点, 可在相量图上选取感兴趣的相量簇, 并通过其对应关系找到相量簇中各相量端点所对应的像素点在样品上的位置, 就可以方便地将样品中具有相似荧光寿命特征的区域标记出来(如图2(c)所示), 还可以进一步对这些荧光寿命特征相似的区域进行聚类分析, 从而为研究一些生物医学问题带来极大的便利[18−20].倘若对不同的相量簇对应的像素点赋以不同的伪彩色, 则利用该方法还可以方便地实现荧光寿命图像的多色显示(如图2(d)所示), 从而起到辅助病理判断等作用[35−37]. 最近, 这种利用PA 法对荧光寿命的分布进行聚类分析的方法还被应用于辅助提高基于受激辐射耗尽(stimulated emission depletion, STED)的超分辨成像的分辨率[38−40].综上, 目前phasor-FLIM 的应用可以用图3来表示. 以下将举例说明phasor-FLIM 的应用研究进展.Fluorescence intensity image Lifetime phasor plotPhasor -mapped FLIM image Phasor analysis(d)(c)图 2 Phasor-FLIM 的应用思路示意图 (a)包含未处理寿命信息的荧光强度图; (b)经PA 法分析得到的寿命相量图; (c)对寿命相量直接进行分析; (d)通过相量聚类分析和伪彩色标记得到的荧光寿命图Fig. 2. Schematic diagram of phasor-FLIM application:(a) Fluorescence intensity image with untreated lifetime in-formation; (b) lifetime phasor plot obtained by PA analysis;(c) direct analysis of lifetime phasors; (d) phasor-mapped FLIM image based on phasor clustering analysis and pseudo-color assignment.3 Phasor-FLIM的应用研究进展3.1 基于NADH的细胞代谢应用研究细胞的能量主要来自细胞呼吸, 正常细胞或正常分化的细胞在有氧条件下采用糖酵解进行代谢,缺氧条件下通过氧化磷酸化进行代谢. 而高度增殖的细胞(如癌细胞或干细胞)即使在氧气充足的条件下也多选择糖酵解作为主要的产能方式, 这种现象被称为“Warburg效应”[41]. 而这种细胞代谢方式的不同导致两者所含NADH的浓度和状态存在差异. 因此基于前面提到的NADH处于两种不同状态具有不同荧光寿命的特性, 以NADH作为内源荧光标志物的双光子FLIM成像常被用于研究正常细胞、干细胞、癌细胞以及其他疾病发生时细胞的代谢差异, 而结合了PA法的phasor-FLIM 可方便地实现活组织中单细胞代谢表型的观测, 在细胞分化和增殖、疾病的机理研究和诊断等方面均具有很好的应用前景, 目前也取得了一些重要的应用研究进展.细胞分化和增殖过程会改变糖酵解和氧化磷酸化之间的平衡, 所以代谢变化可用于研究细胞分化和增殖状态. Stringari等[18−20]通过对细胞内包括NADH在内的各种内源性荧光标志物进行FLIM成像, 并利用PA法对FLIM图像进行分割,可以区分胶原蛋白、视黄醇、视黄酸, 以及处于自由态和结合态的NADH. 他们对小肠进行双光子FLIM成像并对利用PA法得到的寿命相量簇进行聚类分析, 用来识别高度增殖的小肠干细胞, 通过代谢状态对小肠干细胞和分化的后代进行分类分析, 以监测与代谢变化相关的生理(病理)过程.Lee等[21]对白细胞和白血病细胞进行FLIM成像,因为白血病细胞快速增殖, 糖酵解占主导地位, 寿命相量簇向短寿命方向移动, 利用PA法定量分析自由态和结合态NADH比例的变化, 可从血液中快速筛选和分离白血病细胞. 与传统的生物分子诊断技术相比, 这种基于phasor-FLIM的单细胞筛查方法对细胞友好, 具有临床筛选血液细胞的潜力. 细胞外基质(extracellular matrix, ECM)是所有组织必不可少的动态组成部分, 并通过提供机械和生化信号来直接影响细胞行为. ECM的变化可以改变组织的动态平衡, 从而潜在地促进细胞转化和肿瘤的发生. Romero-Lopez等[22]将正常细胞接种在提取自正常人结肠和转移至肝脏的结肠肿瘤的ECM中, 利用phasor-FLIM技术定量分析了自由态和结合态NADH的比例, 结果发现接种在肿瘤ECM中的细胞比接种在正常ECM中的细胞具有更高的游离NADH水平, 糖酵解速率较高, 表明ECM在癌细胞及其相关脉管系统的生长中起到了重要作用.由于许多疾病的发病机制与细胞代谢也有着密切的关联, phasor-FLIM在疾病的机理研究及诊断方面也有不少应用实例. 例如, 亨廷顿病(Huntington’s disease, HD)是一种常染色体神经退行性疾病, 能量代谢障碍是HD的主要发病机制. Sameni等[23]使用phasor-FLIM来定量测量HD中自由态和结合态NADH的比例变化, 作为活细胞代谢变化的间接测量, 用以研究HD发病机制, 结果表明HD的代谢障碍为糖酵解增加, 导致氧化应激和细胞死亡. 这种定量分析的方法可用于筛选HD组织并进行潜在的药物筛选, 对诊断和治疗疾病具有重要意义. 阿兹海默症(Alzheimer’sPhasor-FLIMMetabolism FRET Microenvironment Pathology p-STED BoundNADH (OXPHOS)FreeNADH(Glycolysis)Low FRETHigh FRETDonorMeasuredAutofluoresencepH 7.8pH 5.4Structure 1SelectedAbandoned图 3 Phasor-FLIM 的应用分类示意图Fig. 3. Application classification diagram of phasor-FLIM.disease, AD)是一种老年人多发的神经退行性疾病, 与抗氧化保护降低和线粒体功能障碍有关.Dong 等[24,25]使用双光子激发FLIM 技术结合PA 法定量分析了老年小鼠海马区神经元游离NADH 的水平, 结果发现随着年龄的增加, 游离的NADH 浓度降低, 氧化磷酸化占据主导地位,AD 进一步恶化, 而还原性治疗可恢复老年小鼠及AD 小鼠神经元中游离NADH 的水平. Hato 等[26]则采用类似的方法对活体小鼠肾脏进行双光子FLIM 成像, 使用PA 法分析肾脏中的代谢变化,提供了一种研究肾脏疾病代谢的方法. Datta 等[27]通过双光子FLIM 对人诱导多能干细胞分化的心肌细胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, hiPS-CMs)进行成像, 检测缺氧和线粒体毒性药物氰化钾病理刺激下代谢状态的变化. 