DNS-氨基酸的制备和鉴定
学习指南6 DNS-氨基酸的制备和鉴定
DNS-氨基酸的制备和鉴定——学习指南l 学习重点1. 掌握薄膜层析的基本原理和操作。
2. 学习DNS-标记法在氨基酸、肽和蛋白质分析中的应用。
l 知识要点1. 层析：利用混合物的各组分在固定相和流动相分配系数的差异，从而达到分离的目的。
根据支持介质的不同，层析可分为纸层析、薄膜层析、薄层层析和柱层析等。
本实验采用双向层析法，I 向和II 向展层选用不同的溶剂系统，可获得更好的分离效果。
2. 迁移率R f 值：样品点移动距离与溶剂移动距离的比值。
在同一展层系统中，R f 值差异越大，分离效果越好。
3. 聚酰胺：己二酸和己二胺的高聚物，含有大量酰胺基团，能与多种极性基团，如氨基酸的羧基和侧链基团形成氢键。
化合物中不同分离物质在溶剂与聚酰胺薄膜之间的分配系数不同，以达到分离的目的。
(CH 2)6C O(CH 2)4COn4. DNS-Cl ：又称5-二甲氨基-1-萘磺酰氯，是一种荧光试剂。
在弱碱性条件下可与氨基酸的α-氨基反应，生成DNS-氨基酸。
在紫外光照射下，DNS-氨基酸可产生黄绿色荧光，具有很高的检测灵敏度。
黄绿色荧光l 试剂1. 2.5mg/mL DNS-Cl 丙酮溶液。
2. 三种氨基酸混合液（Gly 、Phe 、His ）。
3. 三乙胺。
4. 展层液I ：苯:冰醋酸（V/V ）=9:1； 展层液II ：甲酸:水（V/V ）=1.5:100。
l 仪器聚酰胺薄膜、毛细点样管、旋涡混合仪、层析缸、恒温水浴锅、电吹风、紫外分析仪 l 操作l 注意事项1. 严格控制点样位置以及点样直径，点样点应始终保持在展层溶剂液面以上，点样需少量分次，保证点样点小且圆。
2. I 向层析结束后，注意聚酰胺薄膜转动的方向，便于和标准图谱对照。
3. 苯对人身体有害，实验应在通风橱中进行并保持室内通风良好。
DNS法分析蛋白质末端氨基酸
三、实验器材 ①紫外灯 ②烘箱 ③恒温箱 ④聚酰胺薄膜 ⑤层析缸
⑥吹风机
⑦毛细管。
四、材料与试剂 结晶胰岛素 0．2mol／LNaHC03 1mol／LNaOH 乙酸乙酯 DNS-C1丙酮溶液(25mg／mL) 6mol／LHCl 展层溶剂： 甲酸：水=1．5：100(V／V)(第一相) 苯：冰乙基酸的层析：将聚酰氨薄膜剪成7cmX7cm的方块， 距边lcm处画上一直线作为基线，基线上画几个X点，作 为点样起始点。
点样：将DNS-胰岛素水解液与DNS-甘氨酸，DNS-苯丙氨酸 一起点在基线X处，点样直径不超过2mm，每点完一次， 用吹风机吹干。
展层：将点完样品的薄膜光面向外，聚酰氨面向内，用橡 皮筋或照相底片圈(用lmol／LNaOH溶液煮过)箍住，置 于装有第一相层层溶剂的培养皿中，进行单向层层，直 到溶剂前沿距顶1cm，取出薄膜吹干。将聚酰胺薄膜倒 转90℃，在第二相溶剂进行第二向层层，直到溶剂前沿 距顶端lcm处，取出聚酰氨薄膜，吹干。
⑤结果分析：将层析后的薄膜置于254nm或 265nm的紫外灯下观察，将绿色荧光点画在膜 上，通过样品水解N-末端氨基酸与DNS-甘氨 酸，DNS-苯丙氨酸的层析位置比较，证明胰岛 素N-末端是哪一种氨基酸?
六、思考题 1．聚酰胺薄膜层析具有哪些特点? 2．胰岛素N-末端是哪一种氨基酸?
