蛋白质测定方法之双缩脲法(BIURET法)
蛋白质测定方法之双缩脲法(Biuret法)
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1~10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材1.试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。
如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。
牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。
（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4•5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。
此试剂可长期保存。
若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2.器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
（三）操作方法1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。
充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。
用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。
【生物化学实验】双缩脲法测定血清蛋白质含量
实验开始！
3.0
标准管 2×2 3×2 4×2
0.4
0.6
0.8
—
—
—
0.6
0.4
0.2
3.0
3.0
3.0
5×2 1.0
— — 3.0
测定管 ×2
—
0.1 1.9 3.0
✓ 混匀各管，室温放置30分钟。以空白管调零，在波 长540 nm比色，读取各管光吸收值，并记录。
在座标纸上以各管蛋白质含量为横座标， 两管平均光吸收值为纵座标，绘制标准曲 线。
➢ 常用方法：
1. 比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线 不同，表明物质的化学结构不同。
2. 比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同； 化学结构相似的物质最大吸收波长相同，吸收系数不 同。
3. 比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（DNA A260/A280=1.8 纯度鉴定)
利用吸收光谱对物质进行定量分析
物理性质：紫外分光光度法。
化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法
染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。
实验目的 掌握双缩脲法测定蛋白质的原理 掌握分光光度计的使用 掌握标准曲线的制作 学习分光光度法测定的原理和方法
实验原理
双缩脲反应（Biuret reaction）
两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2NOC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接 的酰胺键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲 反应，生成紫红色络合物。
➢ 原理： Lambert-Beer定律
➢ 常用方法：
1. 标准曲线法
2. 配制一系列已知不同浓度的标准溶液，用选定的显 色剂显色。选用合适波长的入射光。测定时先以空白 溶液调节透光率100%，然后分别测定标准系列的吸光 度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图得到一条 通过原点的直线，叫做标准曲线（或称A-C曲线）。
蛋白质含量的测定
蛋白质含量测定法蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。
目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry 法）和紫外吸收法。
另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。
其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。
定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。
每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。
在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH|+ 3H2SO4 →2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)NH21702NH3 + H2SO4→(NH4)2SO4(2)(NH4)2SO4 + 2NaOH →2H2O +Na2SO4 + 2NH3(3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。
如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。
蛋白质含量的测定方法
蛋白质含量的测定方法蛋白质含量的测定是我们判断每一种食物是否含有高蛋白，所以我们建议大家应该要对于蛋白质的检测方法有一定的认识。
一般我们在生活中检查蛋白质含量的方法是通过硫酸铜的方法，也可以通过酚试剂的方法，所以大家觉得哪种方法比较方便，我们建议大家可以尝试一下文章介绍的方法。
双缩脲法(Biuret法)灵敏度低1～20mg中速20~30分钟多肽键+碱性Cu2+紫色络合物硫酸铵;Tris缓冲液;某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏;不同蛋白质显色相似。
紫外吸收法较为灵敏50～100mg快速5～10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶;Folin-酚试剂法(Lowry法)灵敏度高～5mg慢速40～60分钟双缩脲反应;磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和phe还原硫酸铵;Tris 缓冲液;甘氨酸;各种硫醇耗费时间长;操作要严格计时;颜色深浅随不同蛋白质变化。