如图4所示, 缺氧状态下和用药物刺激时hiPS-CMs 的寿命相量分布向自由态NADH 的方向移动, 代谢方式转变为糖酵解. 这种非侵入性成像技术有助于研究心脏病的发病机理和治疗方法[27].3.2 基于FLIM-FRET 的蛋白互作研究当一个荧光分子(供体)的荧光发射光谱与另一个荧光分子(受体)的激发光谱相重叠, 且两者间的距离合适(一般为6—10 nm)时, 供体的激发能诱发受体发出荧光, 同时其自身的荧光强度发生衰减, 称为FRET 效应. 由于该效应发生的程度(即FRET 效率)与供体和受体的距离紧密相关,该效应常被用于研究蛋白质间的相互作用(简称“蛋白互作”). 具体的做法是将供体荧光分子和受体荧光分子分别标记于两个蛋白质分子上, 通过测量FRET 效率来反映两个蛋白质之间的距离, 从而反映其是否发生相互作用以及相互作用的程度.从荧光寿命的角度看, 当FRET 效应发生时, 由于供体将能量转移到受体上, 供体的荧光寿命将变短. 考虑到FLIM 测量不受光漂白等因素的影响,利用FLIM 进行FRET 效率的测量比测量荧光强度变化的方法要更加准确, 因此FLIM-FRET 已被广泛应用于蛋白互作的研究. 发生和不发生FRET(或者说FRET 效率很高和很低)两种状态下供体的寿命可认为是不变的, 相当于两个单指数衰减组分, 因此根据PA 法的分析, 两种状态下得到的寿命相量应位于半圆上. 而当部分供体发生FRET 时, 总体的荧光衰减满足双指数衰减规律,寿命相量端点将位于上述两个单组分寿命相量端点的连线上, 且到两端的距离与两种组分的占比有关, 由此可方便地计算出FERT 效率. 2012年和2013年, Hinde 等[28,29]利用phasor-FLIM 和FRET 监测了小G 蛋白与RBD 蛋白在溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)刺激下相互作用的变化, 结果表明, 在荧光强度图像看不出明显差异的情况下, FLIM 图像和PA 定量分析均显示小G 蛋白与RBD 蛋白的标签蛋白EPCF 和Critine 在LPA 刺激下FRET 效率显著增加(如图5所示). Lou 等[30]在共表达H2B-eGFP 和H2B-mCherryrry 两种荧光蛋白的Hela 细胞中利用phasor-FLIM 测得的FRET 效率对核小体的紧实度进行了量化, 用于定量反应DNA 的损伤情况.Cell 1Cell 2Cell 2Cell 1NADH FLIM map Fluorescence intensity U n t r e a t e d c e l l sT r e a t e d c e l l sABBound NADHFree NADHPhasor distribution1.00.5000.5 1.0AB LDH-bound NADHFree NADH in solution图 4 Phasor-FLIM 用于分析细胞在缺氧和线粒体毒性药物氰化钾刺激下NADH/NAD+比例的变化, 研究代谢状态的转变[27]Fig. 4. Phasor-FLIM was used to analyze the change of NADH/NAD+ ratio under the stimulation of hypoxia and mitochondrial toxic drug potassium cyanide, for studying the change of metabolic state of cells [27].。
生物光子学5-04
10
5.7 荧光共振能量转移成像技术
• FRET目前应用的几个热点：
– FRET技术及其应用向亚细胞及单分子观测水平发展 – 信号转导通道（网络）的亚细胞水平定位
– 生理事件过程中信号转导过程的细节、以及调控过程 的时空关系
– 利用FRET技术追踪在体水平生命过程
11
本章内容
5.1 光学成像 5.2 光学显微技术 5.3 荧光显微技术 5.4 激光扫描共聚焦显微技术 5.5 多光子激发荧光显微技术 5.6 全内反射荧光显微技术 5.7 荧光共振能量转移成像技术 5.8 荧光寿命成像显微技术 5.9 光学相干层析成像技术 5.10 非线性光学成像技术 5.11 生物光子学成像技术的发展趋势
5.8 荧光寿命成像显微技术
频域法测量荧光寿命原理图
I ω=2πƒ a b
M
调制频率f， ω=2πf
b/B a/ A
相位寿命：
(1/ ) * tan
调制寿命：
M (1/ ) * (1/ M 2 ) 1
A
B
Excitation Emission Time (ns)
p= phase of fluorescence
Philippe I. H. Bastiaens and Anthony Squire. trends in CELL BIOLOGY (Vol. 9) February 1999
m=modulation depth of fluorescence
5
5.7 荧光共振能量转移成像技术
CFP受光激发后便发射光； CFP离YFP的距离大于10nm； YFP没有受到激发，因此也不发射光。
CFP受光激发后但没有发射光； CFP与YFP的距离非常接近（1-10nm）； YFP没有受到激发，但发射光。
flimfret的原理及其生物学应用
Flimfret的原理及其生物学应用1. 引言Flimfret（Fluorescence lifetime imaging fret）是一种基于荧光寿命成像荧光共振能量转移（FRET）技术的新型生物成像方法。
本文将介绍Flimfret的原理和其在生物学研究中的应用。
2. Flimfret的原理Flimfret基于荧光共振能量转移（FRET）技术，其原理基于两个荧光蛋白质间的相互作用。
FRET是一种非辐射性能量转移现象，当接受体（acceptor）和给体（donor）之间距离较近时，给体的激发态能量可以通过非辐射性能量传递到接受体，从而导致接受体荧光增强。
