重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定
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14 第十四讲(2) 重组子的筛选和鉴定
2 营养缺陷型检测法
如果目的基因产物能降解某些药物使菌 株呈现抗性标记，或者基因产物与某些药物 作用是显颜色反应，则可根据抗性或颜色直 接筛选含目的基因的克隆子。
亮氨酸(leu)为leu菌所必须 。 在不含leu的基本培养基中，只有重组子 表达的leu才能被leu缺陷菌所利用而能生 长，形成菌落。 因此，能生长的菌落是阳性的重组子克 隆，没有重组子的leu缺陷菌在不含leu的 培养基中不能生长，不能形成菌落。
催化4-甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸， 产生萦光物质4-甲基伞形花酮，以此筛选 含gus基因的转化子。 尤其是gus基因的3’端与其他结构基因连接 产生的嵌合基因仍能正常表达，产生的融 合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在 转化生物体中的定位分析。
Hale Waihona Puke 萤火虫萦光素酶基因（luc）
luc表达产物萤火虫萦光素酶（LUC）在 Mg2+的作用下，可以与萦光素和ATP底物发 生反应，形成与酶结合的腺苷酸萦光素酰 化复合物，经过氧化脱羧作用后，该复合 物转变成为处于激活状态的氧化萦光素， 可以用萦光测定仪快速灵敏地检测出产生 的萦光，是目前研究动植物转基因很好用 的一种报告基因。
3 依赖于重组子结构特征分析的筛选法
⑴ 快速裂解菌落鉴定分子大小 主要是根据有外源DNA片段插入载体后的 重组DNA与载体DNA之间的大小差异来鉴 定重组子。 分别提取不同转化子的DNA，经琼脂糖凝 胶电泳，在琼脂糖凝胶板上出现的DNA带 中，落后的带是重组DNA的带。 此方法只用于重组子的初步鉴定。
7 插入失活法
基本原理： 是将特定的DNA随机插入到重组DNA分子 中，获得一系列插入重组子，根据其突变 的类型鉴定失活的基因，进一步利用此插 入DNA作为标记物，对失活基因进行定位。
重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定
电泳后的图谱
挑三个菌落 鉴定，图显 示的是三个 菌落中的质 粒双酶切的 结果
依赖于重组子结构特征分析的筛选方法三 PCR方法筛选鉴定重组子
• 基本原理： • 在载体DNA分子中，外源DNA插入位点两侧的序列多为 已知，通过与插入位点两侧已知序列互补的引物，从单 克隆中提取少量质粒DNA作为模板进行PCR扩增，琼脂 糖凝胶电泳分析确定是否为重组子。
抗药性标记法示意图
b类插入失活筛选
• 从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内 的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活 (insertional inactivation) 。插入失活法是从不同的重组 DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子 （筛选）的主要方法。
常用的抗药性选择标记
抗药性 氨苄青霉素 （Amp） 溶解剂 虑过 除菌 是 贮存温度 贮存浓度 终浓度
水
-20℃
50mg/ml
50~100µ g/ml
氯霉素（Cm） 卡那霉素 （Ka或Kan）
四环素（Tet 或Tc） 链霉素（Sm 或Str）
乙醇
否
-20℃
34mg/ml
20~17交液中，在60℃下放置6h；把同 位素标记的DNA探针于100℃变性后加入杂交溶液中，然 后放入滤膜，60℃杂交16－24h。探针的用量一般为105 －106cpm/ml。用2×SSC洗脱3次，每次30min。 • 7 放射自显影：将洗好的滤膜用吸水纸吸干，夹于两层保 鲜膜中，在暗室内放进暗盒，放好X线片，并于X线片上 作好标记，置于－70℃冰箱暴光48－72h。 • 8 洗片：在暗室内取出X线片，进行显影和定影，分析杂 交结果。
RNA水平
蛋白质水平
免疫化学检测法（放射性抗体检测法、 免疫沉淀检测法） Westhern印迹杂交法
何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
基因工程重组体克隆的筛选和鉴定
基因功能的正向遗传筛选技术
突变体库的构建
通过化学诱变、同源重组 等技术构建大规模突变体 库。
表型筛选
通过特定表型筛选出具有 特定功能的突变体。
突变基因的鉴定
通过测序等技术鉴定出突 变基因，并研究其功能。
05
克隆基因的应用前景
克隆基因在医学上的应用
疾病诊断与治疗
利用克隆技术获取特定基因，可用于疾病诊断、药物研发和个性化治疗。
基因敲入
将特定基因敲入生物体基因组，观察 生物体表型变化，以确定该基因的功 能。
基因表达干扰
通过转录因子或RNAi技术干扰特定 基因的表达，观察生物体表型变化， 以确定该基因的功能。
正向遗传筛选
通过突变体库筛选具有特定表型的突 变体，鉴定突变基因，以研究该基因 的功能。
基因敲除和敲入技术
基因敲除技术
基于测序的筛选
对转化子进行全基因组测序或目的基因片段测序，与已知序列进行比 对，判断是否含有目的基因。
蓝白筛选法
原理
步骤
利用载体上标记基因的表达产物对转化子 进行筛选，通过菌落颜色的变化判断是否 含有目的基因。
