石蜡切片技术原理

2.1.1动物的麻醉和杀死
从活的动物体上采取材料不象采集植物材料 那么容易，因为在不施加麻醉的情况下，有的 动物会收缩(如蚯蚓、水蛭)，有的会骚动(如蛙、 鼠)，使我们无法下手。但制片所需的材料又 要求越新鲜越好，尤其是细胞学方面的研究对 材料的新鲜程度要求更严。因此，要割取生活 着的动物组织，在一般情况下，就要对动物施 行麻醉，然后再割取材料加以固定。但是，所 用的麻醉药品，必须以不影响细胞结构为原则。
固定的目的和作用在于： ①防止组织自溶和腐败； ②使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀
保存下来从而保存细胞的各种组成成分使其保 持与生活时相近似的形态和结构； ③因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产 生不同的折光率，造成光学上的差别使原来在 生活情况下看不清楚的结构变得清晰易见，且 有的固定剂还有助染作用(如醋酸、苦味酸)，从 而使细胞各部易于染色； ④固定剂还兼有硬化作用，使柔软组织硬化而不 易变形，有利于操作。
①要具有颜色
②和被染物体之间具有亲和力。
如果只有颜色而与被染物体之间无亲和力，那只 能是颜料或合色物质，而不是染料。染料的颜色和 亲和力都是由分子结构决定的，即由产生颜色的发 色团和与组织产生亲和力的助色团所决定。
发色团：能使染料分子产生颜色的原子团称为发 色团，也就是能吸收一定波长的光线并因之而呈现 颜色的化学结构。
二、实验方法
生物显微制片有许多不同的方法，一般可分为非切片 法与切片法两大类： 非切片法有涂片、铺片、压片、磨片、整装片等。 切片法又包括石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片 法等。 显微制片技术虽是生物学中很基本的操作技术，但由 于生物材料的个体差异，化学试剂的多样性，因此操 作技术相当细致而复杂，方法也很多，每一步骤的失 误都可导致整体的失败，因此需要耐心细致，不断总 结经验，才能得到较好的结果。
1.2 铺片法
主要用于动、植物组织的表皮层观察，可活 体取待观察动、植物组织，用尖镊子撕去一层 表皮，迅速平铺在载玻片上。 如: 洋葱表皮细 胞的铺片制备。
1.3 压片法
一些较幼嫩，柔软的材料可将其置载玻片上 ，用小解剖刀将其分散，加染料一滴，再盖上 盖玻片，用拇指垂直用力挤压，使组织散成一 薄片，再进行观察，如植物根尖观察染色体， 花粉粒观察发育阶段等。
助色团：能使染料对织物纤维或组织成分产生亲 和力的原子团称为助色团，也就是使化合物具有成 盐性质的原子团。
2.2.2固定的方法
固定有物理方法和化学方法两种。
物理方法固定有干燥、高热和低温骡冷等。 例如，血液涂片就是干燥固定；细菌涂片可用 加热法固定；许多组织化学反应的制片是以低 温骡冷固定作冰冻切片的。
化学方法固定就是用化学试剂配制成固定液 使之固定。
2.2.3固定液的选择 固定液的种类很多。可分为两大类：简单固
若是一般的组织学制片，要求不太严格的话则 可将动物先杀死然后速取其组织进行固定。蛙、 蟾蜍、鼠等较小的动物，可用断头法杀死，即 用普通剪刀剪断颈部。较大的动物，如大竺鼠、 免、猫等可用木槌猛击头后部，使其昏倒，或 用50m1的注射器从耳静脉向心脏注入空气， 使动物发生急性空气栓塞痉挛而死。
上述动物若需麻醉后取材，则可用脱脂棉球 蘸氯仿或乙醚、置于动物的鼻尖部，令其吸入 麻醉。大动物(狗、猴等)应用氨基甲酸乙酯作 静脉注射麻醉．剂量一般为每kg动物体重用1 g。麻醉后的动物也需放血后进行取材固定。
昆虫等小动物可投入充满氯仿或乙醚蒸气的 大口瓶中，令其麻醉。若要杀死，可将其投入 含氰化钾的毒瓶中。
2.1.2动物组织块的切割 割取动物组织块时，需注意以下几点：
第一，要考虑所取的材料应包括各脏器的重要 结构或全部结构，如消化管就应包括粘膜、粘膜 下层、肌层和外膜四层结构。若所取的器官太大， 不易全部制片时，则可切取能代表该器官的部分 材料，如狗的肾脏，可切取包括皮质、髓质和肾 盂的一部分为材料。
液体来逐渐置换样品中游离的水。 现采用的脱水剂一般是丙酮或乙醇来进行梯
度脱水，脱水的时间，可根据组织的类型，大 小而定。
脱水的过程：一般是30%乙醇→50%乙醇 →70%乙醇→80%→90%→100% →100%
脱水应逐步而不应跨越太大进行，否则将引 起组织强烈的收缩或变形，在经无水乙醇处理 时，应保证试剂的纯度。
2.4 透明
透明是用一种即能与乙醇又能与包埋介质互 溶的液体来置换样品中的乙醇，从而为最终的 包埋创造一个有利的条件。 现采用的透明剂一 般是二甲苯，甲苯，氯仿等。
其过程为： 1/3二甲苯+2/3乙醇混合液 →1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯 +1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯
二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具有 渗透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点， 其缺点是易使组织收缩，变硬，变脆，因此透 明时间应纸盒中，再用镊子轻轻将浸好蜡 的组织块夹入纸盒，摆好位置，待石蜡冷却成固态即 包埋完毕。
