组织工程半月板的研究进展

【中图分类号】Ｑ８１３．１＋２【文献标识码】Ｂ【文章编号】 １６７３－０３６４（２００９）０３－０１６６—０５
软骨是高等动物体内一种无血管的致密结缔组织，由位 于软骨陷窝内的软骨细胞和细胞外基质构成。根据构成软骨 的细胞外基质成分的不同．软骨分为透明软骨、弹性软骨和 纤维软骨。纤维软骨组织存在于椎问盘、耻骨联合、半月板、 颞下颌关节关节盘以及肌腱与骨的附着部位等处。纤维软骨 的细胞外基质中含有大量呈平行或交叉排列的由Ｉ型胶原 构成的胶原纤维束，软骨细胞单个、成对或成单行排列，分布 于纤维束之间，基质中无定形成分。
组织工程的发展为半月板缺损的治疗提供了新的思路， 成为基础和临床研究的热点。基于组织工程原理的治疗措施 包括：应用种子细胞促进半月板损伤的愈合；应用天然或人 工合成的半月板假体替代切除的半月板组织；体外构建组织 工程化半月板，然后植入体内，实现半月板的再生。本文就组 织工程半月板研究的现状进行综述。
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Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｊｕｎｅ ２００９，Ｖ０１．５ Ｎｏ．３
·。皇综不述Ⅺ＝·。
ｄｏｉ：ｌＯ．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－０３６４．２００９．０６．０１５
组织工程半月板的研究进展
赵贵庆崔磊 曹谊林
胚胎干细胞具有无限增殖能力和全能分化潜能。体外研 究显示，胚胎干细胞在一定的诱导条件下．可以表达Ｉ型胶 原、Ⅱ型胶原和ＧＡＧ。表现出向纤维软骨分化的特性嘲。但由 于受到医学伦理等的制约，目前尚缺乏进一步的研究。
成纤维细胞是源于中胚层的一种间质细胞．其广泛存在于
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机体的各种组织中，被认为是具有组织特异性的背景细胞嗍。 真皮成纤维细胞是皮肤中含量最为丰富的一种细胞。它表达 Ｉ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ型胶原和透明质酸、弹性蛋白、多能蛋白聚 糖（Ｖｅｒｓｉｅａｎ）、核心蛋白多糖（Ｄｅｃｏｒｉｎ）以及层黏连蛋白等ＤＩＩ。
于细胞具有旺盛的体外增殖能力和定向分化特性，因而 成为了众多学者的研究方向。骨髓基质干细胞（ＢＭＳＣ）是一 种成体干细胞，容易获得，可以体外扩增、定向（多向）诱导分 化。ＴＧＦ一１３是诱导ＢＭＳＣ向软骨细胞分化的重要生长因子， 单层培养条件下，２周后表达Ⅱ型胶原１２１Ｊ。应用ＴＧＦ—Ｂ诱导 的ＢＭＳＣ可以修复猪关节非负重区的软骨缺损．表达软骨特 异的细胞外基质成分阎。从骨髓中分离的单核细胞注射于半 月板裂伤部位，可以促进半月板损伤的愈合闻。ＢＭＳＣ可以在 半月板的无血管区存活，并产生细胞外基质｛Ｌ．Ｓｌ，在支架材料上 体外三维培养较半月板纤维软骨细胞在相同条件下能产生 更多的胶原和ＧＡＧｌ硐。Ａｎｇｅｌｅ等口Ｉ用兔的自体ＢＭＳＣ作为种 子细胞．接种于透明质酸酯和凝胶构成的支架材料上，体外 培养２周．回植入内侧半月板中份５ ｍｍ的缺损处，回植后 １２周，实验组明显优于单纯支架对照组，有纤维软骨样组织 形成。