将转化子涂布在含有抗生素的培养基上， 培养后观察菌落颜色变化，蓝色菌落为阳 性克隆，白色菌落为阴性克隆。
基因表达的蛋白质印迹分析
原理
利用特异性抗体检测样品中特定蛋白质的表达情况，通过显 色反应或荧光信号对蛋白质进行定性或定量分析。
用等 方面的研究。
04
克隆基因的功能研究
基因功能研究的方法
基因敲除
通过基因工程技术将特定基因敲除， 观察生物体表型变化，以确定该基因 的功能。
Northern印迹杂交
原理
基于RNA的电泳分离和转移，将RNA 片段与标记的探针进行杂交，以检测 特异的RNA转录本。
重组子的筛选与鉴定
氨苄青霉素抗性基因：
产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮 酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin） （蓝灰色）褪色。
2020/7/30
（1）四环素抗性插入失活
当外源DNA限制片段插入pBR322质粒的BamH I和Sal I位点时，抗 四环素基因失活，重组体转化子必定具有Ampr Tets表型。将转化 菌先涂布在含有Ampr的琼脂平板上并将存活的Ampr菌落原位影印 到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在Ampr平板上生长，而不在 Tet平板亡生长的菌落，就必定是已经插入了外源DNA限制片段的重 组质粒2020转/7/3化0 子克隆。
2020/7/30
第二节 核酸分子杂交检测法 • 1 原理 • 2 核酸杂交检测方法
2020/7/30
• 利用碱基配对的原理进行分子杂交是核酸分析的重要手 段，也是鉴定基因重组体的常用方法。杂交的双方是待 测的核酸序列和由插入片段基因制备的DNA或RNA探针 。
• 这些方法都是通过一定的物理方法将菌落(噬菌斑)或提 取的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持物上，然后同 液体中的探针进行杂交。菌落(噬菌斑)或DNA从平板或 凝胶向滤膜转移的过程称为印迹，故这些杂交又都称为 印迹(blotting)杂交。
2020/7/30
1、原理： 1.1 核酸杂交 重组克隆与探针杂交。 1.2 检测用的探针 与外源DNA插入片断互补的序列。 1.3 识别标记
-半乳糖苷酶 Xgal
2020/7/30
半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝
载体上LacZ’的5’端有一段多克隆位点(MCS)区，本身 虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止 LacZ’的合成。不能互补。
2020/7/30
产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮 酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin） （蓝灰色）褪色。
2020/7/30
（1）四环素抗性插入失活
当外源DNA限制片段插入pBR322质粒的BamH I和Sal I位点时，抗 四环素基因失活，重组体转化子必定具有Ampr Tets表型。将转化 菌先涂布在含有Ampr的琼脂平板上并将存活的Ampr菌落原位影印 到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在Ampr平板上生长，而不在 Tet平板亡生长的菌落，就必定是已经插入了外源DNA限制片段的重 组质粒2020转/7/3化0 子克隆。
2020/7/30
第二节 核酸分子杂交检测法 • 1 原理 • 2 核酸杂交检测方法
2020/7/30
• 利用碱基配对的原理进行分子杂交是核酸分析的重要手 段，也是鉴定基因重组体的常用方法。杂交的双方是待 测的核酸序列和由插入片段基因制备的DNA或RNA探针 。
• 这些方法都是通过一定的物理方法将菌落(噬菌斑)或提 取的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持物上，然后同 液体中的探针进行杂交。菌落(噬菌斑)或DNA从平板或 凝胶向滤膜转移的过程称为印迹，故这些杂交又都称为 印迹(blotting)杂交。
2020/7/30
1、原理： 1.1 核酸杂交 重组克隆与探针杂交。 1.2 检测用的探针 与外源DNA插入片断互补的序列。 1.3 识别标记
-半乳糖苷酶 Xgal
2020/7/30
半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝
载体上LacZ’的5’端有一段多克隆位点(MCS)区，本身 虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止 LacZ’的合成。不能互补。
2020/7/30
基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定
等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操 作中形成的喷雾、 试剂及任何与扩增产物接触的东 西。
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
重组克隆的筛选与鉴定
4、 选择得过程