Flimfret通过测量激发态荧光的寿命来确定荧光共振能量转移的发生率。
当FRET发生时，给体的激发态荧光寿命会缩短，而接受体的荧光寿命会延长。
因此，通过测量给体和接受体的激发态荧光寿命可以确定FRET发生的程度。
Flimfret主要利用荧光寿命成像技术来实现，可以高分辨率地观察细胞、组织和生物体内FRET的发生。
同时，在配合适当的荧光探针和显微镜系统时，可以提供更加详细的信息。
3. Flimfret在生物学研究中的应用Flimfret在生物学研究中有广泛的应用，下面将介绍几个典型的应用案例：3.1 蛋白质相互作用研究蛋白质相互作用在生物学中起着重要的作用，可以影响信号传导、基因调控等生物过程。
Flimfret可以利用FRET原理来研究蛋白质的相互作用，通过选择合适的荧光蛋白质做为给体和接受体，可以测量蛋白质相互作用的程度和速率。
3.2 离子和分子浓度检测Flimfret可以通过测量荧光寿命的变化来监测离子和分子的浓度变化。
通过选择适当的荧光探针和显微镜系统，可以实现对特定离子和分子的高灵敏度检测。
3.3 疾病诊断与治疗Flimfret在疾病诊断和治疗中也有潜在的应用。
例如，在癌症研究中，利用Flimfret可以观察肿瘤细胞中的蛋白质相互作用，从而了解癌症的发展机制，为癌症的早期诊断和治疗提供依据。
flim 荧光寿命用途
flim 荧光寿命用途荧光寿命是指荧光物质在受到激发后，从激发态返回基态所需的时间。
荧光寿命是一种重要的物理特性，具有广泛的应用价值。
本文将介绍荧光寿命的定义、测量方法和在不同领域的应用。
一、荧光寿命的定义和测量方法荧光寿命是荧光物质从激发态退激回基态所需要的时间，它是荧光物质的一个固有性质。
荧光寿命的测量通常使用荧光寿命仪进行，该仪器可以通过测量荧光物质的光强随时间的变化来获得荧光寿命数据。
荧光寿命仪利用激光或其他光源激发荧光物质，然后通过检测荧光物质发射的荧光光强来确定荧光寿命。
二、荧光寿命的应用1. 生物医学研究领域荧光寿命在生物医学研究中有着广泛的应用。
例如，在分子生物学中，荧光寿命可以用于研究荧光标记的分子在细胞中的运动和相互作用。
荧光寿命还可以用于研究细胞内的代谢活动和分子结构的变化，如DNA的损伤修复和蛋白质的折叠过程等。
此外，荧光寿命还可以用于研究荧光染料在生物组织中的分布和代谢途径，从而为荧光成像提供了重要的信息。
2. 材料科学领域荧光寿命在材料科学领域也有着重要的应用。
例如，在半导体材料中，荧光寿命可以用于研究材料的光致发光性质和载流子寿命。
荧光寿命还可以用于研究荧光材料的光学性能和电子结构，从而为材料的设计和应用提供指导。
3. 环境监测领域荧光寿命在环境监测领域也有着重要的应用。
例如，在水质监测中，荧光寿命可以用于研究水中有机物质的来源和分解途径。
荧光寿命还可以用于研究大气颗粒物中的有机污染物和气溶胶物质，从而为环境保护和治理提供重要的数据支持。
4. 光电子学领域荧光寿命在光电子学领域也有着重要的应用。
例如，在光通信领域，荧光寿命可以用于研究光纤和光器件的光学性能和信号传输特性。
荧光寿命还可以用于研究光电器件的发光机制和光电转换效率，从而为光电子技术的发展提供重要的参考。
总结：荧光寿命作为荧光物质的一个重要特性，在生物医学、材料科学、环境监测和光电子学等领域都有着广泛的应用。
光动力学诊断和荧光寿命成像显微学技术
双光子吸收截面及其测量
双光子吸收截面定义：
3 2 2 Im (3) 0c n
C为溶液分子数密度，ω为超短脉冲频率
三、双光子吸收截面实验测量方法概述
双光子吸收截面是双光子材料的重要光物理
特性。目前，用于测量有机材料双光子吸收截
面的实验手段主要有如下四种：
双光子诱导荧光法[5-6]，
双原子分子能级跃迁
量子跃迁中的选择定则
① 入射光为单色偏振光： ΔL=±1， Δm=0
② 入射光为单色非偏振光：可以得到电偶极跃迁的选
择定则是ΔL=±1, Δm=0，±1
③ 多电子原子电偶极辐射跃迁选择定则，ΔL=0，±1。
选择定则的跃迁是否禁戒的判别规则可归结为：
多电子原子中对于由两个或两个以上的非S态电子 组成的电子组态，则在其所形成的原子态间ΔL=0， ΔL=0的跃迁是可能的，而在此外的一切情形中的 跃迁都是禁戒的。
系为：
h N Ad 10
3
注意：
（1）避免所测样品或者实验元件中对入射光
产生的一些反射，折射。 （2）样品中的其他非线性效应对透射光强的 影响也会使测量结果有失准确。
瞬态吸收光谱方法
优点：瞬态吸收谱方法适用于准确测量各种类型有机
分子、尤其是弱荧光或无荧光发射分子的双光子吸收
截面。
2 0
z
ln(1 I 0 z )
非线性介质的透过率可表为
I ( z ) e z T ln(1 I 0 z ) Tlin Tnonlin I (0) I 0 z
双光子吸收诱导的透射光强I(L)为：
1 I ( L) ln(1 I 0 L ) L
对于均匀有机溶液样品，通过实验测试透射光 强随入射光强的改变，拟合实验数据，可以得出 样品的双光子吸收系数β。 分子的双光子吸收截面σ与双光子吸收系数的关
荧光寿命成像及其在生物医学中的应用
荧光寿命成像及其在生物医学中的应用刘立新;屈军乐;林子扬;陈丹妮;郭宝平;牛憨笨【期刊名称】《深圳大学学报（理工版）》【年(卷),期】2005(022)002【摘要】荧光寿命取决于荧光分子所处的微环境,通过对样品荧光寿命的测量和成像可以定量获取样品的功能信息.介绍荧光寿命成像(fluorescence lifetime imaging, FLIM)技术原理、实现途径、发展现状及其在生物医学中的应用.提出一种基于皮秒扫描相机、梯度折射率微透镜阵列、棱镜分光光谱仪、飞秒钛宝石激光器和荧光显微物镜的新型五维荧光显微成像技术,该系统具有多光谱分辨功能以及很高的时间和空间分辨率,能够实现三维多光子荧光强度、光谱分辨强度和寿命测量,将在高通量生化分析、组织鉴别、胞内生理学和荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)等领域获得广泛应用.【总页数】9页(P133-141)【作者】刘立新;屈军乐;林子扬;陈丹妮;郭宝平;牛憨笨【作者单位】中国科学院西安光学精密机械研究所,西安,710068;中国科学院研究生院,北京,100864;深圳大学光电子学研究所,深圳,518060;深圳大学光电子学研究所,深圳,518060;深圳大学光电子学研究所,深圳,518060;深圳大学光电子学研究所,深圳,518060;深圳大学光电子学研究所,深圳,518060;深圳大学光电子学研究所,深圳,518060【正文语种】中文【中图分类】Q334【相关文献】1.