细胞培养试剂及操作流程

实验规范化流程

一、细胞培养所需

1、10%FBS 1640培养液。

2、10%FBS DMEF/12培养液。

3、10%FBS DMEM/High Glucose 培养液。

4、PBS ：商品化的粉末，一袋溶于2L 去离子水中，高压后4℃保存。

5、胰酶

6、冻存液：10%DMSO 、>10%FBS ，其余成分为1640

7、真核抗生素：

G418: 50mg/ml

MDA-MB-231 800ug/ml

MCF-7 800ug/ml SK-BR3 100ug/ml

T47D 400ug/ml)

嘌呤霉素（Puromycin ）:10mg/mL 、

MCF-7 4ug/ml T47D 1ug/ml

MDA-MB-231 5ug/ml

潮霉素（Hygromycin B ）:50mg/mL T47D 200ug/ml

MDA-MB-231 800ug/ml

MCF-7 50ug/ml 8、原核抗生素：双抗（抗青霉素、链霉素）（使用浓度：1%原液）

环丙沙星

左氧氟沙星（储存浓度5mg/ml ，使用浓度5ug/ml ）

9、细胞因子：IL-6、EGF （10ug/ml ）

10、抗肿瘤药物：阿霉素（储存浓度50Mm,使用浓度0.01mM ）

一、细胞培养相关技术

1、细胞复苏

准备：37℃水浴锅、培养液、15ml 离心管、滴管、培养瓶或培养皿试验流程：

（1）将细胞从-80℃或液氮取出，遵”慢冻速溶“的原则，迅速在37℃下使其液化。

（2）将融化的细胞悬液加入适量新鲜培养液稀释吹匀，转移到15ml 离心管内。

（3）将离心管以1000rpm 转速离心5min 。

（4）小心弃去上清，最好用枪头除尽，加入新鲜的培养液6ml ，重选吹匀后转移到细胞培养瓶或培养皿，放入37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。

2、细胞传代

准备：胰酶、培养液、培养瓶或培养皿、15ml离心管、滴管

实验流程：

（1）将覆盖率达80-90%的对数生长期细胞弃去培养液，尽量将培养液洗净，必要时加PBS冲洗，以防止培养液对胰酶的终止作用。

（2）加入适量胰酶（一般25cm2培养瓶加0.5ml，10cmdish加1ml），并且晃动几下使胰酶在平底分布均匀，放入37℃培养箱孵育。

（3）适当时间后（231、SK-BR3用1min，MCF-7、T47D用2min，依据细胞不同时间不同）将培养瓶从培养箱拿出来，显微镜下观察细胞形态变

圆、粘附性变弱后加入培养液终止酶反应。

（4）用培养液冲洗瓶底，然后吹打细胞悬液使其均匀单个分布。

（5）将悬液1000r离心5min后重悬，安装实际需要将悬液平分到培养瓶内，一般按1:3传代较好。

3、细胞冻存

准备：培养液、胰酶、15ml离心管、滴管、冻存管、冻存盒

试验流程：

（1）将已经长满的细胞取出，弃去培养液后加入适量胰酶，放入37℃孵育适当时间后，观察细胞变化。

（2）用培养液终止反应后，吹匀，将悬液转移到15ml离心管内。

（3）以1000r的速度离心5min

（4）弃去上清，加入1-1.5ml冻存液，重悬，加入冻存管内（冻存管注意做好标记）。

（5）将冻存管放入冻存盒内。盖好，放入-80℃冰箱冻存。

4、细胞计数

准备：胰酶、培养液、滴管、15ml离心管、计数板、移液器

实验流程：

（1）取对数生长期细胞，用适量胰酶消化后，1000r离心5min，重悬。（2）用微量移液器取10μL悬液，沿计数板一侧缓慢加入，确保悬液均匀充满计数池。

（3）显微镜下计数四角大方格内的细胞数目，求平均值。

（4）根据公式n=四角大方格内细胞数/4 *104 （个）/ml