(1)四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA,导致四环素 抗性基因失活,可用四环素﹢环丝氨酸 得平板,选择重组克隆。
Tetr插入失活得细菌,其生长可被四环素 抑制,不被环丝氨酸杀死,保留下来;
Tetr不失活得细菌,能抗四环素,正常生长, 但可被环丝氨酸杀死。
图 四环素抗性插入失活
二、利用抗生素抗性基因:pBR322
以pBR322为例,说明利用抗生素抗性基因得插 入失活得原理。
1、 原理
在pBR322上有多个单一得限制酶位点,如 BamH I位点,恰好在一个四环素抗性基因内。 如果有外源DNA插入BamH I位点,那么涉及 四环素抗性得基因就损坏,因此,带有重组 pBR322质粒得细胞,仍对氨苄青霉素有抗性, 但对四环素得抗性消失(敏感)。
pUC18/19得结构图
氨苄青霉素抗性基因 Lac Z基因:编码-半乳糖苷酶得部分肽
段。 Lac Z上有插入外源DNA得MCS位点。
4、 筛选得方法:蓝白斑法
利用蓝白斑法筛选pUC8/9重组子,就是 一种直接检测-半乳糖苷酶活性得方法。
①先将转化子涂于含有氨苄青霉素得培 养基,能合成-半乳糖苷酶。
该技术已广泛应用于基因得表达、基因 定位、克隆基因得筛选、酶切图谱得制
作、基因组中特定基因序列检测、遗传 病疾病得诊断及生物分类等方面。
一、核酸分子杂交得基础
1、 变性与退火 DNA以双链形式存在,在进行分子杂交
时,先将双链DNA分子解聚为单链,这一 过程称为变性。
两条单链通过碱基互补,聚合成稳定得 双链区得过程称为退火或复性。
图 表型筛选加酶切筛选
０
A
A
T T
TA AT
重组基因的导入和鉴定
该方法操作简单，又不需特殊仪器，瞬间转移效率最高可达到20％，但长期表达效 率较低，目前已被广泛运用于离体细胞的基因转移，是最普遍使用的方法之一。
(2)DEAE-葡聚糖转染法
二乙胺乙基葡聚糖是一种高分子量的多聚阴离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外 源DNA，因此被用于基因转染技术。其促进细胞捕获DNA的机制还不清楚，可能是因 为葡聚糖与DNA形成复合物而抑制了核酸酶对DNA的作用，也可能是葡聚糖与细胞结 合面引发了细胞的内吞作用。该方法可广泛用于转染病毒、病毒序列及其他DNA，适 合于细胞瞬间表达检测及小量DNA的转染。
一、基因转移的物理方法
物理方法
裸DNA直接注射 微粒轰击 电穿孔 显微注射
(1)裸DNA直接注射
1990年Wolff等首次注意到给小鼠直接肌肉注射纯化的DNA或RNA重组表达载体，可使 载体上的基因在局部肌细胞内表达，这种表达可持续数日或更长时间，且没有检出 注射的外源核酸与宿主染色体整合。
因此可直接将DNA导入细胞质中，这种方法能有效地使DNA在活体组织、贴壁细胞和悬浮 细胞中表达。由于该方法的高转染效率，通常只得少量DNA即可获得外源基因的表达并 激发有效免疫应答。
(2)基因枪介导的皮内或皮下导入
80年代末期，由康奈尔大学的Sanford最先提出，主要是为了克服以往各种基因转化技术 的局限。
真正的显微注射：利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的 基因转化方法。
固定细胞技术
显微注射技术的关键是原生质体或具壁细胞或细胞团的固定。 首先必须建立固定细胞技术，然后才能进行定位显微注射操作。 常用的细胞固定方法有3种： 一、琼脂糖包埋法 二、多聚赖氨酸粘连法 三、吸管支持法
ROI ROP
实验17-重组体筛选与鉴定
（3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
液。
6.感受态细胞分装成200μl的小份,暂且不用的贮存于-70℃可
保存半年。 取其中一份进行转化。
7. 向转化管中加入DNA（不超过10ul）,轻度摇晃混合后于冰上
放置30分钟。
8. 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90秒
(不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰浴，冷却1－2分钟。
重组体筛选与鉴定
重组质粒的转化
转化（transformation)：
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞 获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研 究领域的基本实验技术。
转化方法
1、化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl） 制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA 分子导入受体细胞；
不同抗生素基因筛选 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉 素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在 选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化 体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如 果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基 平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确 认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含 有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上 生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不 能确定哪个克隆含有插入片段。
