南极假丝酵母脂肪酶B的修饰与改造

基因组学与应用生物学，2011年，第30卷，第2期，第243－250页

Genomics and Applied Biology,2011,Vol.30,No.2,243－250

评述与展望

Review and Progress

南极假丝酵母脂肪酶B的修饰与改造

章素平柳志强郑裕国*

浙江工业大学生物工程研究所,杭州,310014

*通讯作者,zhengyg@

摘要南极假丝酵母脂肪酶B是用途最为广泛的脂肪酶之一，可用于许多有机化合物、医药中间体等的合成。为了改善南极假丝酵母脂肪酶B的催化性能，提高其环境适应性，同时提高蛋白的表达量，降低生产成本，从而使其更适于工业化应用，许多针对酶蛋白分子的修饰及改造方法已在南极假丝酵母脂肪酶B中得到大量应用。本文从化学修饰、理性设计和非理性设计3个方面详细综述了南极假丝酵母脂肪酶B的修饰与改造的关键技术，包括定点突变、蛋白质融合、易错PCR和DNA改组等，同时也介绍了以上技术在改良南极假丝酵母脂肪酶B特性方面的诸多成功实例。

关键词南极假丝酵母脂肪酶B,化学修饰,理性设计,非理性设计

Research Progress of Modification for Candida antarctica Lipase B

Zhang Suping Liu Zhiqiang Zheng Yuguo*

Institute of Bioengineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou,310014

*Corresponding author,zhengyg@

DOI:10.3969/gab.030.000243

Abstract Candida antarctica lipase B is one of the most widely used lipases,which has been used for the synthe-sis of many organic compounds,and pharmaceutical intermediates.In order to improve the catalytic properties of Candida antarctica lipase B,enhance its environmental adaptability for industrial applications,increase its yield and reduce production costs,many modified methods have been widely applied.This paper elaborates on the tech-nologies for modification of Candida antarctica lipase B from three aspects:Chemical modification,rational de-sign and irrational design,such as site-directed mutagenesis,protein fusion,error-prone PCR,DNA shuffling,and then presents their application and achievements in improving the properties of Candida antarctica lipase B. Keywords Candida antarctica lipase B,Chemical modification,Rational design,Irrational design

脂肪酶(1ipase,EC3.1.1.3)即三酰基甘油酰基水解酶，是一种特殊的酯键水解酶，它可以在油水界面上催化油脂的水解反应，生成脂肪酸和甘油、甘油单酯或二酯(Jaeger et al.,1994;Joseph et al.,2008)。脂肪酶通常被用于在非水相体系中催化油脂及其它一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成等反应(Rufinoa et al.,2010;Rejasse et al., 2003;Yang et al.,2009)。由于其高效专一、反应条件温和等特点，已有越来越多的脂肪酶在油脂加工、造纸、食品、医药和日化等行业中得到应用(Hasan et al., 2006;Salameh and Wiegel,2007)。

脂肪酶广泛存在于动物、植物和微生物中，在脂质代谢中发挥着重要的作用。由于微生物具有种类多、生长繁殖快及易发生遗传变异的特点，微生物源脂肪酶比动、植物源脂肪酶的性质更具多样性(如更广的作用pH范围、作用温度范围以及作用底物多样性等)，更加适合于工业化生产。因此，微生物是工业用脂肪酶的重要来源(Hasan et al.,2006;Salameh and Wiegel,2007)。其中，南极假丝酵母脂肪酶B (Candida antarctic lipase B,CALB)应用最为广泛，它对水溶性和非水溶性物质都表现出较高的催化活性。目前，对CALB的研究较为透彻，包括其氨基酸序列、立体三维结构和催化机理等都已获得解析，同时该酶的基因也已成功实现了克隆表达。但是，天然的CALB仍存在一定的缺陷，如热稳定性较差、产量较低等，使其在生产实践中的应用受到一定限制，因此，为改善CALB相应的酶学特性，提升催化能力，提高其反应稳定性，研究人员采用蛋白质工程手段，

