外源基因的表达及其优化策略

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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
三、原核生物基因表达的调控 4. 翻译终止密码 大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三个终止密 码防止核糖体跳跃（skipping）。 5. 翻译增强子（Translation enhancer） 能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率 的特殊序列。 T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）; 大肠杆菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的区段
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
四、基因工程常用的原核启动子 4. PL和PR启动子 •
当cI合成后，与OL和OR结合阻止RNA聚合酶，则左右 基因都受到抑制。但促进PM使cI进一步转录。进入溶原期。
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
四、基因工程常用的原核启动子 4. PL和PR启动子 表达载体常用的噬菌体启动子是PL。 调节基因cI 则是选择了一个温度敏感性的突变基因 cI857。 整合在宿主基因组里，或克隆到载体上。
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第七章 外源基因的表达及其优化策略
第一节
第二节
影响外源基因表达的因素
外源基因在原核细胞中的表达
第三节
外源基因在真核细胞中的表达
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第一节 影响外源基因表达的因素
基因表达： 从DNA分子有序地将其所承载的遗传信息,通过密码子
和反密码子系统,转变由特定氨基酸顺序构成的多肽或蛋白
质分子过程，从而决定生物有机体遗传表型。
阻遏蛋白
i 基因
有诱导物时
P
O
Lac Z
Lac Y 转录 翻译
l ac A
m RNA
阻遏蛋白 阻遏物 蛋白亚基 无活性的 阻遏蛋白
β- 半乳糖苷酶 β- 半乳糖苷通透酶 β- 半乳糖苷乙酰转移酶
诱导物
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
一、原核生物细胞表达的特点 3.原核生物的转录与翻译是偶联的，也是连续 进行的。 每个核糖体可独立完成一条多肽链的合成，即这种多核糖
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第一节 影响外源基因表达的因素
一、阅读框架对转化基因的影响 什么是阅读框架(open reading frame,ORF)? 二、顺式作用元件对基因表达的影响 1.对基因转录起始的调控 1)启动子
2)增强子
3)沉默子
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第一节 影响外源基因表达的因素
二、顺式作用元件对基因表达的影响 2.对基因转录终止的调控 1)终止子 2)衰减子 3.对DNA结构的影响
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第一节 影响外源基因表达的因素
基因表达 遗传信息从DNA到蛋白质的 传递过程——中心法则（central
dogma）。
从DNA分子有序地将其所承 载的遗传信息,通过密码子和反密 码子系统,转变由特定氨基酸顺序 构成的多肽或蛋白质分子过程，
从而决定生物有机体遗传表型。
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第一节 影响外源基因表达的因素
优点：产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。 缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体： 结构组成： 1）强启动子: tac（trp-lac）
trp的-35区 lacUV5的-10区
四、基因工程常用的原核启动子 2.乳糖启动子lac 来自大肠杆菌的乳糖操 纵子。
用乳糖或其类似物IPTG
充当诱导物，与阻遏蛋白结 合，解除抑制。
Plac O 目的基因
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
四、基因工程常用的原核启动子 2.乳糖启动子lac
阻遏物与操纵基因结合
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
Z编码-半乳糖苷酶；Y编码-半乳糖苷透过酶；A编码-半乳糖苷乙酰 基转移酶。
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
乳糖操纵子(lac operon)的调控方式
RNA聚 合 酶 无诱导物时
i基 因
P
O
Lac Z
Lac Y
l ac A
阻遏物 蛋白亚基
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
二、外源基因在原核细胞中表达具备条件
1.通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合 成外源蛋白。 2.外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化 学合成基因，而不能用基因组DNA。
3.必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基 因的表达。
1)核基质结合区
2)绝缘子 3)基因座控制区
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第一节 影响外源基因表达的因素
三、翻译过程对表达的影响 1.翻译起始对基因表达的影响 2.密码子偏爱性对基因表达的影响 3.翻译终止对基因表达的影响 四、表达系统对表达产物的影响
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
用原核生物作宿主。
原核或噬菌体启动子
SD序列
MCS
终止子
A dividing E. coli
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
一、原核生物细胞表达的特点 1.原核生物只有一种RNA聚合酶识别原核细胞的启动 子，催化所有RNA的合成。 2.原核生物的表达是以操纵子为单位的。操纵子是数
个相关的结构基因及其调控区的结合，是一个基因表达的 协同单位。
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子 原理： 茎环结构 反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使 转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA 与DNA的互作 多聚A/U 由于茎环3’段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差， 有利于转录物脱落而不利于转录延续。
5’ TTGACA 17bp 核糖体结合位点 TATAAT 转录起始位点
第二节 外源基因在原核细胞中的表达
三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 （1）启动子序列
原核启动子共有序列的功能