受体菌：his外源基因：his+
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
液。
6.感受态细胞分装成200μl的小份,暂且不用的贮存于-70℃可
保存半年。 取其中一份进行转化。
7. 向转化管中加入DNA（不超过10ul）,轻度摇晃混合后于冰上
放置30分钟。
8. 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90秒
(不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰浴，冷却1－2分钟。
重组体筛选与鉴定
重组质粒的转化
转化（transformation)：
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞 获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研 究领域的基本实验技术。
转化方法
1、化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl） 制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA 分子导入受体细胞；
不同抗生素基因筛选 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉 素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在 选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化 体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如 果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基 平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确 认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含 有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上 生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不 能确定哪个克隆含有插入片段。
受体菌：his外源基因：his+
重组dna的筛选和鉴定方法
重组dna的筛选和鉴定方法《重组DNA的筛选和鉴定：一场微观世界的“寻宝”之旅》嘿，你知道吗？重组DNA这玩意儿可太神奇了。
就像是在微观世界里搞一场超级特别的“拼接游戏”。
你把不同来源的DNA片段给组合到一块儿，就像搭积木一样，搭出一个全新的DNA组合。
可这搭完了，你怎么知道你搭得对不对呢？这就轮到筛选和鉴定方法上场啦。
我就有一次特别有趣的经历，和找东西有点像。
我有一个超级乱的抽屉，里面啥都有，小珠子、笔芯、还有各种小贴纸啥的。
我想在里面找一颗特定的珠子，那颗珠子是我朋友送我的，上面有个特别小的标记。
这就跟在一堆重组DNA里找我们想要的那个重组体差不多。
咱先说筛选方法哈。
有一种方法叫抗性筛选。
这就好比我在那堆抽屉杂物里，按照有没有某种特殊属性来挑东西。
在重组DNA的世界里呢，科学家会给载体加上抗性基因，就像给我们要找的那个特殊东西贴上一个特别的标签。
比如说，在含有氨苄青霉素的培养基里培养那些接受了重组DNA的细菌。
如果细菌能在这培养基里活下来，那就很有可能是我们想要的重组体啦。
为啥呢？因为这个重组体里带着抗性基因呢，就像那些带着特殊本领（能抵抗氨苄青霉素）的细菌，才能在这个“危险”的环境里生存。
还有一种筛选方法是蓝白斑筛选。
这就更有趣了。
想象一下啊，那些接受了重组DNA的细菌在培养皿里就像一群小居民。
正常情况下，有一种酶叫β - 半乳糖苷酶，它能让一种物质变色。
如果DNA重组成功了，这个酶的基因被破坏了，就不会变色。
就像我抽屉里有些东西，原本是亮闪闪的，要是被破坏了某个部分，就不再亮闪闪了。
在培养皿里，没重组成功的会变成蓝色的菌斑，而重组成功的就是白色的菌斑。
我当时在找那颗珠子的时候，也会根据一些类似的特征来区分东西。
比如说，我知道那颗珠子是不透明的，而其他一些珠子是透明的，我就可以根据这个来缩小寻找的范围。
那鉴定方法呢？PCR（聚合酶链式反应）就是个很厉害的鉴定手段。
这就像是拿着一个超级放大镜，去看那些特别特别小的细节。
实验九DNA的重组与鉴定
掌握重组的步骤
DNA重组的过程包括切割、连接和筛选等步骤，这些步骤对于重组的 成功与否至关重要。
掌握DNA重组实验的原理
1 2
了解限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶是一类能够识别并切割DNA特 定序列的酶，是DNA重组实验中常用的工具酶。