DNS-C1能与所有的氨基酸作用生成具有荧光的衍生物， 这些衍生物都相当稳定，在5.7mol／L盐酸溶液中经105℃ 条件下水解22h，除DNS-色氨酸全部被破坏，DNS-脯氨酸、 DNS-丝氨酸(35％)、DNS-甘氨酸(18％)及DNS-丙氨酸(70 ％)也被破坏，但其他DNS-氨基酸没有任何损失。
生化实验三 Dansyl—氨基酸的聚酰胺薄膜层析法
实验四Dansyl—氨基酸的聚酰胺薄膜层析法实验目的1．学习聚酰胺薄膜层析法的原理。
2．学习利用Dansyl—氨基酸分析蛋白质N末端氨基酸及蛋白质组成的原理。
3．掌握制备Dansyl氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法。
实验原理聚酰胺是一类化学纤维原料，又称锦纶或尼龙。
它对许多极性化合物有吸附作用，具有特异的分辨性能，可用于柱层析、薄层层析及薄膜层析。
聚酰胺薄膜是将锦纶涂布于涤纶片上，形成质地均匀的紧密的多孔薄膜，层析性能十分优良。
聚酰胺的化学结构如右。
由于聚酰胺的—C=O基及—NH基可与被分离物质形成氢键，因此可以吸附酸类、酚类、醌类、硝基及胺基化合物等。
由于各种物质与聚酰胺形成氢键的能力不同，即聚酰胺对各种物质的吸附能力不同。
而在层析过程中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。
因此，选择适当的层层溶剂，可使各种待分离物质在聚酰胺表面与溶剂之间有不同的分配系数，经过吸附与解吸附的展层过程，各自按一定次序分离开来。
与纸层析及纸电泳等方法相比，聚酰胺薄膜层析在分析氨基酸衍生物时具有灵敏度高、分辨力强、速度快、操作方便等优点。
除用于氨基酸衍生物的分析外，还可用于碱基、核苷酸、核苷、酚类、酚类糖苷、硝基化合物、杂环化合物、环酮、抗菌素、磺胺、合成染料等十几类化合物。
荧光试剂Dansyl—C1(二甲基氨基萘磺酰氯)可与氨基酸结合成带有荧光的Dansyl —氨基酸。
Dansyl—氨基酸在酸性条件下可被乙酸乙酯萃取出来，经聚酰胺薄膜层析后斑点集中，仅10—9至10—10克分子即可被检识，所以灵敏度很高。
用作蛋白质末端基分析，比DNP氨基酸纸层析法灵敏度高100倍；用于氨基酸组成的微量分析，比茚三酮显色法灵敏度高10多倍。
聚酰胺薄膜层析的展层速度也比纸层析快得多，单向层层7厘米只需15—20分钟。
但用于定量，需要特殊仪器，目前多用于定性鉴定。
Dansyl—C1能与所有的氨基酸作用生成具荧光的衍生物。
氨基酸的分离与鉴定
实验一氨基酸的分离与鉴定——滤纸层析法目的要求（1）通过实验，了解氨基酸滤纸层析法的原理。
（2）掌握氨基酸滤纸层析的操作方法。
原理滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析（它也并存着吸附和离子交换作用）。
滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。
有机溶剂自上而下流动称为下行层析，自下而上流动称为上行层析。
流动相流经支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。
溶质在滤纸上的移动速率用R f值表示：溶质结构、溶剂系统物质组成与比例、pH值、选用滤纸质地和温度等因素都会影响R f 值。
此外，样品中的盐分、其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。
无色物质的纸层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定。
氨基酸纸层析图谱常用的显色剂为茚三酮或吲哚醌，本实验采用茚三酮为显色剂。
本实验用单向上行层析法作标准氨基酸的标准曲线，用双向上行纸层析法作几种已知氨基酸的层析图谱。
然后将其中的谷氨酸和天冬氨酸加以定量测定。
试剂和器材一、试剂（1）8×10-3mol/L谷氨酸和8×10-3mol/L天冬氨酸混合液。
（2）谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸和丙氨酸混合液（已知氨基酸混合液）。
将以上氨基酸分别配制成8×10-3mol/L的浓度，然后混合之。
（3）茚三酮重结晶方法：茚三酮有时由于包装不好或放置不当常带微红色，需重结晶方可使用。
5g茚三酮溶于15mL热水，加入0.25g活性炭轻轻搅动，若溶液太浓不易操作，可酌量加5—10mL热水，加热30min后趁热过滤（用热滤漏斗，以免茚三酮遇冷结晶而损失），滤液置冰箱内过夜，次日晨即见黄白色结晶出现，过滤，再以1mL冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，最后装入棕色瓶内保存。
（4）0.1%硫酸铜（CuSO4·5H2O）：75%乙醇=2 ：38硫酸铜难溶于乙醇，将硫酸铜直接用75%乙醇溶解不能得到澄清溶液，如将硫酸铜溶液和乙醇混合后，放置过久则会有沉淀析出，因此，必须在临用前按比例混合。
dns紫外分光光度法
dns紫外分光光度法DNS紫外分光光度法是一种广泛应用于分子生物学领域的分析技术，其能够准确测定DNA、RNA以及蛋白质等生物大分子物质的浓度和纯度。
本文将从以下几个方面进行介绍。
一、DNS紫外分光光度法的原理DNS紫外分光光度法是利用生物大分子物质对紫外光的吸收来测定其浓度和纯度的方法。
在285-300nm波长范围内，DNA、RNA和蛋白质等分子会吸收较多的紫外光。
DNS试剂在这样的紫外光照射下被物质还原为DNB，且DNB的产生与样品中丝氨酸、组氨酸、酪氨酸等氨基酸的含量成正比。
这样，通过对样品与标准品在波长范围内的吸收值进行比较，可计算出样品中的生物大分子物质的浓度和纯度。
二、DNS紫外分光光度法的步骤1. 制备DNS试剂：将1g 3,5-二硝基水杨酸溶于100ml浓硫酸中，加入冰水中，使其在冰水中降温结晶，将产生的白色晶体过滤、清洗并干燥，即得到DNS试剂。