基因组学与应用生物学

Genomics and Applied Biology

对CALB进行修饰与改造，以获得更适应工业生产条件的生物催化剂。本文详细介绍了CALB的修饰与改造的研究进展及其相关应用。

1CALB的简介

人们通常从极端环境中筛选具有极端性质(如耐高、低温,高、低pH,高盐浓度,高压力,高辐射等)的生物催化剂，南极假丝酵母(Candida antarctic)就是从南极洲样品中筛选到的一株具有特殊性质的酵母菌，它可以产生2种性质完全不同的脂肪酶，分别为

脂肪酶A(Candida antarctic lipase A,CALA)和脂肪酶B(CALB)(Kirk and Christensen,2002)。与CALA 相比，CALB的分子量小，热稳定性较差，蛋白等电点较低(pI=6.0)(Patkar et al.,1993)，但CALB的催化活性更高，在生物催化过程中所需酶量远远少于CALA(de Maria et al.,2005)，因此，截至目前，CALB 的应用更为广泛，且已经由诺维信公司作为产品(Novozymes435)实现商业化生产。1994年，Uppenberg 等(1994a;1994b)人测定出CALB的氨基酸序列及其三维立体结构，如图1所示。CALB由317个氨基酸残基组成，分子量为33kD，与其它脂肪酶的氨基酸序列对比发现它们之间没有明显的同源性。CALB 的结构是一典型的α/β水解酶类似折叠，活性位点位于蛋白结构的中心，由催化三联体Serl05－Asp187－His224、1个氧负离子洞及1个特异性底物结合口袋构成。在CALB的活性位点附近具有一段保守序列Thr-x-Ser-x-Gly，与大多数脂肪酶不同的是CALB活性中心没并有被螺旋片断(又称为“盖子”)埋藏，因此，CALB无界面活性(Martinelle and Hult,1995;Rottic ci-Mulder,2003)。

CALB是一种丝氨酸水解酶，它的催化机理是双乒乓机制(Martinelle and Hult,1995;Ottosson,2000)，该机制可以分为酰化和去酰化两步。第一步，底物S1作为酰基供体进入酶的活性位点形成不稳定的中间体CALB-S1，继而释放出产物P1形成酰化CALB'；第二步，底物S2作为亲核试剂进入活性位点使CALB'去酰化，并生成产物P2，同时CALB恢复为自由态(图2)。其中，可以与CALB反应的酰基供体很多，譬如酸、酯、硫酯和碳酸盐等。而第二步中的亲核试剂也有多种，包括醇、氨基酸和半缩醛等。

为了研究CALB的性质及提高产量，自1995年以来，CALB实现了在不同宿主中的克隆表达，如：米曲霉(Aspergillus oryzae)(H覬egh et al.,1995)、毕赤酵母(Pichia pastoris)(Rotticci-Mulder et al.,2001)、

酿图2CALB的催化机理

Figure2The catalysis mechanism of CALB

酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Han et al.,2009)和大肠杆菌(Escherichia coli)(Rotticci-Mulder,2003)等。CALB的克隆、表达为其修饰与改造奠定了良好的基础。总之，CALB具有非常广阔的底物谱，无论在酶学理论研究还是实际工业应用中，它都是一种广泛应用的生物催化剂。因此，在清楚CALB分子结构及催化机理的基础上，对CALB进行修饰与改造具有一定的理论和现实意义。

蛋白质工程指以蛋白质分子结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过对蛋白本身和其基因进行有目的地修饰和合成，对现有蛋白质进行定向设计和改造以构建新型蛋白质的过程(刘仲敏等,2004)。酶分子水平上的修饰与改造都是蛋白质工程研究的范畴。随着人们对蛋白质改造能力的增强，以及CALB 应用的广泛性，关于修饰和改造CALB以适应特定的工业催化过程的研究逐渐成为热点。目前，对CALB的修饰与改造可以归纳为3个方面：一是利用化学物质对酶分子的自由氨基酸残基进行修饰和改造，即化学修饰；二是基于已知序列和结构的理性设计；三是利用基因的可操作性，模拟自然界演化进程的非理性设计(孙志浩,2005)。

2CALB的化学修饰

蛋白质分子的完整空间结构决定其生物催化剂图1CALB的三维立体结构(PDB ID:1TCA)

Figure1The3D structure of CALB(PDB ID:

1TCA)

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