激光解吸后电离质谱成像技术在生物医学分析中的应用 [J], 陆桥;聂武艺;胡勇军2.普鲁士蓝纳米颗粒在生物医学成像及生物医学治疗中的应用研究进展 [J], 代岳;蔡璐璐;卢佳慧;沙萱;徐凯;李菁菁3.荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像(FRET-FLIM)技术在生命科学研究中的应用进展 [J], 罗淋淋;牛敬敬;莫蓓莘;林丹樱;刘琳4.荧光显微镜的成像原理及其在生物医学中的应用 [J], 林曼娜5.荧光寿命成像在癌症诊断研究中的应用(特邀) [J], 刘立新;齐美捷;郜鹏;薛平;屈军乐因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像(FRET-FLIM)技术在生命科学研究中的应用进展
Vol 41, No. 4, pp 1023-1031April !2021第41卷，第4期2021 年 4 月光谱学与光谱分析SpectroscopyandSpectralAnalysis荧光共振能量转移■荧光寿命显微成像(FRET-FLIM )技术在生命科学研究中的应用进展罗淋淋123!牛敬敬3!莫蓓莘林丹樱3!刘琳1 ' 2*1深圳大学生命与海洋科学学院，广东省植物表观遗传学重点实验室,广东深圳5180602.深圳大学龙华生物产业创新研究院,广东深圳5180603 深圳大学物理与光电工程学院!广东 深圳 518060摘 要 细胞是动植物结构和生命活动的基本单位$细胞过程的一个重要特点就是其生化组分在时空调控上的相互作用关系$然而,利用传统的生化方法(如酵母双杂交系统、pull-down 系统等)很难在空间上评估活细胞内分子间的相互作用$光学技术的快速发展，为研究活细胞中生物分子的时空动态提供了新的遗传 研究工具,其中荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像(FRET-FLIM )技术在实时探测分析活细胞中生物大分子构象变化和分子间动态相互作用过程具有独特的优势，如：实现对活细胞的实时“可视化”研究，同时具有高时空分辨率&检测更加灵敏、结果可信度高&且基于简易的数学运算完成简单快捷的分析程序$介绍 FRET-FLIM 技术的理论背景知识,对比了该技术与传统蛋白相互作用技术研究的利弊,同时归纳了其在蛋白相互作用、细胞生物学和疾病诊断等方面的最新应用研究进展,最后总结和讨论了 FRET-FLIM 技术的未来发展趋势，以期能够为揭示活细胞的结构和细胞过程相关研究提供新的见解$关键词 荧光共振能量转移&荧光寿命显微成像&蛋白相互作用&疾病诊断中图分类号：O433.4文献标识码：RDOI ： 10. 3964/j. issn. 1000-0593(2021)04-1023-09引言随着人类对生命现象本质的探究，科学家对生命科学问题的研究日益深入，这推动了非生物学科(如数学、化学、物理学、信息科学等)与生命科学相互交叉和相互融合的热潮$20世纪90年代，商用共聚焦显微镜的问世为研究活细胞中不同蛋白的共表达提供了便利的工具(1)$与传统宽场成像方法相比，共聚焦显微镜的光学分辨率和视觉对比度都大幅提高，能够呈现高质量的彩色图像，但是其空间分辨率仍无法 突破衍射极限(大约200 nm ),因而无法用于研究生物分子 间的相互作用$ 2006年以后，许多超分辨率成像技术应运而生,如受激发射损耗显微术(stimulated emission depletion,STED )、 结 构 光 照 明 显 微 术 (structure i l uminationmicroscopy , SIM )、光激活定位显微术(photoactivatable localization microscopy , PALM )和随机光学重构显微术(stochasticopticalreconstruction microscopy !STORM ) 等!收稿日期：2020-03-30,修订日期：2020-07-12基金项目：国家重点研发计划项目(2016YFD0101803),广东省创新创业团队项目(2014ZT05S078),广东省基础与应用研究基金项目(2019A1515011222),深圳市基础研究面上项目(JCYJ20190808112207542)资助作者简介：罗淋淋，1988年生，深圳大学生命与海洋科学学院光生物学博士研究生e-mail : 1in S luo@163. com通讯作者e-mail %linliu @它们的分辨率都能突破衍射极限，最高空间分辨率可达到10nm ,使光学显微镜步入纳米时代[24) $超分辨成像技术由于其高成像分辨率的优势对科学家在活细胞分子水平上的研究 起到了显著的促进作用，如活细胞内生物大分子结构的观察，遗传信息的编码及表达的研究，都对生命过程和疾病发 生机理的理解具有重要的意义(5-7] $然而，这些成像技术仅能较好地获取其结构特征，对体内蛋白质-蛋白质的相互作用所体现的生物功能信息分析特异性不强$荧光寿命显微成像(fluorescence lifetime imaging micros copy , FLIM )技术是研究细胞内生命活动状态的一种非常可靠的方法$荧光寿命是荧光团在返回基态之前处于激发态的 平均时间，是荧光团的固有性质，与样品浓度、样品吸收、 光漂白和激光激发强度等因素无关(切，相反地，荧光寿命对荧光团所处的微环境非常敏感，如细胞中温度、pH 值分 布、离子浓度、氧浓度、分子结合或溶液疏水性等，因而它能十分灵敏地反映激发态分子与周围微环境的相互作用及能量转移(10)$ FLIM 技术就是对荧光探针分子的荧光寿命进行1024光谱学与光谱分析第41卷成像，能实现对细胞内诸多生化参数的定量测量，尤其是结合了荧光共振能量转移（forster resonance energy transfer, FRET）的FRET-FLIM技术$FRET本身不是一种成像技术，而是一个物理过程，指两个携带不同荧光基团的大分子之间或同一分子的不同荧光团之间通过电偶极相互作用所发生的非辐射能量转移（1「12）。
活细胞成像技术及其应用
活细胞成像技术及其应用随着生命科学的发展，活细胞成像技术已经成为一个广泛研究的领域。
在这个领域中，研究人员使用各种成像技术对细胞内的生化过程和分子交互进行实时观测。
这种技术的应用范围非常广泛，可以用于研究许多与健康和疾病有关的生命过程。