徐青镭等［２６．－２７１应用兔的ＢＭＳＣ作为种子细胞，在体外扩 增并用ｂＦＧＦ和ＴＧＦ一１３１诱导，然后接种于胶原一ＧＡＧ支架 上植入体内．术后３—６个月，形成纤维软骨样组织，有软骨陷 窝形成，细胞外基质中有大量平行分布的胶原纤维柬和酸性 黏多糖。虽然ＢＭＳＣ有自发成骨的倾向，体内实验中发现有 部分新生的纤维软骨内有肥大软骨细胞和骨形成［ＺＳｌ，但是应 用适当的诱导方案．ＢＭＳＣ是较有临床可行性的组织工程纤 维软骨种子细胞。
来源于天然胶原的生物材料具有良好的组织相容性、低 抗原性、生物可降解性ｎ．在制药和生物材料领域得到了深入 研究和广泛应用．并已有多种胶原产品得到批准而用于临 床。胶原半月板支架材料也是研究最为成熟的半月板替代 物。未交联的胶原支架材料较化学交联后的支架材料具有更 好的生物相容性阐．植入半月板缺损部位后可吸引关节内的 细胞浸润生长．最终可以形成纤维软骨组织嗣。由Ｉ型胶原、 硫酸软骨素和透明质酸复合生产的胶原半月板植入物 （ＣＭＩ），已应用于临床。ＣＭＩ表现出良好的治疗效果，形成了 纤维软骨组织阐．明显改善了患者膝关节的症状，延缓了关节 软骨的退行性改变。将ＣＭｌ接种上羊的自体半月板细胞修复 半月板全缺损模型．结果显示实验组新生半月板在血管化、 塑形、基质含量等方面优于未接种细胞的对照组１１０１。徐青镭等 吲应用胶原一糖氨聚糖支架负载骨髓基质干细胞修复自体半 月板缺损。形成了半月板样纤维软骨组织。
基于上述因素的考虑．已有多种生物材料被用于组织工 程半月板的构建研究。其中，天然生物材料包括纤维凝块、骨 膜、软骨膜、肌腱、小肠黏膜下层、胶原制品以及灭活的同种 异体半月板组织。纤维凝块是最早应用于半月板的生物材 料．Ａｍｏｃｚｋｙ等嗍于１９８６年应用外源性的Ｆｉｂｒｉｎ ｂｌｏｔ修复狗 的半月板撕裂模型。１９９０年，Ｈｅｎｎｉｎｇ等唧悔该技术用于临床． 在术中获取患者的自体血，体外形成凝块后．注射在半月板 撕裂处以促进损伤的愈合。进一步的研究表明．半月板细胞 可以向纤维凝块内迁移，并合成细胞外基质［１５１．半月板纤维软 骨细胞与纤维凝块混合可以在体内促进半月板损伤的愈合即。 骨髓基质干细胞也可以在纤维凝块内存活并增殖，体内实验 显示能促进新生半月板样组织的形成阁。骨膜组织植入半月 板缺损区后不能形成纤维软骨组织，而是形成一个覆盖着透 明软骨组织的楔形骨组织嗍。这显然与骨膜中含有的大量成 骨细胞有关，在关节内环境中表现为软骨内成骨的过程。而 自体肋软骨膜植入半月板全缺损模型后，可以形成纤维软
作者单位：４１００００湖南省长沙市亚韩医学美容医院（赵贵 庆）；２００２３５上毒市上海组织工程研究与开发中心（崔磊．曹谊 林）。
万方数据
１ 种子细胞
理想的组织丁程半月板种子细胞，应来源于自体细胞， 分布广泛、取材方便、对机体损伤小．体外增殖能力强并不易 老化。且能产生大量的细胞外基质。