2. 样品准备：将待测样品制备成一定浓度的溶液，一般为50～100μg/ml, 要求样品溶液中无酶及其他干扰物质。
同时，还需准备一系列标准样品。
3. 测定吸光度值：将样品与标准样品分别加入量刚好的稀释液中，然后在波长范围内进行吸光度测定，记录吸光度值。
4. 计算生物大分子物质的浓度和纯度：根据吸光度计算样品中生物大分子物质的浓度和纯度，并将其与标准品的吸光度值对比，判断样品是否纯度高、浓度精确。
三、DNS紫外分光光度法的应用DNS紫外分光光度法在蛋白质纯化、定量、质量控制等方面具有广泛应用。
它不仅可以用于测定DNA、RNA和蛋白质的浓度和纯度，还可以用于判断DNA、RNA的纯度以及分子量大小。
四、DNS紫外分光光度法的优缺点优点：具有简便操作、准确可靠、灵敏度高、测量速度快等优点，适用于大量样品的测定。
缺点：DNS试剂的稳定性差，易降解和硫酸等化学物品使用过程需要注意操作安全性与环保性等问题。
综上所述，DNS紫外分光光度法是一种简单而有效的生物大分子物质测定方法，其具有极高的应用价值以及很广的适用范围。
DNS-氨基酸的制备和鉴定实验报告
DNS-氨基酸的制备和鉴定一、前言薄层层析又称薄层色谱，色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种重要实验技术，属固-液吸附色谱，兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品(几微克，甚至0.01微克)的分离;另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，因此，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。
是将吸附剂、载体或其他活性物质均匀涂铺在平面板(如玻璃板、塑料片、金属片等)上，形成薄层(常用厚度为0.25毫米左右)后，在此薄层上进行层析分离的分析方法。
吸附一种物质被聚集在另一种物质表面的现象。
吸附剂凡是能够将其他物质聚集到本身分子表面的物质称为吸附剂，如氧化铝、硅胶等。
被吸附物聚集在吸附剂表面的分子就称为被吸附物。
吸附层析各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心,利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离.常用吸附剂极性：a.硅胶:为首选吸附剂。
本身具微酸性，适用于分离酸性及中性物质。
b.氧化铝:氧化铝具有分离能力强、活性可以控制等优点。
碱性/中性/酸性氧化铝非极性：a.纤维素b.聚酰胺：合成：己二酸、己二胺。
特点：氢键吸附剂。
聚酰胺是—类化学纤维原料，即锦纶(又称尼龙)。
由己二酸与己二胺聚合而成。
因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。
溶剂选择不同溶剂具有不同的结构性质，依极性大小各种溶剂的洗脱能力各不相同。
一般所选溶剂要求：a.纯度合格；b.黏度要小→易与样品中各组分相分离；c.与所欲分离样品和吸附剂不起化学反应。
荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯简称DNS-Cl，在弱酸性（pH9.0左右）条件下可与氨基酸的α-氨基反应，生成带黄绿荧光的DNS-氨基酸。
二、实验目的1.了解并掌握用DNS-氨基酸的制备和鉴定。
三、实验原理DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法分离，所得层析图与DNS-标准氨基酸层析图谱相对比，可借此鉴定样品中国氨基酸的种类，用此法鉴定蛋白质N-端氨基酸比FDNB法灵敏100倍，仅10-10~10-9mol 样品即可检出，产物也比DNP-氨基酸稳定，且操作简便，快速。
实验五 DNS法分析蛋白质N-末端
3、乙酸乙酯抽提
DNS-氨基酸在酸性条件下(pH2～3)一般都可被乙酸乙酯 抽提，然后取乙酸乙酯层点样层析，这样大量DNS-C1的 反应副产物DNS-OH可留于水相，干扰因素减少，所得层 析图谱清晰。但若是DNS-精氨酸，DNS-天冬氨酸， DNS-谷氨酸，DNS-苏氨酸，DNS-丝氨酸则它们大部分 或部分留于水相，往往会被遗漏，而导致错误结论。这时 可将样品浓缩干，用甲醇直接溶解后点样，由于上述 DNS-氨基酸的层析位置都位于DNS-OH的下侧，影响不 大，这一点在测定多肽或蛋白质的N末端时要特别注意。
实验方法
聚酰胺薄膜层析
点样 层析
注意事项
1、点样斑点不宜太大，用毛细管可分2-3次点，点 一次吹干一次。 2、层析时层析液不能没过斑点，要在斑点以下。 3、观察时，用铅笔圈好黄色亮点。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
思
考
• 网上查询蛋白质结构分析最新动态． • 薄膜层析与其它层析法比较有那些优点？ • 选用展层剂的依据是什么？
有关资料
序列测定（sequencing）已有50多年的历史，但开始时进展 序列测定 十分缓慢。最初，人们致力于建立蛋白质 多肽的 蛋白质和多肽的 蛋白质 多肽的分离技 术，并确定其氨基酸种 氨基酸种类及含量。1945以前，没有任何蛋白 氨基酸种 质序列定量测定的方法。以后十年中，由于色谱技术和标记 方法的快速进展，第一个多肽激素（胰岛素）的全序列测定 于1955年完成（Ryle等，1955）。五年后，第一个酶（核 1955 Ryle 1955 糖核酸酶）序列测定完成（Hirs等，1960年）。1965年，约 有20个含100多个残基的蛋白质序列被确定。截止1980年， 这一数字已达1500个。而今天，已测定的蛋白质序列已达30 万个，这在50年前是难以想象的。
“蛋白质N末端氨基酸测定——DNS-Cl法”生化实验报告
蛋白质N末端氨基酸测定——DNS-Cl法操作人：XXX 时间：XXXX 地点：XXXX 温度：16℃实验目的：1.了解蛋白质N末端氨基酸的测定方法。