1. 活细胞成像技术的基本原理活细胞成像技术的基本原理是采用特殊的显微镜或图像设备对单活细胞或活组织内的过程进行实时观察。
这种技术通常使用荧光染料来标记感兴趣的分子或细胞。
然后通过光学或光成像方法分析荧光信号的强度和位置，以获得关于生物过程的信息。
荧光染料是通常用于标记分子的工具。
这种染料可以结合到特定的分子中，例如蛋白质、DNA或RNA，并使它们发出荧光。
不同的荧光染料具有不同的发射光谱和激发光谱，使研究者能够使用多个颜色来同步标记多个目标。
2. 活细胞成像技术的种类目前已经发展出多种不同类型的活细胞成像技术。
其中一个广泛应用的技术是荧光共聚焦显微镜（FLIM）。
FLIM通过测量荧光染料的寿命来获得有关细胞内分子活动的信息。
另一个常见的技术是光片式扫描显微镜（LSM），它采用光片式扫描来获得详细的三维图像。
光谱成像技术（SI）允许同时对多个荧光染料进行成像，并将它们分离为不同的光谱信号。
这允许研究人员在细胞内同时观察多个过程或结构。
3. 活细胞成像技术的应用活细胞成像技术的应用范围非常广泛。
要了解细胞、分子和生物大分子的机制，可用于检测细胞内的过程，例如内外交通，酶反应，细胞核内结构，细胞间间歇作用，活细胞如何动态，等等。
这项技术可视化了很多生物学过程在活跃的模式下进行的方法，既增加了对生物学的理解，也促进了它能在诊断和治疗方面的进一步应用。
例如，研究人员使用活细胞成像技术来研究癌细胞生存和增殖的机制。
他们可以标记异质蛋白分子在癌细胞内的位置和聚集情况，并通过测量荧光强度以及获得荧光寿命来研究指标蛋白在细胞内的变化。
这些研究可用于开发新型的药理治疗方法，以及提高我们对癌症细胞行为的认识。
荧光发射和荧光寿命 [lifetime] 的工作原理
![荧光发射和荧光寿命 [lifetime] 的工作原理](https://img.taocdn.com/s3/m/dc72b890b04e852458fb770bf78a6529647d35b5.png)
荧光发射和荧光寿命[lifetime] 的工作原理
荧光发射和荧光寿命是荧光分析技术中的重要概念，其工作原理如下：
1. 荧光发射：荧光是分子在吸收能量后，从基态跃迁到激发态，然后从激发态回到基态时所产生的光辐射。
在这个过程中，分子吸收光子能量，从基态（S0）跃迁到激发态（S1）。
根据Frank-Condon规则，分子在吸收特定波长的光子后，被激发到单线态的激发态电子能级
S1中的某一个振动能级上。
这个过程的时间约为10-15秒。
2. 荧光寿命：荧光寿命是指分子在激发态停留的平均时间，它表示粒子在激发态存在的平均时间。
荧光寿命与荧光物质的自身结构和所处的微环境（如极性、粘度等）有关，而与激发光强度、荧光团浓度等因素无关。
当激发停止后，分子激发出的荧光强度降到激发最大强度时的1/e所需的时间被称为荧光寿命。
3. 荧光寿命成像技术：通过时间分辨荧光寿命成像显微镜（Fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM）对样品进行荧光寿命成像，可以对样品所在的微环境中的许多物理参数（如氧压、溶液疏水性等）及生物化学参数（如pH值、离子浓度等）进行定量测量。
此外，荧光寿命成像技术还可以同时获得分子状态和空间分布的信息。
4. 测量荧光寿命的主要技术：时间相关单光子计数法（Time-Correlated Single-Photon Counting, TCSPC）是目前测量荧光寿命的主要技术。
其工作原理是使用窄脉冲激光激发样品，然后检测样品发出的第一个荧光光子到达光信号接收器的时间。
通过将该时间成比例地转化为对应的电压脉冲，并进一步分析电压脉冲，可以获得荧光寿命的信息。
光学显微技术在细胞观察与检测中的应用突破
光学显微技术在细胞观察与检测中的应用突破细胞是生物体组成的最基本单位，是研究生命科学的重要对象。
而光学显微技术作为一种常见、方便且有效的工具，已经在细胞观察与检测中发挥了重要的作用。
在过去的几十年里，随着技术的不断进步和创新，光学显微技术在细胞观察与检测领域不断突破。
本文将从高分辨率成像、活细胞成像、细胞标记技术和活体成像等方面介绍光学显微技术在细胞观察与检测中的应用突破。
首先，光学显微技术在细胞观察与检测中的一个重大突破是高分辨率成像。
传统的荧光显微镜由于受到探测器的限制，只能观察到微米级别的细胞结构。
然而，随着超分辨显微镜的发展，如荧光激发表达成像（STED）显微镜、结构光显微镜、单分子光学显微镜等，分辨率已经超过了传统的衍射极限。
这意味着科学家们可以观察到更细微的细胞结构，如蛋白质、膜蛋白、细胞器等的分布和动态变化。
通过这些高分辨率成像技术，我们可以更详细地了解细胞的复杂结构和功能。
其次，光学显微技术在活细胞成像方面也有了令人瞩目的突破。
在传统的显微镜观察下，细胞需要经过显着的样品处理，如固定、染色、封片等，从而导致细胞的失活和损伤。
然而，现在的光学显微技术已经实现了对活细胞的实时观察。
例如，荧光共聚焦显微镜（CLSM）和荧光寿命成像（FLIM）等技术能够在细胞存活的状态下观察光学显微图像，并对细胞的代谢、信号传导和相互作用等进行动态监测。
这些新的活细胞成像技术在药物筛选、细胞分子机制研究、细胞凋亡和信号转导等领域有着广泛的应用前景。
此外，细胞标记技术也是光学显微技术在细胞观察与检测中的另一个突破。
传统的细胞标记技术如免疫荧光染色仅能对某一特定蛋白进行标记，限制了对多个蛋白、生物分子的同时观察。
然而，近年来发展起来的基于荧光蛋白的细胞标记技术，如绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）等，使得细胞内特定蛋白的观察和追踪成为可能。
此外，CRISPR/Cas9技术的快速发展也实现了基因组编辑，结合荧光标记可对特定位点的基因表达进行观测和研究。
FLIM 方法和应用
荧光寿命测定的现代方法与应用房 喻 王 辉(陕西师范大学化学系 西安 710062)摘 要 介绍了时间相关单光子计数、相调制和频闪等三种现代荧光寿命测定方法的工作原理,指出了各种方法的优点和局限性;介绍了时间相关单光子计数实验数据的处理方法;概述了时间分辨荧光技术在化学和生命科学中的应用。
