发色底物测定大曲中的-葡萄糖苷酶活力
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的量，并计算酶活力。酶活力单位定义为： 在上述分析条件下每分钟催化形成1μmol pNP所需要的酶量为一个活力单位。
计算
酶活力= (A×n)/(V×t) 式中 V—酶液量（ml）； n—酶液稀释倍数； t—反应时间（min）。
注意事项
如反应进行得太快，应适当减少大曲浸提 液的加入量；反之则增加。
仪器、原料和试剂
1．仪器：722型分光光度计、恒温水浴锅、移液管2ml一 个、试管、试管架等。
2．原料：大曲浸提液 3. 试剂：
（1）1.25mol/L对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷（pNPG）溶 液：75.2mg pNPG溶于200ml 0.05mol/L乙酸缓冲液（pH5.6）中；
（2）4mmol/L对硝基苯酚（pNP）溶液：111.3mg pNP 溶于200mL 0.05mol/L乙酸缓冲液（pH5.6）中。
发色底物测定大曲中的 α-葡萄糖苷酶活力
实验目的
掌握利用发色底物测定α-葡萄糖苷外切酶 活力的方法。
进一步理解酶活力的定义和计算方法。
实验原理
淀粉酶是水解酶类的一大亚类，是能够分解淀粉 糖苷键的一类酶的总称。其酶活力的计算多采用 测定产物还原糖含量的方法。但由于淀粉酶包括 的四种酶（α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-1，4-葡萄糖苷 酶、异淀粉酶）水解产物都是还原糖，所以还原 法无法准确测定单一酶活力。而发色底物法可以 解决这一难题，因为它是在糖苷配基上联接了一 个生 色基团。α-葡萄糖苷酶（俗称糖化酶）活力 的测定如果以无色的对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷 （pNPG）作反应底物，经α-葡萄糖苷酶水解α-1， 4-葡萄糖苷键后释放 出对硝基苯酚（pNP），在 碱性条件下后者是黄色的，最后通过监测405或 410 nm下的pNP 产生量作为α-1，4-葡萄糖苷酶活 性大小的判定标准。
（3）0.05mol/L乙酸缓冲液（pH5.6）：16.4g 乙酸钠加 12ml 乙酸，定容至1000ml；
（4）1mol/L碳酸钠溶液。
实验步骤
1. 制作对硝基苯酚标准曲线 按下表分别取不同体积的对硝基苯酚
（4mol/L），用50mmol/L乙酸缓冲液 （pH5.6）稀释成一系列浓度。然后在分 光光度仪上测定410nm处的光密度，以浓 度为横坐标，光密度为纵坐标作曲线。
编号 pNP浓度/（mol/L）
pNP加入量/ml 水加入量/ml 碳酸钠加入量/ml
A410
1
2
3
4
5
6
0
4
12 24 36 60
0 0.01 0.03 0.06 0.09 0.15
1.0 0.99 0.97 0.94 0.91 0.85
2
2
2
2ຫໍສະໝຸດ Baidu
2
2
2．α-1，4-葡萄糖苷酶活力的测定
取0.8ml对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷 (pNPG)(1.25mmol/L),加入0.2ml大曲浸提液， 迅速混匀后于40℃水浴中保温10min，去出 并立即加入2ml 1mol/L的碳酸钠溶液终止反 应，用分光光度计测定410nm波长处的光密 度，在标准曲线上查出相当于对硝基苯酚
思考题
在实验中为什么要做空白测定？并分析实 验误差？
淀粉酶的组分有哪些，其性质是什么？
计算
酶活力= (A×n)/(V×t) 式中 V—酶液量（ml）； n—酶液稀释倍数； t—反应时间（min）。
注意事项
如反应进行得太快，应适当减少大曲浸提 液的加入量；反之则增加。
仪器、原料和试剂
1．仪器：722型分光光度计、恒温水浴锅、移液管2ml一 个、试管、试管架等。
2．原料：大曲浸提液 3. 试剂：
（1）1.25mol/L对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷（pNPG）溶 液：75.2mg pNPG溶于200ml 0.05mol/L乙酸缓冲液（pH5.6）中；
（2）4mmol/L对硝基苯酚（pNP）溶液：111.3mg pNP 溶于200mL 0.05mol/L乙酸缓冲液（pH5.6）中。
发色底物测定大曲中的 α-葡萄糖苷酶活力
实验目的
掌握利用发色底物测定α-葡萄糖苷外切酶 活力的方法。
进一步理解酶活力的定义和计算方法。
实验原理
淀粉酶是水解酶类的一大亚类，是能够分解淀粉 糖苷键的一类酶的总称。其酶活力的计算多采用 测定产物还原糖含量的方法。但由于淀粉酶包括 的四种酶（α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-1，4-葡萄糖苷 酶、异淀粉酶）水解产物都是还原糖，所以还原 法无法准确测定单一酶活力。而发色底物法可以 解决这一难题，因为它是在糖苷配基上联接了一 个生 色基团。α-葡萄糖苷酶（俗称糖化酶）活力 的测定如果以无色的对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷 （pNPG）作反应底物，经α-葡萄糖苷酶水解α-1， 4-葡萄糖苷键后释放 出对硝基苯酚（pNP），在 碱性条件下后者是黄色的，最后通过监测405或 410 nm下的pNP 产生量作为α-1，4-葡萄糖苷酶活 性大小的判定标准。
（3）0.05mol/L乙酸缓冲液（pH5.6）：16.4g 乙酸钠加 12ml 乙酸，定容至1000ml；
（4）1mol/L碳酸钠溶液。
实验步骤
1. 制作对硝基苯酚标准曲线 按下表分别取不同体积的对硝基苯酚
（4mol/L），用50mmol/L乙酸缓冲液 （pH5.6）稀释成一系列浓度。然后在分 光光度仪上测定410nm处的光密度，以浓 度为横坐标，光密度为纵坐标作曲线。
编号 pNP浓度/（mol/L）
pNP加入量/ml 水加入量/ml 碳酸钠加入量/ml
A410
1
2
3
4
5
6
0
4
12 24 36 60
0 0.01 0.03 0.06 0.09 0.15
1.0 0.99 0.97 0.94 0.91 0.85
2
2
2
2ຫໍສະໝຸດ Baidu
2
2
2．α-1，4-葡萄糖苷酶活力的测定
取0.8ml对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷 (pNPG)(1.25mmol/L),加入0.2ml大曲浸提液， 迅速混匀后于40℃水浴中保温10min，去出 并立即加入2ml 1mol/L的碳酸钠溶液终止反 应，用分光光度计测定410nm波长处的光密 度，在标准曲线上查出相当于对硝基苯酚
思考题
在实验中为什么要做空白测定？并分析实 验误差？
淀粉酶的组分有哪些，其性质是什么？