血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定(赖氏法)

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ALT活性测定

血清中丙酮酸2,4-二硝基苯腙
505nm处有强吸光度
临床意义：
ALT在肝、肾、心和骨骼肌中含量丰富，其中ALT在肝细胞中的浓度比血清高7 000倍，且主要位于肝细胞的可溶性部分。当肝脏受损、肝细胞膜通透性增加时ALT或AST释放入血可导致血清中该酶活性增加，因此，ALT常用于肝脏疾病的诊断。主要应用于以下几种肝脏疾病的检测：急性病毒性肝炎；慢性活动性肝炎、脂肪肝、恢复期的急性病毒性肝炎患者；肝硬化、肝癌；
实验八、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性测定 ——赖氏法（比色法）
目前测定ALT的方法主要有两大类：
分光光度法（速率法）
比色法（赖氏法）
实验目的
实验原理
实验步骤
结果分析
实验报告
实验目的：
熟悉ALT活性测定的方法
掌握ALT活性测定的临床意义
实验原理：
红棕色
丙酮酸2,4-二硝基苯腙的颜色深浅与丙酮酸的生成量成正比；反应体系中丙酮酸的量与血清中ALT的活性成正比。
0.1
0.5
2,4-二硝基苯肼溶液 ALT 底物缓冲液
0.5 0.5
0.5 —
混匀，置37℃保温20min 0.4mol/LNaOH溶液 5.0 5.0
混匀，室温放置10min,于30min内比色(505nm)
结果分析：
1.以吸光度值为纵坐标，对应的ALT活性单位为横坐标，
作图，绘制标准曲线；
2.根据测得标本的吸光度值，从已经绘制好的标准曲线中查得标本中ALT的卡门单位。
由其它原因引起的肝脏损害等。
实验步骤：
1.ALT标准曲线绘制
试剂(ml)/管号 0.1mol/L磷酸盐缓冲液 2.0mmol/L丙酮酸标准液 ALT底物缓冲液 2,4-二硝基苯肼溶液 0 0.10 0.00 0.50 0.50 1 0.10 0.05 0.45 0.50 2 0.10 0.10 0.40 0.50 3 0.10 0.15 0.35 0.50 4 0.10 0.20 0.30 0.50

实验六-血清丙氨酸氨基转移酶的活力测定

（2）样品测定
取2支试管，标记，按下表依次加入试剂。
管号血清/mL 基质液/mL
2，4-二硝基苯肼/mL
基质液/mL NaOH溶液/mL
对照管 0.10 ——
混匀，37℃水浴30min 0.50
混匀，37℃水浴20min 0.50 5.00
混匀，室温放置10min
测定管 0.10 0.50
0.50
—— 5.00
在505nm波长下用对照管调零，读取测定管的吸光度值，对照标准曲线求得ALT相应的酶活力单位。
【临床意义】
肝细胞中ALT含量最丰富，，当肝脏疾病导致肝细胞损伤后， ALT即大量释放进入血液中，导致血清中ALT活性明显增高。故测定ALT是检查肝功能的重要指标之一。 ALT显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死；中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞；轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、
实验六
【实验目的】
掌握赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的原理及操作；熟悉ALT标准曲线的绘制；熟悉酶活力概念；了解赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的评价
【实验原理】
赖氏法：
在37℃、pH7.4的条件下，以丙氨酸和ɑ-酮戊二酸为底物，ALT 催化生成丙酮酸和谷氨酸；丙酮酸产量的多少，即反应酶活性的大小；
试管和试管架
【实验方法】
（1试剂。
管号
空白管
1
2
3
4
5
丙酮酸标准液/mL
0
0.05 0.10
0.15
0.20
0.25
基质液/mL
0.50
0.45 0.40
0.35
0.30

丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定-精品文档

血清谷—丙转氨酶活性的测定（改良赖氏法）

【目的要求】 1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。 3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。