关键词 荧光寿命 单光子计数 相调制法 频闪技术Abstract The principles and characteristics of s ome of the m odern techniques,including time2correlated single2 photon counting(T CSPC),phase m odulation and strobe techniques,for fluorescence lifetime measurements have been briefly introduced.The advantages and disadvantages of each method have als o been pointed out.The comm on method used for the analysis of the fluorescence decay,taking T CSPC as an example,has been discussed in detail.On the basis of these introductions,the applications of time2res olved fluorescence techniques in chemical and biological re2 search have been overviewed.K ey w ords Fluorescence lifetime,T ime2correlated single photon counting,Phase m odulation methods,S trobe techniques荧光是分子吸收能量后其基态电子被激发到单线激发态后由第一单线激发态回到基态时所发生的,而荧光寿命是指分子在单线激发态所平均停留的时间。
荧光寿命成像技术及其研究进展
激光与光电子学进展48,111102(2011)L a ser &Opt oe l e ct ro nics P rogress 20115中国激光6杂志社荧光寿命成像技术及其研究进展刘 超 周 燕 王新伟 刘育梁(中国科学院半导体研究所光电系统实验室,北京100083)摘要 荧光寿命显微成像(F LIM )技术是一种新颖的荧光成像技术,具有其他荧光成像方法无法替代的优异性能,是生物医学工程领域的研究热点。
频域调制、门控探测和时间相关单光子计数(T CSP C)是FL IM 的几种主要实现方法。
综述了这些技术的原理、研究现状和已取得的部分成果,比较了这三种方法的时间分辨率和成像速度等参数的优劣。
宽场FL IM 更适用于延时成像和实时成像。
荧光偏振各相异性成像和内窥镜FL IM 技术都是FL IM 技术很有前景的应用方向。
关键词 测量;荧光寿命成像;单光子计数;门控探测;频域调制中图分类号 O433 文献标识码 A do i :10.3788/L O P 48.111102Fluore sce nce Life time Imaging Micro sco py and Its Re se arch Progre ssLiu Chao Zhou Yan Wang Xinwei Liu Yuliang(Optoelect r onic Sy st em La bor a tor y ,In st itu te of Sem icon ductor s ,Chin ese Aca dem y of Scien ces ,Beijing 100083,Chin a )Abstract Fluorescenc e lifetime ima ging microscopy (FLI M)technology has so many outstanding and uniqueadvantages compared with other fluoresc ence imaging methods that it attracts more and more researchers inbiomedicine engineering field.Frequency domain modulation m ethod and time domain methods including time -gateddetection and time correlated single photon counting (TCSPC),a re the m ain ways to rea lize FLIM.Principles,current reaseach situation and achievements of these methods a re presented as well as the compa rison of their mainperformance pa rameters.Wide -field FLIM is more suitable for delay imaging.Fluoresc ence lifetime polarizationresolved imaging and endoscope FLI M are both promising researc h areas of FL IM.Key wo rds measurement;fluorescence lifetime ima ging mic roscopy;time -c orrelated single photon counting;time -gated detection;frequency m odulationOCIS co des 110.0180;170.2520;260.2510收稿日期:2011-04-08;收到修改稿日期:2011-05-29;网络出版日期:2011-08-27作者简介:刘 超(1988)),男,硕士研究生,主要从事光电图像处理方面的研究。
荧光寿命显微成像技术及应用的最新研究进展