考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度最高1～5mg快速5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液;SDS最好的方法;干扰物质少;颜色稳定;颜色深浅随不同蛋白质变化。
硫酸铜法：称取0.2g硫酸铜，6g硫酸钾，把0.5g粉碎好的大豆(不用测量水分的)用滤纸包好放入定氮瓶中中，加20ml硫酸，(瓶口上放一个小漏斗，防止蛋白跑掉)小火在电炉子上消化，等没有碳化颗粒，并处于澄清状态时，拿下来凉一会。
再加过氧化氢直到把瓶颈上的蛋白冲洗干净为止，再消化30分钟。
拿下来，等凉。
通过这篇文章对于蛋白质含量测定方法的介绍，我们应该都知道如何在生活检查蛋白质的含量，所以我们建议大家应该要对于蛋白质的测定方法进行分析。
一般我们在生活中检测蛋白质的方法是比较多的，希望你们可以采纳文章介绍的方法。
蛋白质含量测定方法汇总
实验七蛋白质含量测定测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。
[目的要求]1．掌握测定蛋白质的含量根本方法。
2．了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。
一、染料法[实验原理]在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收顶峰从460nm移至595nm。
利用这个原理可以测定蛋白质含量。
该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反响时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。
本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。
[器材]吸量管；试管；721型分光光度计[试剂]1.标准牛血清白蛋白溶液：配成0.1mg/ml的溶液。
2.待测蛋白质溶液。
3.染料溶液：称取考马斯亮蓝G-2500.1g溶于95%的酒精50ml，再参加85%的浓磷酸100ml，用水稀释至1000ml,混匀备用。
[操作步骤]按上表分别向各支试管内参加各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值〔A〕。
以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。
2．样品测定：取1ml样品溶液〔约含25～250微克蛋白质〕，参加染料溶液5ml混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。
二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量[实验原理]在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反响称双缩脲反响。
凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反响。
测量蛋白质含量的几种方法以及优缺点
一、染料法
优点：因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。
缺点：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。
二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量
优点：较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
缺点：灵敏度差。
因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
三、酚试剂法测定血清蛋白质含量
（改良Lowry法）
优点：方法简便，灵敏度高，能够测定2～100μg的微量蛋白质。
其方法凯氏定氮法操作简便，其灵敏度比双缩脲法高100倍左右。
因此经常被用于科研与临床检验。
四、紫外吸收法
优点：灵敏度高，仪器设备简单，操作简便。
缺点：准确度不高，有的检测不可用，有限制。
五、凯氏定氮法（Kjeldahl determination）优点：可用于所有食品的蛋白质分析中，操作相对简单费用低。
结果
准确、改进后可以用于微量蛋白质的测定。
缺点：最终测定的是总有机氮而不是蛋白质氮。
精确度低于双缩脲法、试剂有腐蚀性。
六、F olin－酚试剂法（Folin-phenol
Reagent Method ）
优点：灵敏度高，方便简单。
缺点：费时较长，精确控制操作时间
七、考马斯亮蓝法（Coomassie
brilliant blue staining ）
优点：灵敏度高，测定快速，应用广泛，只需一种试剂，用时间短。
缺点：有较大的偏差，而且去污剂等很多试剂对其有干扰。
经典蛋白含量测定方法比较及双缩脲法实验步骤简介
充分混匀后, 室温下(20~25℃)放置30min
A540
（二） 绘制标准曲线
以每管蛋白的含量为横坐标,其相对应的A520为纵坐 标绘制标准曲线。
（三）未知样品蛋白质浓度的测定
取2只试管，每只分别加入1ml稀释的未知样品， 再分别加入4ml双缩脲试剂，操作方法同前。
然后，测540nm处光密度值，取其平均值。从绘 制的标准曲线查得未知样品的蛋白浓度。
理和使用方法。
二、实验原理
2
2
2
180℃
加热
H－
＋ NH3
2
2
2
双缩脲
双缩脲反应:碱性环境
O=C HN
H2O C=O
NH
含有两个或两 个以上肽键的
R-CH
CH-R
O=C
Cu
C=O
HN
NH
化合物均有双 缩脲反应
R-CH
CH-R
H2O
紫色络合物
➢ 蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲 反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红 色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成 正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无 关，因此被广泛地应用。
灵敏度最高 1～5g
快速 5～15 分钟
考马斯亮蓝染料 与蛋白质结合时, 其max由465 nm 变为595nm
强碱性缓冲 液；Triton
X-100;SDS
最好的方法; 干扰 物质少; 颜色稳定; 颜色深浅随不同 蛋白质变化
一、实验目的
➢掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理
和方法。
➢进一步掌握紫外和可见光分光光度计的原
五、实验结果
Y×N
血清样品蛋白质含量 =
×100
双缩脲法测定蛋白质含量注意事项
双缩脲法测定蛋白质含量注意事项引言：蛋白质是生物体中一类重要的有机化合物，广泛参与生命活动的调控和执行，因此准确测定蛋白质含量对于许多研究和应用领域具有重要意义。
双缩脲法是一种常用的蛋白质含量测定方法，本文将介绍双缩脲法的原理和操作注意事项。
