沉淀法综述论文

盐析法分离纯化生物物质综述

摘要：盐析作用被认为是盐夺去了溶解蛋白质的水所引起的。蛋白质疏水部分附近的水分子结合成所谓窗格的规则网状结构，和疏水部分表面形成界面。蛋白质分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。

关键词：盐析法;分离纯化;蛋白质;溶解度;离子强度

正文：

引言

沉淀法是最经典的分离和纯化生物物质的方法，目前仍广泛运用在实验和工业中。由于其浓缩作用常大于纯化作用，因而沉淀法常作为初步分离的一种方法，用于去除了菌体或细胞碎片的发酵液中沉淀出生物物质，然后然后再利用色层分离等方法进一步提高其纯度。

沉淀法由于其成本低、收率高（不会使蛋白质等大分子物质失活）、浓缩倍数高（可达10~50倍）、操作简单等优点，根据有关统计，大约80%的酶浓缩过程采用沉淀方法，其中用硫酸铵沉淀的约60%，有机溶剂乙醇沉淀的约35%。沉淀法制得，平均收率约为87%。沉淀法的优点使其成为生物下游加工过程中运用最广泛的纯化方法[1-2]。

沉淀法分离纯化的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同或热稳定性的差异而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。

在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：

⑴中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化；

⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化；

⑶选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的

和在一定pH 值下易变性的杂蛋白；

⑷ 等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用；

⑸ 有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使用PEG 聚乙二醇（Polyethyene glycol ）作为沉淀剂。

盐析沉淀法

1、盐析法

1.1 中性盐沉淀（盐析法）的定义

在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为"盐析"。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，43％饱和度的硫酸铵可以使DNA 和rRNA 沉淀，而tRNA 保留在上清。盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：①成本低，不需要特别昂贵的设备；②操作简单、安全；③对许多生物活性物质具有稳定作用。

1.2盐溶、盐析

当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：

（1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大

（2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下：

a 、无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质

的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢；

b 、中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水

区的相互作用导致沉淀。[4]

1.3盐析法沉淀蛋白质的基本原理

盐析作用被认为是盐夺去了溶解蛋白质的水所引起的。蛋白质疏水部分附近的水分子结合成所谓窗格的规则网状结构，和疏水部分表面形成界面。蛋白质分子的－COOH 、－NH2和－OH 都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm ～100nm 颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。[4]

1.4离子强度对盐析过程的影响

Cohn 经验公式

I

K S s -=βlog

式中：

S —蛋白质溶解度，mol/L ；

I —离子强度

（c:离子浓度；Z ：离子化合价） β—盐浓度为0时，蛋白质溶解度的对数值。与蛋白质种类、温度、pH 值有关，与盐无关；

Ks —盐析常数，与蛋白质和无机盐的种类有关，与温度、pH 值无关。[5] 以Cohn 经验公式为基础，可将盐析方法分为两种类型：

①Ks 盐析法：在一定pH 和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法； ②β盐析法：在一定离子强度下，改变pH 和温度进行盐析；

其中，Ks 盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理；而β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。[3]

1.5盐析用盐的选择

在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱。不同盐类对同一蛋白质的不同盐析作用，其Ks 值的顺序为：

磷酸钾>硫酸钠>硫酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁

选用盐析用盐的几点考虑：

（1）盐析作用要强，即分离效果要好；

（2）盐析用盐需有较大的溶解度，最好是低温时也有很高的溶解度；

（3）盐析用盐必须是惰性，即不易引起变性，有稳定的与蛋白质结构作用；

（4）来源丰富、经济。[3]

1.6盐析的操作方法

最常用的是固体硫酸铵加入法。欲从较大体积的粗提取液中沉淀蛋白质时，往往使用固体硫酸铵，加入之前要先将其研成细粉不能有块，要在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，尤其到接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速度和较长的离心时间。

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1i i Z c I ∑=