至此，一块组织已完成前处理过程，可以切片，前边 的步骤看来既无高深的理论，又无复杂的技术，一切 看似简单，但一步做不到都会造成整个制片的前功尽 弃。
我们可以看到： ①水和酒精可以相溶。 ②酒精和二甲苯相溶。 ③二甲苯和石蜡可以相溶。
1.4 离析法
该方法是利用化学试剂使组织的细胞间质溶 解，使细胞能分散成单个个体。经染色，脱水 ，透明即可观察其个体形态，适用于肌肉，叶 片，茎等部位。 1.5 磨片(Ground section)
用于很坚硬的组织，如骨和牙。
2 、切片法
切片法是必须依靠手或切片机将组织切成薄片来 进行观察的方法，为了能清晰地观察到动、植物 的组织结构及细胞形态，必须先经过一系列步骤 将组织内渗入某些支持物质，使组织变硬以利于 切成薄片，根据所用支持剂的种类不同，可分为 徒手切片法，石蜡切片法，火棉胶切法，冰冻切 片法等类型，切成薄片后还需要去蜡，染色，脱 水，透明等步骤，将其制成永久标本。
2.2.4常用的固定液
福尔马林—醋酸—酒精混合固定液（FAA液）
是植物制片技术中较为良好的固定液和保存 液。除单细胞和丝状藻类外，均可用此液固 定．也通用于昆虫和甲壳类的固定。
FAA液配方：
福尔马林
5m1
冰醋酸
5m1
50％或70％酒精 90m1
Bouin氏液
是常用的良好固定液，广泛应用于一般动物组
织、昆虫组织、无脊椎动物的卵和幼虫，以及
胚胎学材料的固定。也适用于裸子植物的雌配
子体和被子植物的胚囊的固定。
Bouin氏液配方：
苦味酸饱和水溶液 75份
福尔马林
25份
冰醋酸
5份
此液穿透迅速而均匀，使组织收缩少，不使
组织变硬变脆，着色良好。一般动物组织固定
12—24h，小块组织数小时即可。固定后直接
入70％酒精中洗去黄色，但留一点黄色对染色
定液和混合固定液。 简单固定液又称单纯固定液，就是用一种化
学试剂作为固定液，如乙醇、甲醛溶液、冰醋 酸等,它们只是对细胞的某种成分固定得较好； 不能将细胞所有的成分都保存下来。如升汞固 定蛋白质、冰醋酸固定核蛋白、无水乙醇可固 定糖原等，单纯固定液是有局限性的。
混合固定液就是用几种化学药品，按一定的 比例混合配制而成的，由于各种药品的优缺点 互相弥补，因此可产生较好的效果。
因为以上相邻步骤所使用的液体均可以互溶 ，所以保证每一步骤液体能置换完全。
水和二甲苯不能相溶，乙醇和石蜡不能相溶 ，所以如果有一个步骤的处理不彻底，残留的 液体带到下一个步骤将不能互溶，最终带到渗 蜡步骤中，成为细小的空洞，以至不能成为质 地致密的石蜡块，也就切不成良好的切片。
2.7 切片
修块： 切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡块切 开，使每一小块都含有一块组织，从切面看组织周围 的石蜡相等。
(6)固定时，要防止材料变形。
(7)外有被膜，而内部站构又极易松散的器官， 应将整个器官投入固定液2—2h后，再将其修 成小块材料继续则定。
(8)含行粘液、污物或血液的材料需用生理盐水 洗净后．再行固定。
(9)材料投入固定液后．须经常摇晃。
(10) 容器外需贴标签。
2.3 脱水 脱水是用一种即能与水又能与透明液混合的
固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台上，以便于 固定在切片机上。
切片：一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片连成 一长条蜡带。切下的蜡带放在一干净黑纸上。
贴片：用小刀根据需要切成数段，分别用粘片剂贴在干 净载玻片上。在恒温展片台上展平，烘干。
2.8染色
2.8.1染料、染色液染料必须具备两个条件：
显微标本制作技术
河北大学细胞生物学实验室
一、实验原理
显微标本的制作技术是组织学，胚胎学，生理学及细 胞学等学科研究观察细胞、组织的生理、病理形态变化的 一种主要方法。大多数的生物材料，在自然状态下是不适 合显微观察的，也无法看到其内部结构。因为材料较厚， 光线不易透过，以致不易看清其结构，另外细胞内的各个 结构，由于其折射率相差很小，即使光线可透过，也难以 辩明。但在经过固定，脱水，透明，包埋等手续后就可把 材料切成较薄的片子，再用不同的染色方法就可以显示不 同细胞组织的形态及其中某些化学成份含量的变化，就可 以在显微镜下清楚的看到其中不同的区域组分状态，切片 也便于保存，所以是教学和科研中常用的方法。
2.2固定
割取组织块后，应立即进行固定。
固定是制片极为关键的一个步骤，制片质量的优劣。 除与材料的新鲜程度有关外，还取决于最初的固定 是否适当和完全。
2.2.1固定的意义
新鲜的组织被割取后,由于细胞内酶的作用和细菌 的繁殖，可引起组织的自溶和腐败。因此，割取组 织块后，应立即采用一 种方法．将组织尽可能保持 原有的形态结构，且有利于保存和适于制片的操作， 这一步骤称为固定。
下边以石蜡切片为例，介绍显微标本的制备方 法。
2.1 取材
根据不同的实验目的，选择相应的材料，材 料要求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、 挫伤、干枯。