一、双缩脲法测定蛋白质含量原理双缩脲法是通过测定蛋白质中含有的酪氨酸和组氨酸的数量来确定蛋白质含量的。
在碱性条件下，酪氨酸和组氨酸能与二缩脲酸（DTNB）反应生成黄色产物，通过测定该产物的吸光度可以确定蛋白质的含量。
二、双缩脲法测定蛋白质含量的步骤1. 样品制备：将待测样品溶解于缓冲液中，使其浓度适宜，一般为1-10 mg/mL。
2. 反应体系配置：将待测样品、缓冲液、DTNB和NaOH按照一定比例混合，形成反应体系。
3. 反应进行：将反应体系置于适当的温度下孵育一段时间，使反应充分进行。
4. 吸光度测定：使用分光光度计测定反应体系中产生的黄色产物的吸光度，通常在415 nm波长下测定。
5. 蛋白质含量计算：根据吸光度的测定值，结合标准曲线，计算出待测样品中蛋白质的含量。
三、双缩脲法测定蛋白质含量注意事项1. 样品制备：样品溶解应充分，避免有团块存在，以保证测定的准确性。
2. 缓冲液的选择：不同样品可能需要不同的缓冲液，应根据样品的特性选择合适的缓冲液。
3. DTNB的浓度：DTNB的浓度应适中，过高或过低都会对测定结果产生影响，一般为0.01-0.1 mol/L。
4. 孵育时间：反应体系的孵育时间应控制在适当范围内，一般为10-30分钟，过长或过短都会对测定结果产生影响。
5. 反应体系的pH值：反应体系的pH值应控制在适当范围内，一般为9-10，过高或过低都会影响反应的进行。
6. 吸光度测定条件：吸光度的测定应在反应结束后尽快进行，避免产物的分解或其它因素对测定结果的干扰。
7. 标准曲线的制备：应制备一条符合线性关系的标准曲线，通过测定一系列不同浓度的蛋白标样来制备标准曲线。
蛋白质含量测定方法汇总
实验七蛋白质含量测定测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。
[目的要求]1．掌握测定蛋白质的含量基本方法。
2．了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。
一、染料法[实验原理]在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从460nm移至595nm。
利用这个原理可以测定蛋白质含量。
该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。
本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。
[器材]吸量管；试管；721型分光光度计[试剂]1.标准牛血清白蛋白溶液：配成ml的溶液。
2.待测蛋白质溶液。
3.染料溶液：称取考马斯亮蓝G-250 溶于95%的酒精50ml，再加入85%的浓磷酸100ml，用水稀释至1000ml,混匀备用。
[操作步骤]1．标准曲线的绘制：试剂(ml)\管号 0 1 2 3 4 5标准蛋白溶液 00 OH 2染料溶液A595nm按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值（A）。
以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。
．样品测定：2．取1ml样品溶液（约含25～250微克蛋白质），加入染料溶液5ml混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。
二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量[实验原理]在碱性溶液中，双缩脲(HN-CO-NH-CO-NH)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这22一反应称双缩脲反应。
凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH)，或与此相似的基团[如2—CH-NH，—CS-NH，—C(NH)NH]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或2222氮原子间接相连，均可发生上述反应。
蛋白质含量测定方法
蛋白质含量测定法本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。
了解各种测定方法的基本原理和优缺点。
蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。
目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry 法）和紫外吸收法。
另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。
其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。
定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。
每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。
在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH|+ 3H2SO4 →2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)NH22NH3 + H2SO4→(NH4)2SO4(2)(NH4)2SO4 + 2NaOH →2H2O +Na2SO4 + 2NH3(3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。
蛋白质的定量测定一-双缩脲法
06
CATALOGUE
双缩脲法的改进和发展方向
改进方法
优化试剂配比
通过调整试剂浓度和比例，提高方法的灵敏度和 准确性，减少误差。
扩大应用范围
针对不同来源和性质的蛋白质样品，优化实验条 件，使其能够适用于更多样品的测定。
ABCD
简化操作步骤
减少实验步骤，降低操作难度，提高实验效率。
提高检测速度
采用快速显色反应或缩短反应时间的方法，缩短 实验周期，提高检测速度。
蛋白质结构研究
通过双缩脲法测定不同蛋白质的含量，有助于研究蛋白质的结构和 功能，进一步了解生物体的生命活动。
蛋白质合成与代谢研究
双缩脲法可以用于研究生物体内蛋白质的合成与代谢过程，探索相 关生理机制。
在医学研究中的应用
临床诊断
双缩脲法可以用于检测尿液、血 液等生物样本中的蛋白质含量， 辅助医生进行临床诊断。
药物研发
在药物研发过程中，双缩脲法可 用于检测药物对蛋白质的影响， 评估药物的疗效和安全性。
病理学研究
通过双缩脲法测定病变组织中蛋 白质的含量，有助于病理学研究 ，深入了解疾病的发生和发展机 制。
在食品工业中的应用
食品品质控制
01
双缩脲法可以用于检测食品中的蛋白质含量，确保食品品质符
合标准。
营养标签
03
CATALOGUE
双缩脲法的结果分析
实验结果记录
