RACE原理及实验步骤

3'-RACE 基本原理
3’ RACE流程图
先利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作为一个引物结 合位点，以Oligo（dT）30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV 作用下，反转录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具有 的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5'末端时自动加 上3-5个（dC）残基，退火后（dC）残基与含有SMART寡核苷 酸序列Oliogo（dG）通用接头引物配对后，转换为以SMART 序列为模板继续延伸而连上通用接头。然后用一个含有部分 接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为上 游引物，用一个基因特异引物2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板， 进行PCR循环，把目的基因5'末端的cDNA片段扩增出来。最 终，从2个有相互重叠序列的3'/ 5'-RACE产物中获得全长 cDNA，或者通过分析RACE产物的3'和5'端序列，合成相应引 物扩增出全长cDNA。
Southern blotting：
Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位 的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切 酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链 DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者 紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交， 用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含 量。
• 明显增加BD SMART RACE扩增的特异性 • 降落PCR的退火温度符合首次PCR循环的Tm 高于通用 引物的Tm 。 • 退火温度在随后降低到与通用引物相配合的程度，引起 特异性基因模版的指数和高效率的扩增。 • 当引物的T m>70°C时建议使用降落循环程序。
D. 巢式引物
在首次试验时，不要使用巢式PCR。混合的通用引物（ UPM）和基因特异引物（GSP）通常能得到较好的低的非 特异性背景的RACE产物。但是，巢式特异引物可以作为探 针在鉴定RACE产物的Southern blotting中使用。 此 外巢式PCR在使用特异引物进行5'- or 3'-RACE存在高 背景或高非特异性扩增时有必要使用。在巢式PCR中，使 用外侧引物进行一个初步的扩增，如果扩增产物模糊不清 ，可以使用内部引物重新扩增初步产物的一部分。BD SMART RACE 指南包括了可选的步骤，指明了巢式引物 能够被使用的地方。本试剂盒提供的通用巢式引物A 可用 于5'- and 3'-RACE。按照上述指南可以设计巢式特异引 物。巢式引物与外侧特异引物尽可能不重叠，如果因序列 有限而必须重叠，其内部引物的3'末端的序列也要尽可能 唯一。
产物 鉴定
cDNA 第 一链的合成
PCR 阳性对 照
cDNA末 端快速扩
增
SMART技术
原理：在合成cDNA的反应中事先加进的3’末端带
Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA 为模板合成cDNA，在到达mRNA的5’末端时碰到真核 mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成 的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo （dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA 的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物 作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样 得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引 物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链 后可以利用通用引物进行扩增。由于有5’帽子结构的 mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩 增得到的cDNA就是全长cDNA。
* 如果RNA是非人类的，可以跳过此步 † 如果特异引物不产生重叠可以跳过此步。
4. 每管内覆盖2滴矿物油，加 盖。
Note:.如使用热盖循环仪 则不必加矿物油。
5. 使用下列程序之一启动循环 仪， (programs 1 和 2 用于5'- 和 3'-RACE TFR 和 UPM Primers的阳性 对照)。依据所使用的是 poly A+ 还是总RNA来 选择正确的循环次数。
使用降落PCR)。 • 至少需要两个特异引物才能进行完整的BD SMART RACE：即
用于5'-RACE PCR的反义引物和用于3'-RACE PCR的正义引物。如果 只进行5'- 或3'-RACE则只需一个特异引物。引物长度在23–28个核苷 酸，长于30个核苷酸没有优势。模版、引物及RACE产物下图所示。