半月板纤维软骨细胞是最早被研究用来作为种子细胞 的。Ｗｅｂｂｅｒ等１４］于１９８５年首次报道了半月板纤维软骨细胞 体外培养和增殖的特性，并根据细胞的形态．提出半月板纤 维软骨细胞是是由两类性质不同的细胞构成。半月板纤维软 骨细胞在体外无支架、高密度培养条件下．并不像透明软骨 细胞那样可以形成软骨组织，形成的组织类似于半月板的纤 维结缔组织部分．仅有少量的蛋白多糖和Ｉ型胶原的分泌１５－６１。 纤维软骨细胞与Ｉ型胶原支架材料复合在体外培养３周后， 支架内部的细胞呈圆形或椭圆形，细胞周围有基质形成，但 未见有软骨陷窝结构的形成１７１。但是将其接种在ＰＧＡ支架或 藻酸钙凝胶中，细胞材料复合物可以在裸鼠皮下形成纤维软 骨样组织旧。应用半月板纤维软骨细胞作为种子细胞接种支 架材料修复半月板全缺损或部分缺损的实验显示，细胞材料 复合物在体内３－６个月后能形成与正常半月板组织相似的 纤维软骨组织。具有半月板的白区和红区的组织学特征［９－”Ｉ。 研究所用的细胞都是从幼年动物的半月板中分离培养的，其 增殖和产生细胞外基质的能力较强。大多数半月板损伤的病 人是成年人。其半月板源性纤维软骨细胞的ＧＡＧ和胶原合 成能力以及体外增殖能力随着年龄增长而显著降低陋－４。体 外培养的半月板细胞随着扩增倍数的增加其成软骨的能力 逐渐减弱，体外扩增３４代后，细胞仅合成Ｉ型胶原而不合 成Ⅱ型胶原，表现为成纤维细胞的特性【ｍ。采用自体半月板细 胞要求患者接受两次手术．第一次用开放手术或关节镜取出 受损的半月板组织用于种子细胞的分离培养。经过一段时间 的体外培养．形成可回植的组织工程半月板后，再次手术惨 复半月板的缺损，整个治疗周期较长，而且从患者的损伤半 月板中分离的纤维软骨细胞数量有限。难以满足组织工程半 月板构建对种子细胞量的需求悯。应用同种异体半月板纤维 软骨细胞修复兔半月板缺损的实验表明．在回植后６．１０周 后，植入物有少量的炎性细胞浸润，３６周后形成类似半月板的 纤维软骨组织，植入物周围没有明显的炎性肉芽组织形成ｌｌｑ。
关节软骨细胞是组织工程化软骨构建中研究得最多的 种子细胞。关节软骨细胞在体外单层培养扩增期间．细胞逐 渐表达Ｉ型胶原，表达Ⅱ型胶原的能力下降，而这正是纤维 软骨细胞区别于透明软骨细胞的特点之一。透明软骨细胞在 体外三维培养条件下能产生６倍于纤维软骨的ＧＡＧ．其胶原 的合成能力也强于后者【１７１。Ｐｅｒｅｎｉ等旧将猪的关节软骨细胞 作为组织工程半月板的种子细胞．接种在灭活的同种异体半 月板材料上修复自体半月板缺损．９周后实验组有愈合的表 现．而对照组无一愈合。Ｗｅｉｎａｎｄ等１１９ｌ将猪的关节软骨细胞和 耳软骨细胞体外分离扩增后．接种在Ｖｉｃｒｙｌ ｍｅｓｈ支架上。植 入自体或异体半月板无血管区的圆形缺损处（直径ｌ ｃｍ）．１２ 周后不论自体还是异体缺损都得到很好的修复。但是，关节 软骨细胞在体外扩增后会去分化为仅分泌Ｉ型胶原的细胞 表型，ＧＡＧ的合成能力也明显降低闻；另外。关节软骨的获取 需要损伤功能上更为重要的关节面，因此关节软骨细胞将不 会被作为组织工程化纤维软骨的种子细胞而应用于Ｉ临床。
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骨样组织，组织学形态与正常半月板极为相似嗍。脂肪细胞酗、 肌腱细胞鹪在关节内也会形成纤维软骨样组织，而且对关节 软骨有一定的保护作用。但是这些组织的力学强度有限，植 人早期不能承载膝关节内的压力强度，往往导致半月板的内 侧缘不能形成，对关节软骨的保护作用有限，以致远期都会 产生骨关节炎的症状。
２支架材料