实验过程中，需要详细记录每个实验 步骤的操作和结果，包括加入试剂的 种类、浓度、体积，以及反应过程中 的现象和变化等。
实验结果记录应准确、详细，包括实 验数据和观察到的现象，以便后续分 析和处理。
结果计算与处理
根据实验记录的数据，进行相应的计 算和处理，以得出蛋白质的含量。
双缩脲法测定蛋白质含量
双缩脲法测定蛋白质含量一、双缩脲法实验原理双缩脲法测定蛋白质含量实验中，双缩脲是在大约180°C条件下加热两个尿素分子，以达到释放出一个氨分子而获得的产物。
在强碱性溶液中，缩二脲和硫酸铜形成紫色络合物，称为缩二脲反应。
任何包含两个酰胺基或两个直接连接的肽键或可以通过中间碳原子连接的肽键的化合物都将发生缩二脲反应。
紫色复合色的强度与蛋白质浓度成正比，与蛋白质分子量和氨基酸组成无关。
它可以用来确定蛋白质含量。
测量范围是1-10mg蛋白质。
干扰测定的主要物质是：硫酸铵，Tris缓冲液和某些氨基酸。
这种方法的优点是速度快，不同的蛋白质产生相似的颜色，干扰物质少。
主要缺点是灵敏度差。
因此，缩二脲法通常不用于蛋白质的精确测定。
二，双缩脲法所需材料1种试剂：标准蛋白溶液的制备：用标准结晶牛血清白蛋白（bsa）或标准酪蛋白制备10mg/ml标准蛋白溶液。
可以用0.66a280校准纯度，bsa浓度为1mg/ml。
如有必要，可以使用标准蛋白质预先通过微凯氏定氮法测定蛋白质氮含量，计算其纯度，然后称重，并根据其纯度制备标准蛋白质溶液。
用H2O或0.9％NaCl制备牛血清白蛋白，用0.05NaOH制备酪蛋白。
双缩脲试剂制备：称取1.50g硫酸铜（CuSO4•5H2O），6.0g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O），溶于500ml水，在搅拌下加入300ml10％NaOH溶液，用水稀释至1升，储存在塑料瓶（或内壁涂有石蜡的瓶子）。
该试剂可以长期保存。
如果在储存瓶中出现黑色沉淀物，则需要对其进行重新配制。
2台设备：可见光分光光度计，15个大试管，涡旋混合器等三，双缩脲法的实验步骤1标准曲线的确定：将12个试管分为两组，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml蛋白质标准溶液，用水补足1ml，再加入4ml缩二脲试剂。
摇匀后，在室温（20-25℃）下放置30分钟，并在540nm下测量颜色。
第一个不含蛋白质溶液的试管是空白对照溶液。
6种方法测定蛋白质含量
6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：NH2CH2COOH+3H2SO4――2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)2NH3+H2SO4――(NH4)2 SO4(2)(NH4)2 SO4+2NaOH――2H2O+Na2SO4+2NH3(3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。
如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。
二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1-10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材1.试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。
双缩脲法检测
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双缩脲法检测
双缩脲法（Biuret method），是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。
双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。
当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。
可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。
鉴定反应的灵敏度为5-
160mg/ml。
鉴定反应蛋白质单位1-10mg。
双缩脲反应产生的紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
迪信泰检测平台采用生化法（双缩脲法）对蛋白含量进行测定，实现对蛋白含量高效、精准的测定。
此外，我们还提供其他蛋白含量的检测方法，以满足您的不同需求。
生化法（双缩脲法）测定蛋白含量样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周。
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）。
2. 相关参数（中英文）。
3. 图片。
4. 原始数据。
5. 双缩脲法蛋白含量信息。
迪信泰检测平台可根据需求定制其他物质测定方案，具体可免费咨询技术支持。
双缩脲法测定蛋白质的浓度
2
H－
2
双缩脲
＋ NH3
双缩脲反应:碱性环境
O=C HN
R-CH O=C
HN R-CH
H2O
C=O
NH
CH-R
Cu
C=O
NH
CH-R
H2O
紫色络合物
双缩脲试剂
蛋白质含有两个以上的肽键（与双缩脲中肽键相似）， 因此有双缩脲反应。
比色分析法 溶液的颜色和光的选择吸取、光的吸收定律：T%与A或E
A＝εCL
一、实验目的
掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理和方法。 学会使用721或7220型分光光度计并了解仪器的 基本结构。
二、实验原理
蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在 碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜 色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子 量及氨基酸成分无关，因此被广泛地应用。
管A值。 ．
五、实验结果与讨论
前6管每管蛋白的含量为横坐标绘制标准曲线。 待测液中选择吸光值在标准曲线范围内的作为计
算基础。求出待测液蛋白含量是？单位mg/ml
或7220型分光光度计。 （二）材料 1． 标准蛋白溶液(2~5mg/ml)、 未知液 （三）试剂 1．双缩脲试剂 溶解0.175克硫酸铜（CuSO4.5H2O）溶
于15ml蒸馏水，置于100ml容量瓶中，加入30ml冰冷 的蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置 1~2h，再加蒸馏水对刻度，摇匀备用。
四、实验操作步骤
（一） 绘制标准曲线 （二）未知样品蛋白质浓度的测定
1．取12支试管 6支分别加入0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0毫升的标准