【实验原理】血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、 pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：

改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较为一致，能较好反映酶的真实活性。由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后，新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。
尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm 的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，结果比其他比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏法。1981年全国常规生化检验方法学术讨论会认为赖氏法测定ALT活性较为合理，全国肝炎协作会议也建议统一使用改良赖氏法。

【方法评价】 ALT活性测定主要有两类。一是卡门氏（Karman）分光光度法，测定的是酶促反应速率。其原理如下：由于NADH在波长340nm处有特异吸收峰，因此 ALT的活性可通过NADH的减少量，亦即通过 340nm吸光度的减少量间接作出定量测定。这一方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测酶ALT的底物外，还需要加入指示酶LDH及其辅酶NADH，又需用紫外分光光度计，因此不易为一般临床化验室推广。，要求各S管和U管进行双管平行操

赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶推选资料

注意事项
➢ 黄疸、高脂血症、溶血应做血清对照。 ➢ 测定值超过200单位时，应将标准稀释后再进行测定。 ➢ 控制好测定时的温度和保温时间。 ➢ 丙酮酸钠的纯度，对曲线也有影响。纯度低，曲线
斜率就低，所查得的酶活力单位可显著增加。所以如果丙酮酸钠变黄应不用。 ➢ 0.4MnaOH和2.4-二硝基苯肼的配制要准确。
赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶
[实验器材]
✓ 恒温水浴箱 ✓ 分光光度计
[实验试剂]
✓磷酸盐缓冲液 ✓基质缓冲液 ✓2.4-二硝基苯肼溶液 ✓0.4mol/l NaOH溶液 ✓丙酮酸标准液
赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶
1. 绘制标准曲线
赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶
2. 将基质缓冲液和血清在37摄氏度水浴预温5分钟
赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶
生物化学检验教研室
赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶
赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶
实验目的
掌握：赖式法测定血清丙氨酸氨基转性肝炎、胆管及胆囊炎
4-二硝基苯腙✓在碱性条件下显红棕色。
移酶的原理。赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶
赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶混匀37摄氏度水浴准确保温30分钟
临床意义
ALT增高
✓传染性肝炎及其他肝胆疾病:如肝癌、中毒性肝炎、胆管及胆囊炎
✓心血管疾病:心肌梗塞、心肌炎、脑出血 ✓骨骼疾病:多发性肌炎、肌营养不良等
课后思考
血清ALT测定的实验原理是什么？血清ALT测定的临床意义是什么？
赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶
纯度低，曲硝线基斜率苯就低肼，，所查作得的用酶生活力成单位丙可酮显著酸增加。
移酶标准曲线的绘制。
赖式法测定2.血4清-丙二氨酸硝氨基基转苯移酶腙。2.4-二硝

赖氏法实验报告

1. 掌握赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性的原理和方法。

2. 学会操作赖氏法测定ALT活性的实验步骤。

3. 熟悉ALT测定的临床应用及注意事项。

二、实验原理赖氏法是一种常用的酶偶联速率法，用于测定血清中ALT活性。

该方法利用ALT催化L-丙氨酸和α-酮戊二酸在磷酸盐缓冲液中进行反应，生成L-丙酮酸和α-酮戊二酸，同时NADH被氧化为NAD+。

在特定波长下，NADH的吸光度与ALT活性呈线性关系，通过测定吸光度变化，计算出ALT活性。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）血清样本（2）赖氏法ALT测定试剂盒（3）磷酸盐缓冲液（4）L-丙氨酸（5）α-酮戊二酸（6）NADH（7）NAD+（8）分光光度计2. 实验仪器：（1）恒温水浴箱（2）移液器（3）离心机（4）微量滴定板1. 样本处理：取血清样本，按照试剂盒说明书进行稀释。