理想的半月板支架材料应当具有良好的生物相容性和 生物可降解性．而且应当有提供细胞黏附生长和产生细胞外 基质的空间结构．营养物质在支架中的扩散效率能提供相对 稳定的适宜的细胞代谢所需的化学环境。能结合细胞生长所 需的刺激性或抑制性细胞因子。另外，支架材料要具有一定的 机械强度，能适应关节内的力学条件而保持结构的完整性日。
半月板是膝关节内两块呈新月形的纤维软骨组织，对膝 关节的正常功能有至关重要的作用．它能传导并分散应力至 胫骨平台、吸收震荡、提高膝关节的稳定性、增加膝关节运动 幅度并促进关节液循环【Ｉｌ。半月板损伤是骨科的常见病，多由 剧烈运动甚至不恰当的负重引起。半月板的外侧１／３有来自 关节囊的血管滋养，发生在这一区域的损伤具有一定的自我 修复能力：发生于内侧区的损伤由于没有血运。其自我修复 能力差，损伤往往不能愈合。从而引起疼痛和功能障碍，影响 患者的工作生活。远期的病理的改变主要是关节软骨的退行 性改变．表现为骨关节炎的症状［２ｔ。目前．越来越多的外科医 生认识到半月板对于膝关节功能的重要性．针对的治疗措施 是以尽可能地保留半月板为原则采用半月板修复术。无法修 复的半月板常被部分或全部切除。这种措施虽然可以暂时缓 解疼痛．但并不能逆转或阻止关节软骨退行性改变的发生。 对半月板全切术后的患者采用同种异体半月板移植是一种 可能的选择。对延缓关节软骨退行性改变的发生有一定的作 用。但是，同种异体半月板移植供体有限，存在着疾病传播的 可能．且半月板的形态个体之间存在差异．随访发现移植后 的半月板有收缩的趋势ｌ司。
真皮成纤维细胞在一定的培养条件和诱ຫໍສະໝຸດ Baidu因子作用下
可以向骨阎、软骨ｆ１３－－Ｏｌ、成肌纤维细胞【蝴、角膜基质细胞阳分
化．表现出多潜能分化的特性。成体皮肤成纤维细胞经过胰 岛素预处理后．接种在有聚集蛋白多糖涂层的培养皿上。能表 达更多Ⅱ型胶原和Ａｇｇｒｅｃａｎ阳。人皮肤成纤维细胞在含有脱钙 骨粉的胶原三维支架中培养。具有向软骨分化的趋向ｐ蹦＾ｌ一习。 低氧环境有助于成纤维细胞分泌软骨特异的细胞外基质旧。 在低氧条件下当培养液中含有４０ ｍＭ的乳酸时可以诱导其 表达软骨特异的细胞外基质ｉｆ３１。低氧和蛋白激酶Ｃ阻滞剂联 合作用。可以使成纤维细胞分泌软骨细胞表型的基质１４７１。应用 ＳＯＸ５、ＳＯＸ６、ＳＯＸ９联合转染人皮肤成纤维细胞３ ｄ内即有 Ⅱ型胶原和Ａｇｇｒｅｃａｎ表达哪。人的真皮成纤维细胞与猪的软 骨细胞在三维条件下共培养．形成软骨样组织，一部分真皮 成纤维细胞转分化为软骨细胞嗍。本实验室早期的研究发现。 人的皮肤成纤维细胞在软骨源性形态发生蛋白一ｌ（ｃＤＭＰ－Ｉ）的 作用下能分泌软骨特异的细胞外基质（Ⅱ型胶原和Ａｇｇｒｅｃａｎ）； 在高密度无支架三维培养条件下。软骨细胞的表型可以长期 维持【捌。皮肤成纤维细胞取材简便、继发损伤小、体外增殖合 成能力旺盛、经多次传代仍保持较好的增殖能力，是一种较 理想的构建组织工程半月板的种子细胞。
组织工程与重建外科杂志２００９年６月第５卷第３期
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该结果提示，半月板组织尤其是半月板的内侧无血管区可能 具有免疫豁免的特性，同种异体的半月板细胞可以在此部位 存活并发挥正常的生理功能。但是要获取人的同种异体半月 板细胞还受到供体来源的限制。显然，半月板纤维软骨细胞 并不是一种理想的组织工程半月板种子细胞。