荧光寿命显微成像技术及应用的最新研究进展刘雄波;林丹樱;吴茜茜;严伟;罗腾;杨志刚;屈军乐【期刊名称】《物理学报》【年(卷),期】2018(67)17【摘要】由于荧光寿命不受探针浓度、激发光强度和光漂白效应等因素影响,荧光寿命显微成像技术(fluorescence lifetime imaging microscopy,FLIM)在监测微环境变化、反映分子间相互作用方面具有高特异性、高灵敏度、可定量测量等优点,近年来已被广泛应用于生物医学等领域.然而,尽管FLIM的发明和发展已历经数十年时间,其在实际应用中仍然面临着许多挑战.例如,其成像分辨率受衍射极限限制,而其成像速度与成像质量和寿命测量精度则存在相互制约的关系.近几年来,相关硬件和软件的快速发展及其与其他光学技术的结合,极大地推动了FLIM技术及其应用的新发展.本文简要介绍了基于时域和频域的不同寿命探测方法的FLIM技术的基本原理及特点,在此基础上概述了该技术的最新研究进展,包括其成像性能的提升和在生物医学应用中的研究现状,详细阐述了近几年来研究者们通过硬件和软件算法的改进以及与自适应光学、超分辨成像技术等新型光学技术的结合来提升FLIM的成像速度、寿命测量精度、成像质量和空间分辨率等方面所做的努力,以及FLIM 在生物医学基础研究、疾病诊断与治疗、纳米材料的生物医学研究等方面的应用,最后对其未来发展趋势进行了展望.【总页数】15页(P352-366)【作者】刘雄波;林丹樱;吴茜茜;严伟;罗腾;杨志刚;屈军乐【作者单位】深圳大学光电工程学院, 光电子器件与系统教育部/广东省重点实验室, 深圳 518060;深圳大学光电工程学院, 光电子器件与系统教育部/广东省重点实验室, 深圳 518060;深圳大学光电工程学院, 光电子器件与系统教育部/广东省重点实验室, 深圳 518060;深圳大学光电工程学院, 光电子器件与系统教育部/广东省重点实验室, 深圳 518060;深圳大学光电工程学院, 光电子器件与系统教育部/广东省重点实验室, 深圳 518060;深圳大学光电工程学院, 光电子器件与系统教育部/广东省重点实验室, 深圳 518060;深圳大学光电工程学院, 光电子器件与系统教育部/广东省重点实验室, 深圳 518060【正文语种】中文【相关文献】1.二组分荧光寿命成像显微术的研究 [J], 屈军乐;朱憨笨2.显微荧光光谱成像技术及应用 [J], 范世福;肖松山;赵友全;李昀;赵玉春3.环化荧光蛋白生物探针荧光寿命成像研究进展 [J], 周加胜;王鹏;周黄梅;许金铭;张三军4.荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像(FRET-FLIM)技术在生命科学研究中的应用进展 [J], 罗淋淋;牛敬敬;莫蓓莘;林丹樱;刘琳5.任意数量离散不规则感兴趣区域的快速荧光寿命显微成像 [J], 牛敬敬;刘雄波;陈鹏发;于斌;严伟;屈军乐;林丹樱因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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生物光子学大作业作业名称：荧光寿命成像技术FLIM 姓名：曾扬舰学号：完成日期：2016.6.28荧光寿命成像技术FLIM摘要：荧光寿命显微成像技术（FLIM）技术是一种新颖的荧光成像技术，具有其他荧光成像技术无法代替的优异性能，是生物医学工程领域的研究热点。
频域调制、门控探测和时间相关单光子计数是FLIM的几种主要实现方法。
综述了这些计数的原理、研究现状和已取得的部分成果，比较了这三种方法的时间分辨率和成像速度等参数的优劣。
宽场FLIM更适用于延时成像和实时成像。
荧光偏振各向异性成像和内窥镜FLIM技术都是FLIM技术很有前景的应用方向。
Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy(FLIM)Why lifetime Imaging?The fluorescence lifetime is the signature of a fluorescent material ;It is the exponential decay in emission after the excitation of a fluorescent material has been stopped. FLIM is a technique to map the spatial distribution of lifetimes within microscopic images and it allows measurements in living cells as well as in fixed.Because of the fact that some phenomena do affect fluorescence lifetimes, the lifetime is used to detect these phenomena leading to various applications such as; lon imaging ,oxygen imaging, probing microenvironment, and medical dlagnosis.Frequency domain methodThe homodyne frequency domain FLIM method requires amodulated light source and a modulated detector.In the LIFE system these are the LED and the intensified CCD camere. Both are modulated at exactly the same frequency,but with an adjustable diffrence in phase.These two parameters depend on the fluorescence lifetime of the sample and the modulation frequency and are measured to calculate the flurescence lifetime in each pixel of the image.1、基本概念荧光是分子吸收能量后使得其基态电子被激发到单线激发态后由第一单线激发态回到基态时所发生的辐射复合发出的光。
荧光寿命是指分子受到光脉冲激发后返回基态之前在激发平均停留的时间，处于激发态的荧光分子在从激发到基态的过程中发射荧光释放能量。
荧光寿命是荧光物质固有性质，与浓度，光漂白和激发强度无关，依赖于围绕荧光物质的离子和局部环境，比如蛋白质的束缚等。
影响荧光寿命的因素：荧光物质的结构；所处微环境的极性、温度、粘度，键合离子等条件有关。
荧光寿命成像可以区分荧光物质浓度和淬灭效应的影响，这使得荧光寿命成像显微学成为一个有力的工具进行细胞内的定量环境和分子动力学分析。
荧光寿命成像技术有两种：时间域和频率域。