2. 标准曲线制备：（1）取6个微量滴定板，分别加入不同浓度的标准ALT溶液。

（2）向每个板中加入一定量的磷酸盐缓冲液，混匀。

（3）加入一定量的L-丙氨酸和α-酮戊二酸，混匀。

（4）将滴定板放入恒温水浴箱中，设定反应时间。

（5）反应结束后，加入一定量的NADH和NAD+，混匀。

（6）在特定波长下测定吸光度，以ALT浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

3. 样本测定：（1）按照标准曲线制备的步骤，向微量滴定板中加入血清样本。

（2）按照标准曲线制备的步骤，进行反应和测定吸光度。

（3）根据标准曲线，计算血清样本的ALT活性。

五、结果与分析1. 标准曲线制备：根据标准曲线，得出线性方程为y=0.0068x+0.0015，其中y为吸光度，x为ALT浓度。

2. 样本测定：根据标准曲线，计算血清样本的ALT活性为40 U/L。

六、讨论1. 赖氏法测定ALT活性的原理和步骤简单，操作方便，准确度高。

2. 实验过程中，要注意反应时间的控制，以保证反应充分进行。

3. 标准曲线的制备是实验的关键环节，要确保标准曲线的线性关系良好。

血清丙氨酸氨基转移酶

准确。
医学ppt
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实验试剂：
（1）ALT底物液【2 mmol/Lα-酮戊二酸 , 20 mmol/L丙
氨酸】
（2）pH=7.4的PBS
（3）丙酮酸标准液[2 mmol/L] （4）2,4二硝基苯肼
溶液【1 mmol/L]
(5) 0.4 mmol/L NaOH
制（作）
活力的测定标准曲线的
？
答：α-酮戊二酸因其量不多，加之对520nm的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，α-酮戊二酸对于结果影响不大，测定结果也比其他比色法（金氏法（King法
）、穆氏法（Mohun 法）和赖氏法（Reitman-Frankel法））
体内，可引起高铁血红蛋白血症，出现
紫绀遇明火极易燃烧爆炸。干燥时
经震动、撞击会引起爆炸。燃烧时放出
有毒的刺激性烟雾。与氧化剂混合能形
成爆炸性混合物。【有害燃烧产物】
医学一pp氧t 化碳、二氧化碳、氮氧化物
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α-酮戊二酸也能与 2,4二硝基苯肼结合成相应的苯腙，在碱性条件下显色。对实验结果有何影响
卡氏测定ALT活力的原理
答：丙氨酸+ α-酮戊二酸 ALT 谷氨酸+丙酮酸丙酮酸+NADH 乳酸脱氢酶乳酸+NAD+
医学ppt
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小结：区别与联系
医学ppt
9
实验原理：
医学ppt
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知识链接：
• 转氨基作用
是一种α-氨基酸的α-氨基转移到一种α-酮酸上的过程。转氨
基作用是氨基酸脱氨基作用的一种途径。其实可以看成是氨

实验十五血清ALT测定（赖氏法）

实验十五血清ALT测定（赖氏法）实验十五血清ALT 测定（赖氏法）【目的】1.了解血清ALT 活性测定的原理及测定方法。

2. 掌握血清ALT 活性测定的临床意义。

【原理】丙氨酸与α-酮戊二酸在丙氨酸氨基转移酶（ALT ）的作用下生成丙酮酸和谷氨酸。

在反应到达规定时间时，加入2，4-二硝基苯肼-盐酸溶液以终止反应。

生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。

后者在碱性条件下显棕红色。

根据颜色的深浅，求得血清中丙氨酸氨基转移酶的活力。

反应式如下：C H CH 3NH 2COOHCO CH 2CH 2＋ALTCH 3CCOOHO COOHCHNH 2CH 2CH 2＋丙酮酸α-酮戊二酸丙氨酸谷氨酸C CH 3O ＋CH 3CN NO 2NO 2NH 丙酮酸NO 2NO 2NHN H 22，4-二硝基苯肼丙酮酸-2，4-二硝基苯腙（红棕色）NaOH-H 2O【器材】试管、刻度吸管、恒温水浴箱、分光光度计。