First-strand cDNA 合成
5'- & 3'-RACE PCR
另备物品
下列试剂需另外准备： 由于 SMART™ RACE cDNA Amplification Kit 没有PCR
polymerase，可以使用以下物品： Advantage 2 PCR Kit
(Cat.Nos.639206/639207) Advantage 2 Polymerase Mix
(Cat.Nos.639201/639202)
二、引物设计
A
B
C
引物 序列
引物在基 因上的位
置
降落 PCR
D
巢式 引物
A. 引物序列
特异引物(GSPs) 应当： • 23–28 个核苷酸 • GC含量为 50–70% • Tm 大于或等于65°C，如果Tm >70°C可获得最好的结果 (可
经典的RACE技术是Frohman等（1988）发明的 一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分 cDNA序列来得到完整的cDNA5'和3'端，包括单 边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展 和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性 差的缺点。
对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RTPCR技术的改进：
4.杂交、曝光、显影。
5. 与琼脂糖凝胶电泳照片进行对比。
6. 一旦得到了目的条带，使用NucleoTrap Gel Extraction Kit进行胶回收，分离DNA。
C. RACE产物的克隆和测序：
1. 使用Nuห้องสมุดไป่ตู้leoTrap GelExtraction Kit 进行RACE 产物 的回收和纯化，直接克隆到T/A类型的PCR 克隆载体上。
的结合所带来的影响；
2
在5' 端加尾时，采用poly（C），而不是poly（A）
采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血病毒（MMLV）反转录酶
3
或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温（60℃ -70℃）有效
地逆转录mRNA，从而消除了5'端由于高CC含量导致的
mRNA 二级结构对逆转录的影响；
采用热启动PCR （hot start PCR）技术和降落
B. Southern Blot Analysis
当RACE 产物有多条带时，用GSPs 或NGSPs制作探针进行 Southern blot 可以有把握地确认真正的RACE产物带。通常5'RACE 比 3'-RACE易出现多条带。
1. 琼脂糖凝胶电泳检测RACE 产物。
2. 照相、转尼龙膜。
3. 准备探针，探针内不能有GSP1 (or GSP2)的序列。可以将 NGSP1 (or NGSP2)进行末端标记。如果GSPs的5' 和 3'产物有重 叠，则可以用GSP2 做探针鉴定5'-RACE产物，用GSP1 做探针鉴定 3'-RACE产物。使用cDNA进行缺口翻译或随机引物扩增都可以制作 探针。
六 、RACE 产物的鉴定
RACE 产物的鉴定使用3种方法： (A) 对比用GSPs 和 NGSPs得到的RACE产物； (B) Southern blotting； (C) 克隆和测序。 A 和 B 需要巢式引物。
A. 对比用GSPs 和 NGSPs得到的RACE产物：
对于5'-RACE 反应，将UPM Mix 和 GSP1 得到的初 级扩增产物与UPM 和 NGSP1得到的扩增产物进行对比( 对于3'-RACE，将UPM和GSP2 与UPM 和 NGSP2的扩增产物进行对比)。当有多条扩增带时，巢式 引物的扩增带应当稍小些，其中一些带应当消失。 Note: 不要使用Nested Universal Primer A (NUP)。
四、 3'-RACE、5'-RACE基本原理
race定义：cDNA末端快速扩增技
术（rapid amplification of cDNA ends， RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中 快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以 其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的 重视。
RACE
4
PCR（touch down PCR）提高PCR反应的特异
性。
利用mRNA的3'末端的poly（A）尾 巴作为一个引物结合位点，以连有 SMART寡核苷酸序列通用接头引物的 Oligo（dT）30MN作为锁定引物反转录 合成标准第一链cDNA.然后用一个基因 特异引物GSP1（gene specific primer，GSP）作为上游引物，用一个 含有部分接头序列的通用引物UPM（ universal primer，UPM）作为下游引 物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循 环，把目的基因3' 末端的DNA片段扩 增出来。
SMARTTM 5'-RACE 的原理
5’ RACE流程图
五、cDNA 末端的快速扩增(RACE)
主要步骤：
1、PCR 反应混合液的准备：确保混合液体积足够所有的 PCR反应和一次额外的反应。该混合液用于5'- 和 3'RACE 反应。 对于50-µl PCR 反应，所混合的成份如下：