理解DNA连接酶的作用
DNA连接酶能够将两个DNA片段连接起来，是 DNA重组实验中必不可少的体外快速扩增 特定DNA片段的技术，是进行DNA重组鉴定的 重要手段。
学习DNA重组实验的技术方法
01
学习限制性核酸内 切酶的酶切技术
通过限制性核酸内切酶的酶切技 术，可以将待重组的DNA分子切 割成不同的片段。
02
掌握T4 DNA连接 酶连接技术
利用T4 DNA连接酶，可以将切 割后的DNA片段重新连接起来， 形成新的DNA分子。
酶切验证
对重组子进行酶切验证，酶切结果与预期一 致，进一步证实了重组子的正确性。
DNA序列分析结果
目的基因序列
DNA序列分析结果显示目的基因已成功插入载体中，且 序列正确。
载体序列
载体序列分析结果显示载体结构完整，未发生突变或缺 失。
结果分析
实验成功
通过琼脂糖凝胶电泳、蓝白斑筛选和酶切验证，证实了目的基因已成功插入载体中，重 组子筛选成功。
04
实验结果与分析
琼脂糖凝胶电泳检测结果
要点一
重组DNA分子量
通过琼脂糖凝胶电泳检测，重组DNA分子量符合预期，表 明DNA片段已成功连接。
要点二
非重组DNA条带
未观察到明显的非重组DNA条带，表明筛选成功，未发生 非特异性连接。
重组子的筛选结果
蓝白斑筛选
通过蓝白斑筛选，成功筛选出重组子，未筛 选到野生型菌落。
DNA重组的过程包括切割、连接和筛选等步骤，这些步骤对于重组的 成功与否至关重要。
掌握DNA重组实验的原理
1 2
了解限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶是一类能够识别并切割DNA特 定序列的酶，是DNA重组实验中常用的工具酶。
理解DNA连接酶的作用
DNA连接酶能够将两个DNA片段连接起来，是 DNA重组实验中必不可少的体外快速扩增 特定DNA片段的技术，是进行DNA重组鉴定的 重要手段。
学习DNA重组实验的技术方法
01
学习限制性核酸内 切酶的酶切技术
通过限制性核酸内切酶的酶切技 术，可以将待重组的DNA分子切 割成不同的片段。
02
掌握T4 DNA连接 酶连接技术
利用T4 DNA连接酶，可以将切 割后的DNA片段重新连接起来， 形成新的DNA分子。
酶切验证
对重组子进行酶切验证，酶切结果与预期一 致，进一步证实了重组子的正确性。
DNA序列分析结果
目的基因序列
DNA序列分析结果显示目的基因已成功插入载体中，且 序列正确。
载体序列
载体序列分析结果显示载体结构完整，未发生突变或缺 失。
结果分析
实验成功
通过琼脂糖凝胶电泳、蓝白斑筛选和酶切验证，证实了目的基因已成功插入载体中，重 组子筛选成功。
04
实验结果与分析
琼脂糖凝胶电泳检测结果
要点一
重组DNA分子量
通过琼脂糖凝胶电泳检测，重组DNA分子量符合预期，表 明DNA片段已成功连接。
要点二
非重组DNA条带
未观察到明显的非重组DNA条带，表明筛选成功，未发生 非特异性连接。
重组子的筛选结果
蓝白斑筛选
通过蓝白斑筛选，成功筛选出重组子，未筛 选到野生型菌落。
第六章重组体的筛选与鉴定
一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应
1.以 1.以pBR322质粒为例 质粒为例
（1）pBR322质粒的一般特性 质粒的一般特性 在pBR322质粒上有两个抗生素基因，Ampr基因内有 pBR322质粒上有两个抗生素基因， 质粒上有两个抗生素基因 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点， PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 BamHⅠ 两种限制性核酸内切酶单一 位点。 位点。
如下图所示
一、根据载体表特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法
Ampr pBR322 Tetr AmprTetr
菌落原位影印
pBR322
+
pBR322
AmprTets
Amp琼脂平板 琼脂平板
Tet琼脂平板 琼脂平板
图 应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法 1.乳糖操纵子的结构 1.乳糖操纵子的结构
二、根据插入基因遗传性状的筛选 (一)原理 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后, DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后,如果 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 达,而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 互补 (二)举例 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时,将该基因 亮氨酸的基因 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用 能利用表达产物亮 少亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用表达产物亮 氨酸的细菌才能生长 因此,获得的转化子都是重组子 生长, 转化子都是重组子. 氨酸的细菌才能生长,因此,获得的转化子都是重组子.