2.了解DNS-Cl法测定N末端氨基酸的原理。
3.学会使用层析法测定物质组成。
实验原理：（1）DNS-Cl为一种荧光化学剂，pH10左右，DNS-Cl可以与蛋白质N末端α-氨基酸发生反应，生成DNS-蛋白质。
DNS-Cl与末端氨基酸形成的化学键非常稳定，经6M的HCl水解后，蛋白质的肽键被破坏，DNS-N末端氨基酸被水解游离。
（2）在酸性条件下，利用乙酸乙酯可萃取提纯水解游离的DNS-N末端氨基酸，且因DNS-N末端氨基酸在紫外灯照射下，可发出荧光，故便用于后续检测。
（3）层析法基本原理是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。
所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，另一是流动相。
当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量比）不同，且随流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。
分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。
试验方法与过程：1.制备DNS-标准氨基酸：分别吸取0.3ml标准氨基酸（缬氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸）于各小试管中，加入0.2mlDNS-Cl丙酮溶液，摇匀，封口，于40℃水浴锅中保温20min；取出后用吹风机加热，除去丙酮，剩余溶液用0.1MHCl酸化至PH值为2-2.5；加入乙酸乙酯300μL。
摇匀。
待分层。
2.聚酰胺薄膜层析：取聚酰胺薄膜一张，在距边线1cm处用铅笔做四个记号，分别用毛细管取分层后的乙酸乙酯层点于薄膜上，将下端浸入展层剂（甲酸：水=1.5：100），待展层剂到达距薄膜上部1cm 左右终止层析，取出吹干，在紫外灯下观察荧光点，拍照。
3.计算Rf 值：把在紫外灯下观察到的荧光点标于薄膜上，测量距离。
经典生理生化试验2
实验十九DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N—末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N—末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。
二、原理：DNS—Cl在碱性环境里蛋白质和肽的α-氨基酸的氨基起反应，生成带有荧光的、稳定的DNS-氨基酸（参看图19-1，19-2），其反应如下：蛋白质在水解前与DNS—Cl反应，产生DNS-蛋白质，它标记在N-末端氨基酸残基上，经水解和薄层层析而测知是何种氨基酸。
蛋白质水解后与DNS—Cl反应，标记的是蛋白质的氨基酸组成成分，如图19-1和图19-2所示。
这是一种较为简便的、适用的蛋白质的氨基酸组成成分分析的方法。
DNS-蛋白质水解产物中包括下列DNS-衍生物：相当于N-末端的α-DNS-氨基酸，从链内赖氨酸及酪氨酸残基形成的ε-DNS-赖氨酸和O-DNS-酪氨酸，这些衍生物相当稳定。
此外，DNS—Cl还与溶液中的氨起反应生成DNS—NH2，DNS-磺酰胺以及DNS—Cl水解生成的DNS—OH（DNS-磺酸）。
此法与氟二硝基苯法相比，有二个突出的优点，即水解产物无需提取，可用电泳或层析法直接鉴定氨基酸；另外就是灵敏度高，DNS-氨基酸的最大荧光激发值约为550nm，由于其荧光十分强烈，1—5n mol·L-1或0.2—1.0n mol·L-1 DNS-衍生物即可分别用电泳或薄层层析容易地检测。
DNS—Cl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物。
其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可与DNS—Cl生成双DNS-氨基酸衍生物。
这些氨基酸相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度达10—9—10—10摩尔水平。
比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的氟二硝基苯（FDNB）法高100倍。
DNS-蛋白质（或肽），在5.7mol·L-1 HCl，110℃水解16—20h，DNS-蛋白质的肽键被打开。
DNS-氨基酸的制备和鉴定-
DNS-氨基酸的制备和鉴定实验目的1.了解并掌握DNS-氨基酸的制备和鉴定的原理2.掌握制备Dansyl氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法实验原理荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯(dansyl-Cl，简称DNS-Cl)在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)的氨基结合成带有荧光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白质)，DNS-氨基酸再经酸水解可释放出DNS-氨基酸，其反应式如下：图1：DNS-氨基酸生成反应机理图2：单项层析结果示意图DNS-Cl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。
这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10－10～10－9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB 法高100倍。