耗材：血清，座标纸等。

【试剂】1. 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4）称取磷酸氢二钠(Na 2HPO 4，AR)11.928g ，磷酸二氢钾(KH 2PO 4，AR)2.176g ，加少量蒸馏水溶解并稀释至1 000ml 。

2. ALT 底物液称取α-酮戊二酸29.2mg ，DL 丙氨酸1.79g 于烧瓶中，加0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液80ml,煮沸溶解后冷却，用1mol/L NaOH调节pH至7.4（约加入0.5ml），再用0.1mol/L 磷酸盐缓冲液在容量瓶内加至100ml，混匀，加氯仿数滴，置冰箱可保存数周。

3. 丙酮酸标准液（2μmol/ml）精确称取丙酮酸钠(AR)22.0mg于100ml容量瓶中，加0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液至刻度。

4. 2，4-二硝基苯肼溶液称取2，4-二硝基苯肼19.8mg，用10mol/L盐酸10 ml溶解后，加蒸馏水至100ml，置棕色瓶内，冰箱保存。

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定(赖氏法)

授课对象：06级检验1-5班课时：2学时血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定（赖氏法）目标：1.掌握赖氏法测血清ALT的原理及注意事项2.掌握试剂的配制熟练地制作标准曲线3.规范地进行ALT测定4.了解血清ALT测定的临床意义实验用品：配制试剂用的各种器皿（烧杯、容量瓶、电炉、分析天平等）、37℃水浴箱、721型风光光度计、坐标纸等原理：丙氨酸和α-酮戊二酸在血ALT的作用下生成丙酮酸及谷氨酸，在酶反应达到规定时间时，加入2.4-二硝基苯肼-盐酸溶液以终止反应。

生成的丙酮酸与入2.4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸入2.4二硝基苯腙，苯腙在碱性条件下显红棕色。

根据显色之深浅，求得血清中丙氨酸氨基转移酶活力。

试剂：1. 0.1molPH7.4磷酸盐缓冲液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4AR）11.928g,磷酸二氢钾（KH2PO4AR）2.176g，加少量蒸馏水溶解并稀释至1000mL。

2. ALP基质液称取DL丙氨酸[CHCH（NH）COOH]1.79g，α-酮戊二酸[COOH （COCOOH）29.2mg于烧杯中，加入0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液80mL,煮沸溶解后待冷，用摩尔NaOH溶液调节PH至7.4（约加入0.5ml），再用0.1mol/LPH7.4磷酸盐缓冲液稀释至100mL,混匀，加氯仿数滴，置冰箱保存数周。

3．1mmol/L2.4-二硝基苯肼溶液称取 2.4-二硝基苯肼[（NO）CHNHNH AR]19.8mg，用10mol/L HC110mL溶解，然后加蒸馏水至100mL，置棕色瓶内，冰箱保存。

4．0.4mol/L NaOH溶液。

5．2mmol/L丙酮酸标准液精确称取丙酮酸钠[CHCOCOONa AR]22.0mg于100mL容量瓶中，加0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液至刻度。

此液应新鲜配制，不得久放。

操作：血清ALT测定步骤（赖氏法）加入物（mL）R B血清0.1 0.1ALP基质液0.5 —混匀，置37o C水浴30min2.4-二硝基苯肼0.5 0.5ALP基质液—0.5混匀，置37o C水浴20min0.4mol/L NaOH 5.0 5.0将上述两管混匀，10min后，用蒸馏水调零，λ=505nm比色读取各管吸光度值，用测定管A-对照管A，查标准曲线得ALT活力单位。

赖氏法-ALT

赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶【原理】L-丙氨酸 + α-酮戊二酸 α-丙酮酸 + L-谷氨酸 α-丙酮酸 + 2，4-二硝基苯肼 2，4-二硝基苯腙（红棕色，λ=505nm ）利用比色分析原理将样品显色与丙酮酸标准品配制成的系列标准液比较，求出样品中丙氨酸氨基转移酶（ALT ）活性。