基因工程-第8章-重组子的筛选与鉴定
2、根据插入序列的表型特征选择重
组体分子的直接选择法
转化进来的外源DNA编码的基因，能够 对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变体发 生体内抑制或互补效应，从而使被转化 的寄主细胞表现出外源基因编码的表型 特征。
Example:
λ gt.λ B噬菌体（由于C片断的缺失而造成重 组缺陷的λ red－噬菌体），在大肠杆菌lig ts菌株上生长不能形成噬菌斑，在有连接酶功 能的大肠杆菌lig＋菌株上形成噬菌斑。 将具有连接酶基因的重组体噬菌体λ gt. λ B，涂布在大肠杆菌lig ts菌株上时，通过 寄主细胞的互补作用，能够形成噬菌斑。根据 形成噬菌斑这种表型特征，直接选择具野生功 能的重组体噬菌体。
缺点： 不单要求克隆的DNA片断必须大到足 以包含一个完整的基因，而且还要求所 编码的基因能够在大肠杆菌中实现功能 表达。 （对于真核基因很难达到要求）
二、物理检测法
1、凝胶电泳检测法 从宿主细胞中提取重组子分子，利用凝胶 电泳的方法，鉴定外源片断是否插入及其 长度。 优点：简便、快速。 缺点：只能提供克隆片段大小的信息。
抗药性标记插入失活
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
Tc
有DNA插入
Amp r
Tcr
转化
Amp r Tc s
外源DNA
Amp r பைடு நூலகம்cr
无菌落 筛选重组子 阳性菌落
Amp r Tc s
提取DNA 电泳
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
Amp r Tc s
重组DNA
（2）β-半乳糖苷酶显色反应选择法
外源DNA 有DNA插入
Apr
转化
Ap r
Ap r
筛选重组子 白色菌落
重组体的筛选和鉴定
二、利用插入序列提供的表型特征筛选
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。 一、原理： 1.弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。 受体菌： his外源基因： his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
GFP 老鼠
GFP- Kac的狗
GFP Alba 發青綠光 芒的 兔子
①新霉素磷酸转移酶基因（NPTⅡ）抗新霉素、卡 那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选动 植物转化子的选择标记基因。 ②潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）赋予转化子能抗 潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物 转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。 ③氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）也被用于筛选动 植物转化子的标记基因。
PstI酶切
外源DNA 黏性末端 连接酶 PstI酶切
pBR322 4363
重组子(ampstetr) 空载体(amprtetr) 插入子(ampstets)
导 入
黏性末端
重组子转化子(ampstetr) 空载体转化子(amprtetr)
影印在含Ap的平板上
涂布在含Tc的平板上
野生型的E.coli (ampstets)
缺点：需要电镜！
2. Northern blotting
用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。 主要检测插入片 断是否被转录。 从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
Northern Blotting
Western Blotting
Southern和Western印迹法
32P-labled
重组体的筛选
合成某一aa的基因 连接
酶切
重组
转化 缺少该aa合成 酶基因的菌株
载体
重组子
生长、获得
筛选
只缺少该aa的 基本培养基
二、核酸分子的物理检测法
原理： 碱基配对
杂交双方： 待测的核酸序列 插入片段基因制备的DNA或RNA探针
核酸杂交方法：
菌落印迹原位（in situ）杂交
斑点（dot）印迹杂交
Southern印迹杂交
实验原理与步骤
提取
点样
加热
RNA或DNA
变性
NC膜
碱溶液
放射性探针
固定
杂交
X-底片
放射自显影
一定条件
显影、定影
标记斑点
检测
3、Southern 印迹杂交
★1975年，英国Southern创建 ★ DNA与DNA的杂交，即将DNA电泳、 转印到固相支持物上，用探针进行检测的 方法。
限制性酶切割
第一节 核酸分子的遗传学与物理检测法 一、遗传学检测法
1、根据载体表型特征的筛选
（1）抗药性标记插入失活筛选法
Kan
克 隆
抗 性 基 因
（2）β -半乳糖苷酶显色反应筛选法
蓝 白 菌 落
蓝白菌落
筛选白色菌落
2、根据插入基因遗传性状的筛选
重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞 之后，如果插入在载体分子上的外源基因能够 实现其功能性的表达，而且表达的产物能与大 肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成互补，那么就 可以利用营养突变株进行筛选。
限制片段
DNA分子
琼脂糖电泳
带有DNA片段的凝胶
实 验
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
重组子的筛选与鉴定
丝氨酸杀死。
一、遗传学检测法
无环丝氨酸培养基
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 选择过程 （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基
因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 （2） 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有终止密码子；