将Edman法和DNS法结合起来(称为Edman-DNS法)应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。
DNS-Cl在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH，即：图3：DNS-Cl在pH过高水解产生DNS-OH在DNS-Cl过量时，会产生DNS-NH2，即：图4：DNS-Cl过量产生DNS-NH2DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄绿色荧光，而DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光，可彼此区分开。
DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄膜上检测灵敏度为0.01ug(相当于10—10mol)。
由于它具有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分析。
层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。
实验三 Dansyl—氨基酸的聚酰胺薄膜层析法
实验四 Dansyl —氨基酸的聚酰胺薄膜层析法实验目的1．学习聚酰胺薄膜层析法的原理。
2．学习利用Dansyl —氨基酸分析蛋白质N 末端氨基酸及蛋白质组成的原理。
3．掌握制备Dansyl 氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法。
实验原理聚酰胺是一类化学纤维原料，又称锦纶或尼龙。
它对许多极性化合物有吸附作用，具有特异的分辨性能，可用于柱层析、薄层层析及薄膜层析。
与纸层析及纸电泳等方法相比，聚酰胺薄膜层析在分析氨基酸衍生物时具有灵敏度高、分辨力强、速度快、操作方便等优点。
除用于氨基酸衍生物的分析外，还可用于碱基、核苷酸、核苷、酚类、酚类糖苷、硝基化合物、杂环化合物、环酮、抗菌素、磺胺、合成染料等十几类化合物。
荧光试剂Dansyl —C1(二甲基氨基萘磺酰氯)可与氨基酸结合成带有荧光的Dansyl —氨基酸。
Dansyl —氨基酸在酸性条件下可被乙酸乙酯萃取出来，经聚酰胺薄膜层析后斑点集中，仅10—9至10—10克分子即可被检识，所以灵敏度很高。
用作蛋白质末端基分析，比DNP 氨基酸纸层析法灵敏度高100倍；用于氨基酸组成的微量分析，比茚三酮显色法灵敏度高10多倍。
聚酰胺薄膜层析的展层速度也比纸层析快得多，单向层层7厘米只需15—20分钟。
但用于定量，需要特殊仪器，目前多用于定性鉴定。
Dansyl —C1能与所有的氨基酸作用生成具荧光的衍生物。
这些衍生物都相当稳定，在5.7N 盐酸溶液中经105℃加热22小时，除Dansyl —色氨酸全部被破坏以及Dansyl聚酰胺薄膜是将锦纶涂布于涤纶片上，形成质地均匀的紧密的多孔薄膜，层析性能十分优良。
聚酰胺的化学结构如右。
由于聚酰胺的—C=O 基及—NH 基可与被分离物质形成氢键，因此可以吸附酸类、酚类、醌类、硝基及胺基化合物等。
由于各种物质与聚酰胺形成氢键的能力不同，即聚酰胺对各种物质的吸附能力不同。
而在层析过程中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。
氨基酸聚酰胺薄膜层析
氨基酸聚酰胺薄膜层析——DNS-Cl法一、实验目的：1．掌握聚酰胺薄膜层析技术的基本方法和应用。
2．熟悉蛋白质及肽的N末端氨基酸DNS分析法。
二、实验原理：.1.层析技术①概念：是利用化合物中各组分的物理性质的差别（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性等）使各组分在两相中的分布不同，从而使各组分以不同速度随流动相向前移动而达到分离的目的。
②特点：分离效率高，能分离各种性质相类似的物质。
不仅可用于少量物质的分离纯分，也可用于大量物质的分离纯化和制备。
③层析法的分类气相层析（以气体为流动相的层析法）液相层析（以液体为流动相的层析法，此为生物化学领域里常用的方法）I.吸附层析：薄层吸附层析、吸附柱层析II.分配层析：纸层析、柱层析、薄层层析III.离子交换层析IV.凝胶层析：柱层析、薄膜层析V.亲和层析④纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。
纸层析法是用滤纸为支持物进行层析的方法，所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。
溶剂由下向上移动的，称上行法；由上向下移动的，称下行法。
将样品点在滤纸上(此点称为原点)，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。
由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：Rf=原点到层析斑点的距离/原点到溶剂前沿的距离在一定条件下某种物质的Rf值是常数。
Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。
只要条件(如温度、展层溶剂的组成)不变，Rf 值是常数，故可根据Rf值作定性判断。
样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的Rf值相同或相近，此时如只用一种溶剂展层，就不能将它们分开。
01 实验一 蛋白质N末端氨基酸的鉴定(二甲氨基萘磺酰氯,DNS-Cl,胰岛素)
蛋白质N末端氨基酸的鉴定
（DNS-CL法测定胰岛素的N末端）
DNS-Cl标记氨基酸N末端
二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）与氨基酸 (多肽、蛋白质）N末端的氨基反应，分别生 成有荧光标记的DNS-氨基酸（多肽、蛋白 质），在紫外光照射时发出黄绿色荧光。
灵敏度10-10摩尔。
DNS化反应