【试剂】1．0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液称取KH 2PO 4 13.61g ，溶解于蒸馏水中，加水至1 000ml ，4℃保存。

2．0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液称取Na 2HPO 414.22g ，溶解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml ，4℃保存。

3．0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4）取420ml 0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液和80ml 0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液，混匀，即为pH7.4的磷酸盐缓冲液。

加氯仿数滴，4℃保存。

4．基质缓冲液精确称取D-L-丙氨酸1.79g ，α-酮戊二酸29.2mg ，先溶于0.1mol/L 磷酸盐缓冲液约50ml 中，用1mol/L NaOH 调pH 至7.4，再加磷酸盐缓冲液至100ml ，4～6℃保存，该溶液可稳定2w 。

每升底物缓冲液中可加入麝香草酚0.9g 或加氯仿防腐，4℃保存。

配成200mmol/L 丙氨酸与2.0mmol/Lα-酮戊二酸基质缓冲液。

5．1.0mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液称取2，4-二硝基苯肼（AR ）19.8mg ，溶于1.0mol/L 盐酸100ml ，置棕色玻璃瓶中，室温中保存，若冰箱保存可稳定2个月。

若有结晶析出，应重新配制。

6．0.4mol/L NaOH 溶液称取NaOH 1.6g 溶解于蒸馏水中，并加蒸馏水至100ml ，置具塞塑料试剂瓶内，室温中可长期稳定。

7．2.0mmol/L 丙酮酸标准液准确称取丙酮酸钠（AR ）22.0mg ，置于100ml 容量瓶中，加0.05mol/L 硫酸至刻度。

生化检验实验赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶

步骤：一．组长取5个试剂瓶贴标签注明将要装的实际名称，然后倒取试剂。

血清由老师分装后，由组长领取。

二．测定血清ALT1.取2支试管，贴标签注明组别、学号、对照管（B）和测定管（U），用微量移液器分别加0.1ml血清。

2.用移液管向U管中加入0.5ml基质缓冲液。

B管不加。

混匀后同时在水浴温箱中37℃保温30min。

作用：U管中有酶促反应，B管无。

3.用移液管向B、U管各加0.5ml 2,4-二硝基苯肼溶液。

作用：终止反应，生成显色物质。

4.用移液管向B管加入0.5ml基质缓冲液，U管不加。

混匀后在水浴温箱中37℃保温20min。

作用：保证检测条件的一致性。

5.用移液管向B、U管各加2,4-二硝基苯肼溶液作用：碱性条件，显色。

6.B、U管室温放置5min，在波长505nm以蒸馏水调零，读取吸光度。

注意：基质缓冲液和2,4-二硝基苯肼溶液的加入顺序不能颠倒A。

表13-7三．ALT标准曲线绘制1.取5支试管，贴标签标明组别、学号、序号（0、1、2、3、4）。

用移液管取0.1 mol/l磷酸盐缓冲液，各加0.1ml。

2.用移液管取2.0 mol/l丙酮酸标准液加入各试管，0管不加，1、2、3、4管各加0.05、0.10、0.15、0.20ml。

作用：代替酶促反应产物。

3.用移液管取基质缓冲液加入各试管，0、1、2、3、4管分别加0.50、0.45、0.40、0.35、0.30ml。

4.用移液管取2,4-二硝基苯肼溶液加入各试管，各加0.5ml。

5.混匀，各试管同时在水浴温箱中37℃保温20min。

6.用移液管向各试管加2,4-二硝基苯肼溶液。

7.混匀，室温放置5min，在波长505nm以蒸馏水调零，读取吸光度A。

各管吸光度减去0管吸光度为该标准管的吸光度值。

8.以吸光度值为纵坐标，对应的卡门单位为横坐标，各标准管代表的活性单位与吸光度值作图，即成标准曲线。

表13-6。

丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测(赖氏法)规程

丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测（赖氏法）规程原理本法系依据丙氨酸氨基转移酶（Alaurine Transaminase 缩写为ALT）与由丙氨酸及α-酮戊二酸组成的底物缓冲液产生丙酮酸及谷氨酸。

丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙，在碱性溶液中显红棕色。

通过比色测定可以了解血浆中丙氨酸氨基转移酶的活力。

试剂（1）0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）准确称取磷酸氢二钠二水合物15.04g、磷酸二氢钾1.09g溶于实验用水中，补加实验用水至500ml。

然后用1mol/L HCl溶液或1mol/L NaOH溶液调整pH至7.4，密封保存。

（2）底物缓冲液（200mmol/L DL-丙氨酸；2mmol/Lα-酮戊二酸）精确称取DL-丙氨酸1.79g 和α-酮戊二酸29.2mg，用0.1mol/L磷酸盐缓冲液溶解并稀释至100ml，用1mol/L氢氧化钠（约0.5ml）调节pH值至7.4，密封保存。

（3）1mmol/L2，4-二硝基苯肼溶液称取2，4-二硝基苯肼19.8mg，用1mol/L浓度的盐酸溶液溶解，并稀释至100ml。

（4）0.4mol/L氢氧化钠溶液称取氢氧化钠16.0g，用实验用水溶解至1000ml。

（5）2mol/L氢氧化钠溶液称取氢氧化钠80g，用实验用水溶解至1000ml。

（6）2mmol/L丙酮酸标准液精确称取丙酮酸钠22.0mg，置于100ml称量瓶中，加0.05mol/L 的硫酸溶液溶解，然后移入100ml容量瓶中，再用0.05mol/L的硫酸溶液洗涤称量瓶三次，将洗涤液并入容量瓶中，补加0.05mol/L的硫酸溶液至容量瓶刻度，摇匀。

（7）1mmol/L丙酮酸标准液取2mmol/L丙酮酸标准液用0.05mol/L的硫酸溶液作1:1稀释测定法（1）试管法(单点定量)样品酶活力按下式计算样品酶活力（单位）＝样品管吸光度值÷标准管吸光度值×标准的单位（2）试管法(标准曲线)试验前将除氢氧化钠外检测试剂预热至37℃后使用。

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定

器材：分光光度计、半自动生化分析仪、恒温水浴箱、微量进样
器、移液管等。
待测标本：血清
2020/3/23
8
标准曲线的绘制（改良赖氏法）
❖ 取干净试管5支标明管号，按下表所示操作。
加入物（ml）
0
1
2
3
4
0.1mol/L磷酸盐缓冲液 2.0mmol/L丙酮酸标准液
基质缓冲液 2,4二硝基苯肼溶液
0.4mol/L NaOH溶液
二硝基苯肼溶液，氢氧化钠溶液（0.4mol/ L），丙酮酸标准液
（2.0mmol/L ）
连续监测法用试剂盒。
试剂1：Tris缓冲液【100mmol/L（pH7.5）】，NADH（0.2mmol/L）， LDH （＞1350U/L）；
试剂2：Tris缓冲液【100mmol/L（pH7.5）】，α-酮戊二酸（50mmol/L），L-丙氨酸（400mmol/L）。
完全。加入NaOH溶液的方法和速度要一致，不同的
方法及速度也会导致吸光度读数的差异。
5、底物中的α-酮戊二酸和2，4-二硝基苯肼均为呈色物
质，称量必须很准确，每批试剂的空白管吸光度上下
波动不应超过0.015，如超出次范围，应检查试剂及
仪器等方面的问题。
6、当血清标本酶活力超过150卡门氏单连续监测法）
L-丙氨酸+α-酮戊二酸丙酮酸+NADH
ALT 丙酮酸+L-谷氨酸
LD L-乳酸+NAD+
在340nm连续监测NADH的消耗量，从而计算出ALT的活力。
2020/3/23
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主要试剂、材料与仪器
改良赖氏法试剂：0.1mol/ L磷酸盐缓冲液、基质缓冲液、2,4-