（不破坏 肽）。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。
（只在特定条件下）。 1.原理 （1）弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型
缺陷。
受体菌： his
-
外源基因： his
+
阳性克隆才能在不 含组氨酸的培养基 中生长
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 1.原理
（2）增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例：小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二
优点：简便、快速，结果较可靠。
缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。 （一） 根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法
1. 抗药性标记插入失活选择法 2. β-半乳糖苷酶显色反应选择法 （二）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所 具有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表 现出外源基因编码的表型特征。
一、遗传学检测法
无环丝氨酸培养基
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 选择过程 （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基
因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 （2） 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有终止密码子；
（不破坏 肽）。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。
（只在特定条件下）。 1.原理 （1）弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型
缺陷。
受体菌： his
-
外源基因： his
+
阳性克隆才能在不 含组氨酸的培养基 中生长
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 1.原理
（2）增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例：小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二
优点：简便、快速，结果较可靠。
缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。 （一） 根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法
1. 抗药性标记插入失活选择法 2. β-半乳糖苷酶显色反应选择法 （二）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所 具有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表 现出外源基因编码的表型特征。
重组体的筛选和鉴定
1975年，英国Southern创建
针对DNA的杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探 针进行检测的方法。
原理：将重组菌的基因组或质粒DNA提取出来，经合适的限制
性内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分离，把定位在凝胶 中的DNA碱变性处理，使其双链DNA分开，再将凝胶中变性的 DNA转移到硝酸纤维素膜上，用制备的标记探针与其充分混合， 进行同源性DNA杂交。
为Tcr表型．而质粒为Tcs表型。
转化菌涂在Tc平板上，只有含有外源DNA插入片段
的阳性重组子的转化菌能生长成菌落。
16
（3）显色反应筛选：蓝白斑筛选
乳糖 -半乳糖苷酶 X-gal 半乳糖 + 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝 α-互补 深蓝色 （酶活）
半乳糖
β—半乳 糖苷酶
α链（lacZα） ：四聚体装配
A
T T
表型筛选加酶切筛选
T A A T
38
二、目的克隆的鉴定
（一）核酸分子杂交(nucleic acid hybridization) 原理
具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温 度和离子强度)可按碱基互补的原则退火形成双链.
杂交分子可在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合
18
19
20
pUC18/19
5’
lacZ’
EcoRI SacI
EcoRI SacI
KpnI SmalI BamHI XbaI SalI
pUC18
PstI
SphI Hind III
ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTG
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在含抗菌 素和Xgal 的培养基 上培养
蓝白斑筛选
X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)，IPTG (异丙基硫代-β-D-半乳糖苷) X-gal被没分解后的产物为5-溴-4-氯-靛蓝
无质粒的 受体菌
b-半乳糖苷酶 部分缺失，不 能分解Xgal； 无抗菌素抗性
不能 正常 生长
无菌斑 生长
质粒转化 的受体菌
b-半乳糖苷酶 的缺失被载体 产物a互补，能 分解Xgal。且 有抗菌素抗性
b：如果外源基因片段插入载体的位点在抗药性基因中 间，导致抗药性基因失活，这个抗药性标志就会失活。 检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插人失活 效应 。
