蛋白质冻融过程中的物理化学变化

没食子酸在长期保存时 浓度发生的变化
共晶点：-16.7℃ 即使共晶点以下， 溶质扩散还在发生
(3)相分离现象
诱导蛋白质结构损伤 • 蛋白质分配进两种相中，可能使稳定 剂失去保护作用 • 改变稳定所需的分子间相互作用 • 形成两相界面（在不完全分离体系中， 蛋白质大面积暴露） 可发生于 • 电解质-聚合物 • 聚合物-聚合物 • 聚合物-多糖 • 蛋白质-多糖 • 蛋白质-蛋白质 • 蛋白质-表面活性剂 • 糖-蛋白质-多糖 • 电解质-聚合物-多糖 存在相分离现象 • PEG/PVP-Dextran • PVP-ficoll • PEG-磷酸盐

溶质浓度与粘度升高 溶质重新分布 溶质结晶（过饱和） pH变化 相分离
(1)溶质浓度与粘度升高，溶质重分布
引起反应速率发生改变 冰-水界面上形成浓度梯度
Figure 2. Temperature, % solute concentration, and viscosity profiles as a function of temperature during freezing of 3% sucrose.The data were calculated by assuming ice crystallization occurs at −15°C and that the solution composition follows the equilibrium freezing point depression curve. The viscosities were estimated from a fit of viscosity data over a wide range of composition and temperature to a Vogel-TammannFulcher-type equation. Data taken from Reference 7
重组血红蛋白 hemoglobin在 PEG-Dextran系统中的相图
顶层 10%PEG 混合液 7%PEG 7%Dextran
0.2%Dextran
底层 2%PEG 20%Dextran
3. 冰晶形成
(1)冰晶生长 → 冷冻浓缩 (2)冰水界面 界面有可能是疏水性的，发生吸附变性 离子迁移性质不同，产生电势
蔗糖缩短相变过程的时间
NaCl浓度的影响
Glycine在磷酸缓冲液中的保护作用 显著影响磷酸缓冲液在冻融时的pH变化 0-50mM 降低成核速率，减少磷酸盐的结晶，pH会有升高 ＞100mM 促进盐的结晶，pH降低
Tween-80(聚山梨醇酯80)的保护作用 降低冰-水界面的伤害
回顾
降温冷却 ↓ 冰晶开始形成 ↓ 冷冻浓缩效应 ↓ ↓ 浓度/粘度升高 ↓ 相分离 ↓ pH变化 ↓ 玻璃态转化温度 ↓ 分子运动锁定
(2) pH变化
• 酸变碱 或碱变酸的pH巨大变化都是可能的 • 溶质结晶 • 一般发生在低浓度溶质中，原因可能在于离子在冰与水之中迁移， 不同离子迁移性质与速率不同
KH2PO4不容易析出 Na2HPO4过饱和析出
KH2PO4-Na2HPO4-H2O系统中 KCl 引起pH升高，＞6 NaCl 引起pH降低，＜4
Ref: Protein Stability During Freezing， Separation of Stresses and
没食子酸Gallic Acid在有NaCl存在时冻融发生分解
分解反应发生只在碱性溶液中，酸性环境基本不发生
提供一种思路：不添加碱性试剂的前提下，从中性或酸性环境下催化碱性反应。
种类：
聚合物类 PVP/PEG 在冻结过程中优先析出；具有一定的表面活性；提高溶液粘度；显著提高玻璃化 转变温度；抑制溶液pH的降低。可以起低温保护剂和脱水保护剂作用。
多元醇 甘油/DMSO/乙二醇 强烈结合水分子，很强持水性，可与蛋白质形成氢键取代水，保证蛋白质稳定性。 但甘油浓度提高至一定程度时，对蛋白质稳定作用能力可能达到了极限。渗入性 保护剂 糖类 蔗糖/海藻糖 非渗入性保护剂，蔗糖在溶液中易结合水分子，发生水合作用，从而减缓晶核的 生长过程，使形成的冰晶较细小，达到保护细胞的目的。 表面活性剂 改善冰晶的吸附，既能在冻结和脱水过程中降低冰-水界面张力所引起的冻结和 脱水变性，又能在复水过程中对表面活性剂组分起到润湿剂和重褶皱剂的作用
快的冷却速率(小体积到液 氮) ：往往形成大量小冰晶， (3)结冰时，蛋白质周围的水分子有序排列，更多的冰水界面
为熵增提供了热力学驱动力，产生吸附和 解折叠。结冰后水分子与蛋白质分子距离 发生改变，肽链发生拉扯，改变氢键、静 电、范德华力及疏水作用。
(4)组织结构破坏
化学胁迫
1. 增强—NH2的羟胺反应 2. 共价聚合 3. 影响反应平衡
低盐 低温
β-lactoglobulin chymotrypsinogen lactate dehydrogenase myoglobin phosphoglycerate kinase ribonuclease and staphylococcal nuclease
冷冻过程中的温度变化


可长期保持组织中的生物 大分子稳定性、细胞活性 及组织微观结构，但对存 储耗材有较高要求。
一、物理胁迫


低温变性 冷冻浓缩效应 冰晶形成
二、化学胁迫
1. 低温变性效应
通常发生在0℃下，诱导蛋பைடு நூலகம்质解折叠
• • • 蛋白质的吉布斯自由能随温度 变化趋势 认为跟温度下疏水残基的溶解 度增加 变性温度与pH、蛋白浓度、添 加剂(如糖、离液剂等)有关

冻融过程到底发生了什么？
◦ ◦ ◦ ◦ 低温生物学 化学 热动力学 晶体学

冻融胁迫的产生

冻融保护
肉眼能观察到的冻融现象
• 冰晶 • 浓度差异 • 在静置情况下融化，往往会看到溶液分层情况
不均匀 的体系 变化
目前常用的冻融工艺步骤
• 冷却cooling
• 冷冻freezing
• 等温保持
• 融解 工艺上有不同升温速率 Slow warming 1-5℃/min：室温或自来水摇 intermediate warming ＞5℃/min：37℃或以上的水浴
生物样品常用存储温度
温度 意义
0～-600C为组织和细胞内 水的结晶温度，温度进入此 范围组织内的水开始结晶伤 害细胞和组织微观结构。 -800C为水的结晶温度之下 较为安全的温度，同时样本 内的生化反应显著减弱。也 是目前自动化存储设备所能 使用的最低温度。
设备
生物样品存储应用
可中长期保持经过提纯的 生物大分子的稳定性，但 不能存保持组织中的生物 大分子稳定性、细胞活性 及组织微观结构。
各种冷冻冰箱
超低温冰箱
可中期保持组织内生物大 分子的稳定性；短期保持 细胞活性和组织微观结构。
可中长期保持组织内生物 -1360C为水的玻璃化温度， 大分子、细胞和组织微观 水的结晶对细胞和组织不再 液氮箱/罐气相； 结构的稳定性，为不少样 有明显伤害，样本内的各种 深冷冰箱 本库推荐用于长期冻存组 生化反应几近停止。 织。 -1960C为液氮蒸发的温度， 是常规方法所能实现的最低 温度。样本内的各种生化反 液氮箱/罐液相 应可以认为停止，水的结晶 对细胞和微观组织的伤害可 以忽略。
感谢聆听，欢迎指正！
Reactions in Frozen Systems. Journal of the American Chemical Society
冻融保护/低温保护
1. 样品浓度 2. 冷冻降温/融化升温速率 3. 保护剂
2. 冻融时的温度变化速率对活性恢复的影响
3.保护剂
举例：过氧化氢酶活性影响
低温/冻融 保护剂