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定(改良赖氏法)

谢谢！
实验试剂

1.ALT底物液：称取分析纯α-酮戊二酸39.2mg，丙氨酸1.78g，置于干净小烧杯内，先用50ml碳酸缓冲液（pH=7.4）溶解，然后用 1mol/LNaOH校正pH至7.4（约需0.5ml），再以pH7.4的磷酸缓冲液稀释至100ml，加氯仿数滴，防止变质。 2.pH=7.4磷酸缓冲液（PBS）：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4)13.97g及磷酸二氢钠（KH2PO4)2.69g溶解于1000ml蒸馏水中 3.丙酮酸标准液（2mmol/L）：准确称取干燥至恒重的丙酮酸钠22mg，以磷酸缓冲液洗入100ml容量瓶中，混合，再以磷酸缓冲液稀释至刻度。本液应新鲜配制。 4. 2，4-二硝基苯肼溶液（1mol/L）：称取2，4-二硝基苯肼19.8mg先溶于10ml 1.0mol/LHCL中，溶解后，加水至100ml。 5.0.4mol/LNaOH
掌握血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的方法改良赖氏法和临床意义酮戊二酸作为第底物经转氨酶的作用生成谷氨酸和丙酮酸然后测定丙酮酸的生成量即可计算酶活性的大生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的24二硝基苯肼发生加成反应生成丙酮酸24二硝基苯腙进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量亦即与alt活性的高低成正比关系
临床意义

ALT（GPT)广泛存在于机体各种组织中，但在肝细胞中含量最多，当肝脏有病变，特别是急性肝炎及肝细胞坏死是，血清中ALT活性显著升高。在肝癌、肝硬变以及胆道疾病时，此酶活性也可或轻度增高。另外，其他脏器或组织的疾病，该酶活性也升高。
注意事项

1.不同血清对照管光密度基本相同，因此，同一批标本制作2~3个血清对照管求其平均值即可，亦可用空白管代替对照管。对超过正常的标本进行复查时，每份标本均应作对照管。 2.严重脂血症、黄疸或溶血的血清都能引起测定管OD值增加，因此，检查此类标本时，应做血清对照管。 3.赖氏法标准曲线只到97卡门氏单位，其线性关系良好。超过此活力的标本，应将血清稀释后再测定，结果乘以稀释倍数。 4.ALT底物液与2，4-二硝基苯肼液配置要准确，每次测定时空白管的 OD值上下波动不应超过0.015.如超出此范围应检查试剂及仪器等方面的问题。 5.除了丙酮酸与2，4-二硝基苯肼再碱性溶液中能成腙外，α -酮戊酸亦能与2，4-二硝基苯肼产生苯腙，两种苯腙的吸光度在520nm处有较大差异，因此超过一定范围时，该方法所绘制的标准曲线呈抛物线。

生化检验实验ALT ALP

实验十实验名称：血清中ALT的测定实验目的与要求：掌握赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的原理。

实验仪器、试剂：丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒，分光光度计实验原理：血清中的丙氨酸氨基转移酶催化丙氨酸和α-酮戊二酸生成丙酮酸和谷氨酸，丙酮酸与2，4-二硝基苯肼反应生成2，4-二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，可测定其吸光度值，通过标准曲线计算出丙氨酸氨基转移酶的活力。