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 （2）翻译的起始位点 a)核糖体结合位点（ ribosome binding site ,RBS） Shine-Dalgarno（SD） sequence： mRNA上与核 糖体16sRNA结合的序列。
4.外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架 (ORF)。 ORF(open reading frame)：起始于AUG、止于UAA、UGA、 UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。 5.利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因 的表达产物对宿主菌的毒害。
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cI857 PL
外源基因
cI857: 28℃时阻遏PL，外源基因不转录。 42 ℃时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体
载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白 质融合在一起。
S-D序列 ATG-外源基因-TAG
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
四、基因工程常用的原核启动子 4. PL和PR启动子 是从噬菌体中得到的一类启动子，比lac启动子的活 性高8-10倍，比trp启动子活性高。 cIII N PL/OL cI PM OR/PR Cro PE cII
N:抗终止蛋白； Cro: 抗阻遏蛋白(裂解必需的）； cI, cII, cIII: 阻遏蛋白； P:启动子；O:操纵子。 R:右；L:左
体可以同时在一条mRNA链上合成多条肽链，大大提高了
翻译效率。 4.原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。因此 当克隆的含有内含子的真核基因在原核细胞中转录成 mRNA前体后，其中内含子部分不能被切除。
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
转录和翻译偶联、连续进行
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子 在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。
启动子 操纵子 S-D序列 目的基因 终止子
内终止子（ intrinsic terminator）：E.coli中促使转录终 止的DNA位置有一段反向回文顺序，其后紧接一串A，称 为内终止子，形成终止信号。
克隆基因的表达 外源基因在宿主细胞中表达。
•
外源基因 重组载体 表达载体 提取蛋白 宿主细胞： 原核细胞或真核细胞
导入宿主细胞
在宿主细胞中 表达出蛋白质
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第一节 影响外源基因表达的因素
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第一节 影响外源基因表达的因素
影响外源基因表达的因素主要有： 阅读框架 顺式作用元件 翻译过程 表达体系
第二节 外源基因在原核细胞中的表达
原核生物基因表达载体的组成特征 启动子 核糖体结合位点(SD序列)
终止子
选择标记基因 复制子 原核生物基因表达的受体系统
大肠杆菌受体系统、芽孢杆菌受体系统、 链霉菌受体系统、 蓝藻受体系统。
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成 的序列。 （1）启动子序列 大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序 （consensus sequence）。
trpR
阻遏蛋白基因；
P1
P2
启动子；
O 操纵基因； 衰减子
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四、基因工程常用的原核启动子 3.色氨酸启动子trp
色氨酸操纵子
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• 四、基因工程常用的原核启动子 3.色氨ห้องสมุดไป่ตู้启动子trp
没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，能转录合 （P1是主要启动子，P2的作用只有3%。） 成色氨酸所需要的酶。
四、基因工程常用的原核启动子 2.乳糖启动子lac
四聚体的 阻遏物
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四、基因工程常用的原核启动子 2.乳糖启动子lac
阻遏物与DNA的结合
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
四、基因工程常用的原核启动子 3.色氨酸启动子trp 来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。 trpR P1 O trpE trpD P2 trpC trpB trpA
一、原核生物细胞表达的特点 5.原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比 对基因产物直接控制要慢。对RNA合成的控制有2种方式： 一是起始控制(启动子控制)，二是终止控制(衰减子控制)。 6.在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个 翻译起始密码子及同16S RNA 3’末端碱基互补的序列，即 SD序列。 Shine-Dalgarno（S-D）sequence:含有一个启始密码子 和一段同核糖体16SRNA3’末端碱基互补的序列，叫ShineDalgarno（S-D）序列。
S-D序列距离AUG的距离也影响翻译 b)起始密码：位于SD序列下游 AUG（91%）、GUG（8%）、UUG（1%）
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
三、原核生物基因表达的调控 2.RNA多聚酶 大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA， rRNA和mRNA。 （1）结构：全酶是一个5聚体，含有两个α小亚基，和2 两个大亚基（β和β′），一个σ亚基。
-35 Box 和 -10 Box
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
不同启动子的consensus sequences
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 （1）启动子序列 -35box：RNA聚合酶 亚基的识别位点 。 5’-TTGACA-3’ -10box（Pribnow Box）：5’-TATAAT-3’
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第二节 外源基因在原核细胞中的表达
四、基因工程常用的原核启动子 1.最佳启动子必须具备的条件 必须是一种强启动子 能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%30%以上。 应呈现低水平的基础转录
便于表达毒性蛋白等。
应是可诱导型的 用温度或化学试剂诱导。
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