如何选择色谱柱

如何选择色谱柱，比较一下C-18及C-8柱的硅烷基质

C-18和C-8硅烷色谱柱是高效液相色谱（HPLC）中最常使用的色谱柱，而且，在美国市场上有多于100种C-18和C-8色谱柱出售。面对这么多可供选择的色谱柱，分析工作者很难从中选出适当的色谱柱来具体使用，同时更难选择出一根合适的替换柱。

对于非极性样品（如小分子芳烃）或弱极性样品（如对羟基苯甲酸酯），C-18和C-8色谱柱是最容易选择的。对于这类样品，色谱柱之间的主要差异在于保留因子（k）；而在选择性方面却只有微小的差异。但对于极性和中等极性样品色谱柱的选择却相当困难。例如含氨基或酸性基团的药物化合物。分析工作者会发现极性样品在保留时间、选择性和峰形都有很大的差别。

色谱柱的选择性和峰形受到担体硅胶的影响远大于键合相的影响。另外，有研究报道在反相色谱中表面硅烷醇、硅酸及金属杂质的影响。在特殊情况下，选择性的差异可由填料制备时使用的键合过程决定的。

通常情况下，色谱工作者选择HPLC色谱柱是通过比较由色谱柱供应商所提供的填料介质的规格来决定的。这些规格内容包括：表面积、末端封尾、含碳量、颗粒形状、颗粒尺寸、孔径、孔容积、装填密度和键合度。含碳量和键合度仅由色谱制造商提供，没有这些规格使用者不可能计算出碳的克数，也不可能计算出一根色谱柱中键合相的微分子数。分析工作者可使用这两个数据来估计一根色谱柱的疏水性质。然而，即使制造商提供所有上述规格数据，使用者也不可能精确地预测出色谱柱对含有极性官能团的化合物的选择性。

由于色谱的保留时间是基于分析物和填充基质之间许多微妙的相互作用，我们建议使用混合物测试来比较填充基质的规格与性能。Engelhardt 和他的同伴回顾了硅烷反相色谱的特性，并且提出用溶解物试验来描述固定相的疏水性和亲硅基醇特性。另外有一些人也改进了测试条件和方法来解释那些色谱数据，但他们只测试了很少的商品色谱柱，并且在他们的测试混合物中没有羧酸。在本文中，我们使用了一个含有羧酸的测试混合物来收集了86根C-18和C-8硅烷色谱柱（见表1）的数据。我们将测试结果详细描述如下。表1：研究中所使用的色谱柱的生产商(略)。

在我们的比较中，我们使用了含有6种物质的测试混合物，此6种物质列于图1。每一种物质在测试混合物中都起特殊的作用。尿嘧啶是用于产生空体积。甲苯是测试色谱柱的疏水性。吡啶和N，N-二甲基苯胺是用来测试硅醇基对碱性物质的活性的碱性胺类物质。苯酚是一种弱酸，用于与吡啶联合起来确定活性担体硅的数量。4-正丁基苯甲酸是一种用于测试硅醇基对酸性物质的活性羧酸，此方面是色谱柱制造者开发碱性去活色谱柱来作胺类物质分析时经常忽略的。

我们使用的流动相是含有65%的乙腈和35%的浓度为0.05M的磷酸钾混合溶液，pH值为3.2。pH=3.2的缓冲溶液可使4-正丁基苯甲酸质子化，同时可提高吡啶和N，N-二甲基苯胺的保留时间的重现性。我们发现使用没有加缓冲溶液的流动相，如65%乙腈和35%水，即使我们使用同一瓶流动相，也无法得到重现性较好的保留时间和峰形。高离子强度的缓冲溶液，如本次测试所使用的0.05M的缓冲溶液，会抑制一些硅醇基的活性（2，5），但对于将胺从一些非碱性去活的反相色谱柱中洗脱下来，有一些抑制作用是必要的。

我们测试过另外两种缓冲溶液，但它们的作用均少于pH=3.2的0.05M磷酸钾溶液。0.01M 磷酸钾缓冲溶液在pH=3.2时，胺类化合物在有些色谱柱中产生前移峰。0.05M磷酸钾缓冲溶液在pH=7时，胺类物质产生的峰形比在pH=3.2时更好。吡啶和N，N-二甲基苯胺的pKa 均大约为5.2；因此，这些组分在pH=7时未质子化并且呈中性，同时并不与强酸性的硅醇基发生离子交换作用。