操作方法：1、将NaOH溶液稀释10倍，至0.4mol/L，基质液37℃水浴。

2、标准曲线的绘制，取5支试管，按下表分别加入试剂，试管0 1 2 3 4生理盐水（ml）0.1 0.1 0.1 0.1 0.1丙酮酸标准(ml) 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20基质液（ml）0.50 0.45 0.40 0.35 0.30活力单位0 28 57 97 150各管加入2，4-二硝基苯肼0.50ml混匀，37℃水浴20分钟,再分别加入0.4mol/LNaOH溶液5.0ml,室温10分钟。

以“0”管调零，505nm测定吸光度，以吸光度为纵坐标，酶活力单位为横坐标绘制标准图。

3、取试管2支，按如下操作：单位ml 测定对照血清0.10 0.10基质液0.50 -混匀，37℃水浴30min2，4-二硝基苯肼0.50 0.50基质液-0.50混匀，37℃水浴20min加入0.4mol/LNaOH溶液5.0ml，室温10分钟。

以对照管调零，505nm测定吸光度，实验现象与数据：记录吸光度值结果分析与结论：在标准曲线上查得酶活力单位。

参考值：0－25临床意义：实验十一实验名称：血清碱性磷酸酶的测定实验目的与要求：掌握AMP法测定血清碱性磷酸酶的原理。

实验仪器、试剂：碱性磷酸酶测定试剂盒半自动生化分析仪实验原理：血清中碱性磷酸酶在碱性条件下将磷酸-4-硝基苯酚中的磷酸基转移到2-氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP）并释放4-硝基苯酚。

在405nm处测定4-硝基苯酚生成的速率，即可计算出ALP的活性。

标曲线血清丙氨酸氨基转移酶测定(赖氏法.

3. 标本的测定按表2操作。

表二：
对照管基质液（ul）样品（ul）显色剂 50 250 μ L 混合37℃水浴30分钟 250 μ L 样品管 250 50
基质液（ul） 37℃水浴20分钟
稀释氢氧化钠
250
2.5ml 2.5ml
室温放置3min，在波长510nm处，以蒸馏水调零，读取各管吸光度。
血清丙氨酸氨基转移酶测定（赖氏法）
【实验要求】掌握血清丙氨酸氨基转移酶测定（赖氏法）的原理操作方法及标准曲线的绘制；了解试剂的配制和临床意义。

【实验原理】

L-丙氨酸与α -酮戊二酸在丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT，EC 2.6.1.2）催化下生成丙酮酸和L-谷氨酸，加入 2，4-二硝基苯肼终止酶反应，并与丙酮酸生成丙酮酸-2，4-二硝基苯腙，苯腙在碱性条件下显红棕色，在波长510nm处读取吸光度，即可计算出丙氨酸氨基转移酶的活性。
【计算】以空白调零，测定管吸光度减去对照管吸光度的差值为标本的吸光度，用该值在标准曲线上查得ALT的卡门单位。或者以对照管调零，直接读出测定管吸光度值，用该值在标准曲线上查得ALT的卡门单位。

【参考范围】 0～50卡门单位【临床意义】 1.血清ALT活性增高可见于下述疾病：（1）肝胆疾病传染性肝炎、肝癌、肝硬化活动期、中毒性肝炎、脂肪肝、胆管炎和胆囊炎等；（2）心血管疾病心肌梗死、心肌炎、心力衰竭时的肝脏淤血、脑出血等；（3）骨骼肌疾病多发性肌炎、肌营养不良等。 2.一些药物和毒物可引起ALT活性升高如氯丙嗪、异烟肼、利福平、奎宁、地巴唑、水杨酸制剂、乙醇、铅、汞、四氯化碳、有机磷等。停药后ALT活性就可下降。

赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶

实验十九赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶【原理】L-丙氨酸 + α-酮戊二酸α-丙酮酸 + L-谷氨酸 α-丙酮酸 + 2，4-二硝基苯肼2，4-二硝基苯腙（红棕色，λ=505nm ）利用比色分析原理将样品显色与丙酮酸标准品配制成的系列标准液比较，求出样品中丙氨酸氨基转移酶（ALT ）活性。