临床免疫实验 间接免疫荧光法测抗核抗体实验报告

实验三、间接免疫荧光法检测血清中抗核抗体

一、实验目的：

1、掌握免疫荧光法的原理。

2、掌握免疫荧光法检测过程中避免非特异荧光干扰的方法。

二、实验原理：

间接免疫荧光技术是利用荧光抗体标记第二抗体检测未知抗原或未知抗体（第一抗体）的方法。以检测人血清抗核抗体（ANA）为例。病人血清中ANA（Ab）能与各种系细胞核成分（Ag）特异性结合，此种结合的Ab（IgG型）能与荧光标记的羊抗人IgG（二抗）结合，在荧光显微镜下，细胞核显示荧光，提示血清中ANA的存在。

三、试验材料：

0.1M，pH6.8PBS；小白鼠，待测血清，对照血清（阴性血清），羊抗人IgG荧光抗体、滴管、试管、孵箱、荧光显微镜等。

四、实验步骤：

1、小鼠断颈处死取肝，NS漂洗，剪取肝横断面印片于玻片上，左右各一处，自然干燥；滴加无水乙醇固定，室温凉干；

2、左右印片处分别盖上一片小纸片，分别滴加阳性血清和阴性血清各1滴，37℃30′；

3、去除纸片，PBS冲洗1min×3次，吸干水分；

4、左右印片处分别盖上一片小纸片，并滴加荧光标记羊抗人IgG（二抗）各1滴，37℃30

5、去除纸片，PBS漂洗1min×3次，吸干水分；

6、荧光显微镜镜检。

五、实验结果：

荧光显微镜下观察：

细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性；抗原片中出现阳性染色细胞为ANA 阳性，否则为阴性；阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。

（均质型）细胞核呈均匀一致的荧光(斑点型)细胞核内呈现斑点状荧光六、实验讨论：

1、注意事项：

1）制作核抗原片（印片）不宜太厚；

2）滴加的血清或荧光抗体要充分盖满抗原片；

3）荧光抗体孵育时要注意避光;

4）染色后的片子应及时镜检，不宜放置过久。

5）注意各步骤的漂洗要充分。

2、临床意义：

1）总的ANA检测在临床诊断与鉴别诊断中是一个极为重要的筛选试验。绝大多数自身免疫性疾病均可呈阳性。ANA阳性者进一步检测各亚类ANA抗体对明确诊断、临床分型、病情观察、预后及治疗评价有重要意义。

2）未经治疗的、活动性SLE的阳性率为80%－100%。药物性狼疮100%、全身硬皮病、混合性结绨组织病、狼疮性肝炎、原发性胆汁性肝硬化等。

3）干燥综合症（SS）、类风关、桥本甲状腺炎等。

3、间接免疫荧光法的优缺点：

优点：

1)制备一种荧光标记二抗（抗抗体）可用于多种Ab检测

2)特异性、灵敏度高

3）快速、可定位。

缺点：

1）需要荧光显微镜

2）存在非特异荧光干扰（产生原因：自发、抗体不纯、交叉反应、技术问题）

3）定性测定、判断结果不客观

4）制备片子难保存（荧光猝灭）