胰岛素
试剂配制
▪ 0.20 mol/NaHCO3溶液：（84.01 g/mol） 16.8 g，加1000 mL水。
▪ 1.0 mol/L HCl溶液：50 mL浓HCl，加550 mL水
▪ 展层剂：甲酸（88%）:水 = 1.5:100（V/V）
▪
用DNS-Cl标记氨基酸标准品的N末端。
（本实验只标记Gly和Phe两种氨基酸标准品）
聚酰胺薄膜层析
分离原理：各种被分离化合物在展层剂中的溶 解度及其与聚酰胺形成氢键能力的大小的不同， 决定它们在展层过程中迁移的速度差异。
聚酰胺
己二酸和己二胺的聚合物，含有大量酰胺基团。
nHOOC(CH2)4COOH + nH2N(CH2)6NH2 → -HN-CO-(CH2)4-CO-NH(CH2)6NH-CO-
1
2
3
溶剂前沿 1.0 cm
DNS-氨基酸双向展层
试剂配制
▪ DNS-Cl溶液：2.5 mg/mL，用丙酮配制， 在棕色试剂瓶中保存。
▪ Gly溶液：0.40 mg，加1.0 mL 0.20 mol/L NaHCO3
▪ Phe溶液：0.96 mg，加1.0 mL 0.20 mol/L NaHCO3
老师准备！
DNS-氨基酸的萃取
取2只0.5 mL离心管，做好标记（Gly、Phe）
DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白
葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越 大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大。
G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字既代表交联度，也代表特水量。X数字越小，交
联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。X数字越大，交联度越小，网
颜色不同可直接观察到血红蛋白洗脱较快，鱼精蛋白洗脱较慢。
G类葡聚糖凝胶（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是一种以右旋葡萄 糖为残基的多糖，分子间主要是α-1,6-糖苷键（约占95%），分枝为l,3-糖苷键 （约占5%），以1-氯-2,3-环氧丙烷为交联剂将链状结构连接为三维空间的网状 结构的高分子化合物。
叶绿素通过碳酸钙管柱所形成的色谱图
层析的两种相
固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换 剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分 离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体
外水体积为Vo，内水体积为Vi，基质体积为Vg，则有：
Vt＝Vo＋Vi＋Vg 由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有：
Vt＝Vo＋Vi
外水体积（V0）
内水体积（Vi）
基质体积（Vg）
柱床体积（Vt）
凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）
样 品 的 量
洗脱体积
当分子的Kd＝0时，Ve＝Vo即该分子被完全排阻于凝胶颗粒之外，全部分布于流动 相里，固定相里分布为零（A)； 当分子的Kd＝1时，Ve＝Vo+Vi即该分子完全不被排阻，均匀的分布在流动相和固 定相里，两相比值为1(C)；
实验七 丹磺酰化法分析蛋白质 N—末端氨基酸
点样
层析
紫外
观察
点 样 模 式 图
标 准 氨 基 酸 1
标 准 氨 基 酸 2
标 准 氨 基 酸 3
标 准 氨 基 酸 4
蛋 白 质 样 品 1
蛋 白 质 样 品 2
返 回
四、记录实验结果
根据展层结果，绘制层析结果图，并标明 未知蛋白的N-末端的氨基酸种类 预 备 实 验 层 析 图
加入0.1ml丙酮定容，作为点样样品
3. DNS-氨基酸的层析与检测
取7 ╳ 7cm薄膜一块，距底1 cm 处用铅笔轻画 一直线，依次轻画间距为1cm的六个点样点
用毛细管取样，在点样位置上点样2~3次，每点一次 ，吹干一次，点样直径应小于2mm，做好点样记录 将膜展成筒形，样品在筒内，箍以橡皮筋固定。向 60mm培养皿中倒入展层液10ml左右，将膜垂直放入 ，外罩一烧杯，进行层析 展层液上升至顶端约0.5cm时，取出，稍干后放入紫 外灯（360nm或280nm)下观察
实验七
丹磺酰化法分析蛋白质 N—末端氨基酸
刘德立
2010. 3
一、实验原理
蛋白质N-末端分析的方法主要有二硝基氟苯（DNFB） 法、丹 磺酰氯（DNS）法、苯异硫氰酸酯（PITC）法和氨肽酶法等。
DNFB法：2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的 游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下 水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。 不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。
N(CH3)2 R + SO2Cl 丹磺酰氯 水解 + R SO2 丹磺酰氨基酸 O HN CH C OH 氨基酸 O R 丹磺酰N- 端氨基酸 O H2N CH C 多肽N- 端 N(CH3)2 SO2 HN CH C N(CH3)2
DNS-氨基酸的制备和鉴定
Measure 0.5 cm from the bottom of the plate. Take care not to press so hard with the pencil that you disturb the adsorbent.