a类筛选
• 基本原理
• 抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。 因为重组质粒DNA携带有特定的抗药性选择标记基因，转 化受体菌后能使后者在含有相应选择药物的选择培养基上 生长，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活。
重组体分子的选择与鉴定方法
我们把外源基因导入受体细胞的目的是获得带有目的基因 阳性重组体，因而重组体的筛选是体外重组技术的一个 重 要环节。
涂布菌液，观察平板是无法判断重组子是否是我们所需的。 因此，我们需要进一步进行筛选。
常用的筛选方法概括起来有两大类：①直接筛选法；②间 接筛选法。
直接筛选法
• 直接筛选法是借助遗传学表型来进行筛选的方法。
（筛选）的主要方法。
• 例如：
• 非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性 基因都是正常的, 表型为AprTcr。带有这种质粒的受体菌 可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。但 是, 如果在该质粒的氨苄青霉素抗性基因内插入外源片段, 就会造成氨苄青霉素抗性基因失活, 变成ApsTcr, 携带这 种 质粒的宿主菌可以在四环素的平板上生长, 而不能在氨苄 青霉素抗性平板上生长。
或Tc）
乙醇
否
-20℃ 12.5mg/ml 12.5µg/ml
（固）
链霉素（Sm
或Str）
水
是
-20℃ 20mg/ml
25µg/ml
A 如果外源基因片段插入载体的位点在抗药性基之外， 不导致抗药性基因的失活，仍能编码抗药性基因产物。 含有这种重组子的转化细胞可以在含有相应抗生素的琼 脂平板上生长成菌落，未能接受载体DNA的细胞因不分之一的抗性药物，再倒平板； • 将转化后的菌液均匀涂布在平板上； • 放在37℃培养箱培养12~16小时； • 观察菌落生长情况。
抗药性标记法示意图
b类插入失活筛选
• 从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内 的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活 (insertional inactivation) 。插入失活法是从不同的重组 DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子
蛋白质水平
免疫化学检测法（放射性抗体检测法、 免疫沉淀检测法）
Westhern印迹杂交法
重点介绍的筛选方法
抗药性筛选 a互补
遗传表型直接选择法
快速裂解菌落鉴定分子大小
限制性内切酶酶切法 PCR方法筛选鉴定重组子 菌落杂交筛选
间接选择法
遗传学表型筛选的方法之一——抗药性筛选
• 基本原理
• 抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。 因为质粒DNA携带有特定的抗药性选择标记基因，与目的 基因重组后，转入受体菌，能使受体菌带有相应抗药性， 另一种情况是虽然质粒中原来有相应抗性，但插入外源片 段后重组质粒失去抗药性，据此我们也可以进行抗药性筛 选。
所得到的活力b-半乳糖苷酶（ a-肽加w片段）将底物XGal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。在载体多克隆 区域，克隆上插入片段导致a-肽编码区的破坏，使b-半 乳 糖苷酶失活，得到白色菌落。 a-肽编码区读码框内小的 插入片段产生浅蓝色菌落，因b-半乳糖苷酶只是部分失活。
• 通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的 。这样 一次筛选 可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空 载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组 质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。
• 一般来说，先用直接筛选法进行初步筛选后，再用间接检 测法进行鉴定，直至获得我们所需要的阳性重组体。
重组子筛选的方法
遗传表型直接筛选法
核酸分子杂交法
DNA水平
PCR法 DNA序列分析法 直接凝胶电泳法
重
酶切片段分析法
组
子
筛
RNA水平
选
检测特定外源基因是否转录及转录的强度 （Northern杂交印迹法)
常用的抗药性选择标记
抗药性
氨苄青霉素 （Amp）
溶解剂 虑过 贮存温度 除菌
水
是
-20℃
贮存浓度
终浓度
50mg/ml 50~100µg/ml
氯霉素（Cm） 乙醇
否
-20℃ 34mg/ml 20~170µg/ml
卡那霉素 （Ka或Kan） 水
是
-20℃ 10mg/ml
50µg/ml
四环素（Tet
10µg/ml（液）
• 重组子转化宿主细胞后，载体上的一些筛选标志基因表 达，会导致宿主的某些表型的改变，通过琼脂平板中添加 相应筛选物质，可以直接筛选含重组子的菌落。如果质粒 上有两种抗性，因为外源基因的插入，导致其中一个不 能 表达，那么也可以通过抗药性将重组子筛选出来。
间接筛选法
• 间接筛选法是检测重组体克隆中是否含有目的基因的核苷 酸序列或是否产生目的基因所编码的产物。
B类插入失活筛选步骤
• 注意事项：
• （1）以Amp、Tc等抗生素作为选择药物，37℃培养时间 约12~16h，超过时间视为杂菌（假转化子菌落）。
• （2）挑选单菌落作为转化子以便进一步实验验证。挑的 菌落在LB培养基中震荡培养。
遗传学表型筛选的方法二—a互补
• 基本原理：
• 这种筛选方法适用于含b-半乳糖苷酶基因的载体。载体在 b-半乳糖苷酶的a-肽编码区具有多克隆区域。重组质粒中 的插入片段使a-肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴 别。不带有插入片段的载体表达有活力的b-半乳糖苷酶， 所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉LacZM15基因， 导致内源a-肽失活。载体或其他含LacZ基因的a-肽互补 细菌，具有b-半乳糖苷酶的w片段。