液相色谱柱原理

与液相色谱柱的性能相关的因素很多，基质（matrix）或者说担体、载体的化学性质、键合相（固定液）的化学性质、填料形状大小粒度分布、碳量和键合度等等。

色谱柱填料可以由基质直接构成，如硅胶、氧化铝、高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或者甲基丙烯酸酯等等；也可以在这些基质的基础上涂布或化学键合固定液来构成，如：最经典的各种ODS柱、氨基柱、氰基柱等。

一、我们先来看看各主要基质的特点：

1、硅胶

硅胶是陶瓷性质的无机物基质，刚性大，不易变形。化学性质较稳定，但对于水溶液尤其碱性水溶液仍然是不稳定的，即使表面经过良好的化学键合，覆盖了固定液，还是要注意水、碱性溶液、酸性溶液对硅胶的溶解作用，基质或者说是柱床（packed bed）溶解对色谱柱的影响是致命的。以硅胶为基质的填料构成了目前绝大多数的色谱柱填料。纯硅胶填料适宜分离溶于有机溶剂的极性、弱极性的非强离解型的化合物，硅胶也可以做凝胶色谱但柱效较低。硅胶基质键合固定相的高压液相填料，有其他填料无法比拟的高分离效能。

2、二氧化铝

二氧化铝和硅胶相似，但对水溶液、酸性碱性水溶液溶液更加不稳定。所以，极少用作键合固定相的基质，也是适宜分离溶于有机溶剂的极性、弱极性的非强离解型的化合物，尤其是分离芳香族碳氢化合物。酸性易离解的化合物容易在二氧化铝上形成死吸附。另外，氧化铝分离几何异构体能力优于硅胶。

3、聚合物填料

聚合物基质受压会变形，压力限度低但pH使用范围宽。苯乙烯-二乙烯苯基质疏水性强，使用任何流动相，在整个pH范围内稳定，可以用强酸、强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸酯基质比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更强，但可以通过适当的功能基修饰变成亲水性的。由于不耐压、有溶胀性，所以聚合物填料适宜用于大分子像蛋白质或合成的高聚物，另外还可以制成分子排阻、离子交换柱。近年发展迅速的大孔树脂，实际上主体就是苯乙烯-二乙烯苯聚合物或类似的合成高聚物。

由于硅胶基质的绝对地位，以下主要以硅胶为例。

二、形状大小粒度分布

基质要成为填料，首先要制成合适的形状和大小。硅胶形状有：薄壳型、无定形全多孔、球形全多孔，另外还有先做成微珠再堆积成球形全多孔的。通常只说不定形、球形。无定形全多孔的填料容易制备、价格低、粒度分布较均匀，但涡流扩散大，渗透性差，比较难填装出稳定的柱床，一般用来做制备柱。球形全多孔填料涡流扩散小，渗透性好；如果是硅胶先做成珠子再堆积而成的话，具有传质阻抗小、载样量大的优点，柱效也更高。球形填料外形对称，比较容易填出稳定的柱床。填料的大小一般不能直接测量，因为填料粒度有一定分布范围，一般给出的大小只是用一定方法测得的表观大小。填料大小与柱效、柱压的关系为：柱效与填料大小成反比，柱压与填料大小的二次方成正比。所以，快速分析柱使用3微米粒度的填料、一般做成5厘米长，就是为了降低柱压；需要注意到降低粒度所得到的柱效增加跟不上柱压的增加快。

基质做成合适的形状和大小后，可以通过各种化学修饰（modified）的手段，获得各种不同选择性的填料。有时候，我们增加柱长、降低填料粒度都无法把一个化合物分离的更好，这时候就要考虑使用选择性更好的填料。

三、碳量和键合

硅胶主要通过表面的极性硅醇基保留极性分子，属于正相分离模式。通过硅烷化技术，可以把各种不同性质的功能团（functional group）建合到硅胶表面，例如：键合十八烷基（ODS，octadecyl silane）、辛烷基、甲基、苯基增加对非极性物质分子的保留，构成反相色谱；键合