Using a pencil, draw a line across the plate at the 0.5 cm mark. This is the origin: the line on which you will "spot" the plate.
Remove the plate from the beaker.
quickly mark a line across the plate at the solvent front with a pencil
pH9.8 40℃,30min
本实验中，聚酰胺上胺基与氨基酸 的羰基形成氢键，酰胺基团上羰基 与AA中羟基或酚基形成氢键。由于 有些AA结构相似，如只采用一种溶 剂系统进行单向层析，难达到完全 分离的目的。因此可选择另一溶剂 系统进行第二向层析。 第一向——苯－冰醋酸 第二向——甲酸－水
显色
二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）可与氨基酸的游 离氨基结合成DNS-氨基酸。形成的DNS-氨基 酸在紫外光下呈黄绿色荧光。
Develop the plate.
place the TLC plate in the developing container make sure the solvent is not too deep
In this photo, it is about The solvent will rise up the 3/4 of the way up the plate. TLC plate by capillary action. In this photo, it is not quite halfway up the plate.
DNS法分析蛋白质
DNS法分析蛋白质N-末端氨基酸
DNS：丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）
强荧光剂
灵敏度高
反应原理
聚酰胺薄膜层析法
•原理：各种DNS—氨基酸与聚酰胺薄膜形成氢键的能力不同，即在溶剂与聚酰胺薄膜之间的分配系数不一样，故可用聚酰胺薄膜层析分离各种DNS—氨基酸。
•优点：灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等
点样层析
PH9.9 的标准赖氨酸、丙氨酸、苯丙氨基酸，混合氨基酸
实验原理
•荧光试剂DNS—Cl能与所有氨基酸的氨基结合，生成荧光物质DNS—氨基酸。
DNS—Cl 也能与蛋白质或多肽的游离氨基结合，生成DNS—蛋白质或DNS—肽，经酸水解后释放出DNS—氨基酸。
•各种DNS—氨基酸与聚酰胺薄膜形成氢键的能力个同，即在溶剂与聚酰胺薄膜之间的分配系数不一样，故可用聚酰胺薄膜层析分离各种DNS—氨基酸。
DNS—氨基酸在360nm 或280nm 波长的紫外光照射下，发出黄绿色荧光，很方便进行检测。
•蛋白质和多肽经酸水解后，肽键断裂，生成游离氨基酸，所有氨基酸都能与DNS—Cl 反应。
所以DNS—Cl 法可用于蛋白质或多肽氨基酸组成的微量分析。
•在pH 值过高的情况下，DNS—Cl 会发生水解生成副产物DNS—NH2，DNS—OH 和DNS—Cl在紫外灯下产生蓝色荧光，可以与DNS—Cl 的黄绿色荧光区分开来。
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生命科学学院
Life Science College
生
物
化
学
实验报告
姓名：柳伟雄班级：2013级生科一班学号：201300140062 同组者：曾玮璠
山东大学实验报告2015年3月18日
姓名：柳伟雄系年级：生科一班2013级同组者：曾玮璠
科目：微生物实验题目：DNS-氨基酸的制备和鉴定仪器编号：
一、目的和要求
1. 了解并掌握DNS-氨基酸的制备和鉴定的原理
2. 掌握制备Dansyl氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法
二、原理
荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯(dansyl-Cl，简称DNS-Cl)在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)的氨基结合成带有荧光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白质)，DNS-氨基酸再经酸水解可释放出DNS-氨基酸
DNS-Cl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。
这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10－10～10－9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB法高100倍。
将Edman 法和DNS法结合起来(称为Edman-DNS法)应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。
DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄膜上检测灵敏度为0.01ug(相当于10—10mol)。
由于它具有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分析。
层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。
聚酰胺是—类化学纤维原料，由己二酸与己二胺聚合而成的称锦纶66 。
因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。
它对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的一C＝O及>NH基能与被分离物质之间形成氢键。
如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类<如核苷酸、氨基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键；硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键。
被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。
在层析过程中，层层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。
因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离。
山东大学实验报告2015年3月18日
姓名：柳伟雄系年级：生科一班2013级同组者：曾玮璠
科目：微生物实验题目：DNS-氨基酸的制备和鉴定仪器编号：
三、试剂和器材
1. 聚酰胺薄膜（7×7cm）
2. 电吹风一个
3. 紫外灯一台
4. 点样管（4支）
5. 吸管
6.