（1）时域FLIM：需要脉冲光源，所以一般在双光子的系统上比较常见，因为激光是脉冲的而且买双光子的老师一般也搭配一个FLIM。
光路调节也是一个问题，提供的厂家一般是Becker&Hickl和PicoQuant德国公司。
这个方法比较流行，也有很多系统。
（2）频域FLIM：需要一个相位调制的光源，有用LED调制的，荷兰的Lambert-Instrument就有这样一套产品，是在荧光显微镜上搭的。
2、FLIM 技术的分类及总体进展荧光发射后会以指数规律衰减。
荧光寿命通常定义为荧光强度降至最大值的1/e 时所需要的时间，常用τ表示。
由于荧光分子所处环境的不同，荧光发射可分为单组分和多组分两类，最简单的情况即单组分下，荧光信号衰减可表示为 )/ex p(0τt I I -= 如果有大量处在相似环境里的荧光分子被激发，那么发射荧光的衰减遵循单指数规律。
典型的荧光信号通常都是多组分，即多指数衰减规律。
FLIM 技术发展到现在，形成了频域和时域两大类方法。
其中门控探测、时间相关单光子计数和扫描相机成像是三种主要的时域实现方法。
国际上从20世纪80年代开始荧光寿命成像发面的研究工作。
较早从事荧光寿命成像技术方面的研究工作是日本大阪大学，他们提出的频率调制法来进行荧光寿命的测量。
频率调制法原理清晰，设备要求低，系统简单而且造价低，技术也日趋成熟。
睡者生物医学测量的需要，可进行纳秒、皮秒量级荧光寿命成像的实时时域FLIM 技术随后兴起，具有成像速度快，时间分辨率高等优点。
TCSPC 是一种经典的光子测量技术，在目前时域FLIM 中应用最广泛，技术也很成熟。
与此同时，时间分辨率不及TCSPC ，但成像速度更快的门控FLIM 技术逐渐成为FLIM 领域的研究热点。
3、条纹相机方法测量荧光寿命工作原理：条纹相机把荧光中的时间信息转化为空间信息的装置。
典型的条纹相机由条纹管、快速扫描电极、输入和输出装置。
条纹相机主要是用来测量超快荧光。
由超短光脉冲诱导的、从样品发出的荧光被聚焦在条纹相机的光阴电极上，从光阴电极上释放的光电子流量与聚焦在光阴电极上的荧光强度成比，这些电子在加速电场中被加速，然后在偏转电场中被偏离，最后入射到荧光屏的磷光粉上。
因此，在不同的时刻，从光阴电极上释放出来的光电子入射到荧光屏上位置也不同。
这样在荧光屏上就可以看到一条条轨迹或者称之为条纹，这些条纹的空间分辨率直接对应于荧光的时间分辨率。
类型细分为飞秒条纹相机，大动态范围条纹相机，帧条纹相机，X-射线条纹相机等。
4、频域FLIM技术频域FLIM使用正选调制的激光器或者发光二极管LED作为光源对样品进行激发，样品会产生与激发光同频率但相位差为的荧光信号然后使用同频率调制的CCD或者PMT作为探测器解调并接收荧光信号，通过测量解调系数M，即可计算相应的荧光寿命和。
==M=国际上对频域FLIM的研究开展较早。
如何提高成像速率成为频域FLIM 技术首先需要解决的问题。
1999年，瑞士环境工程研究所Mizeret等实现了视频速率的内窥镜频域FLIM成像，将其应用到了医疗诊断领域，2000年，伊利洛伊大学厄本那分校Holub等实现了帧频55Hz的频域，是当时最快帧频。
2004年，新加坡南洋理工大学Seah等使用频域FLIM完成了对潜在指纹的识别。
5、时域FLIM技术时域FLIM通过脉冲激光器激发荧光团，利用探测器等直接探测荧光衰减信号成像。
时域设备与频域相比，通常有更快的成像速度和更高的时间分辨率，因此对设备要求更高。
TCSPC有理想的光子计数率和超高的时间分辨率，与门控探测相比，可测量更短的荧光寿命。
门控法的荧光寿命分辨率虽不及TCSPC，但图像获取速度通常很快，是实现非稳态过程探测的有力技术手段。
5.1 时间相关单光子计数5.2 门控探测左图为理想的单指数荧光衰减曲线，在激发光E(t)作用下，荧光团发射荧光，荧光强度F(t)与时间t关系可表示为F(t)=exp(-t/) ，荧光寿命可通过在两个不同时刻开启的相同宽度的门内记录的荧光强度信息求得。
在条件允许下，通常采用多门探测。
一个典型的设置为：取三个不同的延迟时刻，每个门记录1~5幅图像右图是个典型的门控荧光寿命成像系统简图。
通常由激发光源、光电探测某一段时间内检测到发射光子的概率与此时段内的荧光强度成正比，通过测量探测荧光强度的衰减即可实现荧光寿命的探测。
TCSPC基于上述原理实现，构造出如右图荧光发射光子在时间轴上的概率分布曲线，即荧光衰减曲线。
由于每个周期只记录一个光子，成像速度慢成为TCSPC最大缺点。
TCSPC的时间分辨率很高，通常只受探测器渡越时间限制。
器、延迟装置及图像处理设备组成门控装置的光源通常为短脉宽超快激光器，以提高生物样品成像的寿命分辨率。
CCD是常见的成像设备，CCD门宽对成像精度的影响还需要深入研究。
延迟装置提供FLIM的控制信号。
荧光强度图像生成寿命图像的方法有两种：RLD和WNLLS。
6、宽场FLIM系统宽场FLIM是宽视场的荧光寿命成像显微镜，右图给出了宽场显微镜与扫描显微镜的对比。
，宽场FLIM优势在于较弱的荧光团光漂白效应和较快的系统成像速度，相同探测率下，所需要的激发光要小的多，则样品受到光漂白的影响会小于扫描系统。
宽场系统缺点在于其成像深度小与扫描系统，无法得到样本深层的图像，可通过其他手段得到改善。
7、FLIM技术与癌症诊断癌细胞的自荧光特性与正常组织有较大差异，同时也可用于区分癌细胞的不同生长周期。
其自荧光特性之一的荧光寿命提供了癌症诊断的新依据。
近年来，国际FLIM研究热点纷纷集中在FLIM对癌症的辅助诊断上，研究方向逐渐由体外病理检验向体内诊断治疗发展。
内窥镜是临床诊疗，特别是胃癌、食道癌诊断中非常重要的手段。
因此FLIM与内窥镜的结合，将极大发挥其对癌症组织的精确定位的优势。
实时成像在内窥镜诊断中是非常有必要的。
8、FLIM技术的应用1）细胞体自身荧光寿命分析2）自身荧光相对荧光标记的有效区分3）具有相同频谱性质的不同荧光标记的区分4）活细胞内水介质的PH值测量5）局部氧气浓度测量6）活细胞内钙浓度测量7）时间分辨Forster共振能量转移（Fret）：纳米级尺度上的远程测量，环境敏感的FRET探针定量测量。
总结：在各种FLIM方法中，TCSPC的时间分辨率最高，文献报道可达25ps，门控FLIM仅此于TCSPC，可进行纳秒量级的寿命测试。
但在成像速度上，门控FLIM是最快的，文献报道帧频可达100Hz。
频域FLIM的成本最低，应用最广泛，但其性能指标均不及TCSPC和门控FLIM为主的时域方法。
宽场FLIM可实现更快的帧频，更适合应用门控FLIM。