6支分别加入1毫升不同稀释浓度的待测液（两两相同）。 2.分别加水补足到2毫升。 3.分别加入4毫升双缩脲试剂在室温下放置30分钟。 4.在540毫微米波长下7220型分光光度计比色、读数，记录各
稻米中蛋白质含量测定
实验二稻米中蛋白质含量的测定本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法，比较不同方法的测定结果的差距，知道稻米中蛋白含量的范围。
一、双缩脲法（Biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1-10mg蛋白质。
（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成5mg/ml的标准蛋白溶液，牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N KOH配制。
（2）双缩脲试剂：称以0.3克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和1.2克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），用100毫升水溶解，在搅拌下加入60毫升10% NaOH溶液，用水稀释到200毫升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。
此试剂可长期保存。
若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2. 器材：可见光分光光度计、试管10支、旋涡混合器等。
（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取7支试管分两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。
充分摇匀后，在室温（20-25℃）下放置30分钟，于550nm处进行比色测定。
用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。
以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。
2、样品的测定：称取被测样品（过100目筛）0.4000g，放入干燥的150ml三角瓶中，先加入1ml四氯化碳再加入50ml双缩脲试剂，盖上瓶塞，利用振荡器振荡5分钟后，再于室温下放置30分钟，取适量溶液倒入离心管中，在4000r/min 下离心10分钟，将澄清的上清液倒出，取3个试管，测定未知样品的蛋白质浓度。
蛋白质质量测定常用的方法
蛋白质质量测定常用的方法①凯氏定氮法原理：蛋白质平均含氮量为16%。
当样品与浓硫酸共热，蛋白氮转化为铵盐，在强碱性条件下将氨蒸出，用加有指示剂的硼酸吸收，最后用标准酸滴定硼酸，通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量。
②双缩脲法原理：尿素在180℃下脱氨生成双缩脲，在碱性溶液中双缩脲可与Cu2+形成稳定的紫红色络合物。
蛋白质中的肽键实际上就是酰胺键，故多肽、蛋白质等都有双缩脲（biuret）反应，产生蓝色或紫色复合物。
比色定蛋白质含量。
缺点：灵敏度低，样品必须可溶，在大量糖类共存和含有脯氨酸的肽中显色不好。
其精确度较差(数mg)，且会受样品中硫酸铵及Tris 的干扰，但准确度较高，不受蛋白质的种类影响。
③Folin酚法(Lowry)Folin酚法是biuret 法的延伸，所用试剂由试剂甲和乙两部分组成。
试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜试剂），试剂乙中含有磷钼酸和磷钨酸。
在碱性条件下，蛋白质中的巯基和酚基等可将Cu2+还原成Cu+，Cu+能定量地与Folin－酚试剂反应生成蓝色物质，600nm比色测定蛋白质含量。
灵敏度较高(约0.1 mg)，但较麻烦，也会受硫酸铵及硫醇化合物的干扰。
步骤中各项试剂的混合，要特别注意均匀澈底，否则会有大误差。
④紫外法280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收进行测定。
280nm-260nm的吸收差法：若样品液中有少量核酸共存按下式计算：蛋白质浓度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260为角标）⑤色素结合法（Bradford 法）直接测定法：利用蛋白质与色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）结合物的光吸收用分光光度法进行测定。
考马斯亮兰（CBG）染色法测定蛋白质含量。
CBG 有点像指示剂，会在不同的酸碱度下变色；在酸性下是茶色，在中性下为蓝色。
当CBG接到蛋白质上去的时候，因为蛋白质会提供CBG一个较为中性的环境，因此会变成蓝色。
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一）实验原理
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1~10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材
1.试剂：
（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。
如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。
牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。
（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。
此试剂可长期保存。
若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2.器材：
可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
（三）操作方法
1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。
充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。
用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。
取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。
2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。
注意样品浓度不要超过10mg/ml。
三、Folin—酚试剂法（Lowry法）
（一）实验原理。