量筒
烧杯（500ml）8. 铅笔
四、实验试剂
1. DNS-Cl丙酮溶液
2. 展层液：V(甲酸)：V(蒸馏水)=1.5:100
3. 氨基酸样品：标准Gly、Phe、His溶液
4. 混合氨基酸溶液
四、测定
1. DNS标记：
取4个小离心管，分别加入氨基酸30ul，再各加入30ulDNS-Cl丙酮溶液，混合均匀后置于37℃水浴中1小时；
2. 点样：
在距聚酰胺薄膜底端0.5-1cm处用铅笔画一条直线，以这条直线为基准，分别取四个离心管中液体用四个不同的点样管在聚酰胺薄膜上点样，直径不宜超过2mm，，重复2-3次，最多不宜超过5次；
3. 展层：
1) 配制展层液(V(甲酸)：V(蒸馏水)=1.5:100)100ml，可两个小组共同配制使用；
2) 将展层液置于培养皿盖（加12-13ml）或底（加10ml）中，将已点样的聚酰胺薄膜用皮筋套上可使其站立后放入展层液中，盖上500ml烧杯；
山东大学实验报告2015年3月18日
姓名：柳伟雄系年级：生科一班2013级同组者：曾玮璠
科目：微生物实验题目：DNS-氨基酸的制备和鉴定仪器编号：
3) 待展层液上升到距顶端大约0.5cm时展层结束，将其取出，冷风吹干；
4. 透射：
将冷风吹干的聚酰胺薄膜放在紫外灯下，用铅笔将黄绿色斑点圈出。
五、实验结果
注：X为色斑中心至原点中心的距离，Y为溶剂前缘至原点中心的距离,其中Y值均相同为
5.20cm。
在混合氨基酸中：
1. 对于赖氨酸：X1=0.45cm ，X2=4.30cm 则Rf1 =0.087，Rf2=0.827
2. 对于丙氨酸：X3 =2.81cm 则Rf3 =0.540
3. 对于苯丙氨酸：X4 =1.20cm 则Rf4=0.231
各个标准氨基酸与混合氨基酸中的对应成分Rf值相同。
六、注意事项
1. 严格控制点样位置以及点样直径，点样时直径不宜超过2mm，不宜点在边缘，点样后马上用吹风机冷风吹干，重复2-3次以保证点样量足够，点样不能太用力，防止聚酰胺薄膜断裂而影响展层；
2. 展层液要现配现用，需混合均匀，用量既不可不足，又不可过量而导致把点样点没过；
3. 展层后必须经电吹风将膜吹干；
4. 使用紫外照射时要注意使用时间短。
七、分析总结
从实验结果分析可得以下几条结论：
1. 由实验原理可知，氨基酸的氨基与DNS-Cl反应后是黄绿色荧光。
而Lys含有两个氨基，因此L ys 带有两个黄绿色荧光标记。
又由于DNS-Cl主要与α-氨基反应，由此可判断最上方的少量黄绿色荧光的是Lys的δ-氨基反应后的DNS-Lys。
2. DNS-丙氨酸的相对分子质量体积最小,非极性最强，形成氢键最弱，展层速度最快，因而在最上方；而Lys由于与聚酰胺表面形成2个氢键，极性强，所以展层速度慢；Phe的极性处于两者之间，因而展层速度也在两者之间。
所以本实验的结果主要与氨基酸的极性和所形成的氢键有关。
3. 聚酰胺薄膜层析是一类特殊的分配层析。
混合物随展层液通过聚酰胺薄膜时，由于被分离氨基酸与薄膜形成氢键，而各氨基酸形成氢键的能力不同，决定吸附力的差异，吸附力强,展层速度慢，吸附力弱，展层速度快。
导致所展示的层析结果。
4. 展层液与被分离氨基酸在聚酰胺离子表面竞争形成氢键，展层液使被分离氨基酸在展层液与聚酰胺薄膜表面之间的分配系数有较大差异。
易溶于展层剂的所受的动力作用大，展层速度快，反之，速度慢。
5. 从实验结果分析可得：混合氨基酸中应同时含有赖氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸三种。
实验中可导致误差出现的几点：
山东大学实验报告2015年3月18日
姓名：柳伟雄系年级：生物科学2013级同组者：曾玮璠
科目：微生物实验题目：DNS-氨基酸的制备和鉴定仪器编号：
1. 在聚酰胺薄膜上点样时用力过大，很可能会使聚酰胺薄膜断裂，影响层析结果，可能会导致心形黄绿色荧光斑出现，我在点样时就出现这种情况，导致混合氨基酸的荧光斑的其中一个出现心形；
2. 点样时不及时吹干，致使点样液扩散，会在很大程度上影响实验结果，因严格控制点样点的大小，最好不要超过2mm；还有点样时应重复2-3次，防止点样液成分不足；
3. 点样时若两点之间间隔过小，也会影响实验结果，本次实验宜控制在1cm左右。