环境微生物课程论文-几种利用微生物修复土壤重金属方法的比较研究全解

几种利用微生物修复土壤重金属方法
的比较研究
摘要：总结了微生物修复土壤重金属污染方法的特点，对其原理进行了分析，比较了微生物刺激技术、微生物强化技术、植物-微生物联合修复三种方法，并对今后的微生物修复技术研究提出了建议。

关键词：重金属；微生物修复；菌根；根瘤菌
0引言
与常见的大气污染、水污染、工业固体废弃物污染相比，土壤重金属污染具有不可见性和隐蔽性．目前全国遭受不同程度污染的耕地面积已接近 2.0 ×107hm2，约占耕地面积的1/5，我国每年因重金属污染导致的粮食减产超过 1 ×107t，被重金属污染的粮食多达1.2 × 107t，合计经济损失至少200 亿元．土壤重金属污染日益严重导致土壤肥力退化、农作物产量降低和品质下降，严重影响环境质量和经济的可持续发展，威胁到人们的食品安全。

重金属对人类具有巨大的危害，能引起头痛、头晕、失眠、健忘、神经错乱、关节疼痛、结石、癌症，如肝癌、胃癌、肠癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、乌脚病、畸形儿等[1]。

随着社会经济的发展，我国重金属污染已越来越严重，重金属污染事故频发。

近年来，随着土壤重金属防治方面研究增多，开发了越来越多的方法。

但是这些方法成本昂贵，可操作性差，且大部分是重金属稳定化技术，目前大都处在实验室研究阶段。

在此背景下，一些学者提出了利用微生物来修复土壤重金属污染方法，这对于传统的物理化学法是一种延伸。

1微生物修复土壤重金属污染的特点
目前,用于土壤重金属污染治理的方法包括物理修复、化学修复和生物修复.物理修复、化学修复虽能达到一定的效果,但是能耗大、二次污染等问题也限制了其应用，尤其对于大面积有害的低浓度重金属污染,更是难以处理[2]。

微生物修复法具有处理费用低，对环境影响小、效率高等优点，加之微生物自身具有种类繁多，数量庞大，比表面积大等特点，所以利用一些真菌、细菌、放线菌等来修复重金属污染土壤具有很大的潜力，并且对重金属污染的耐性通常为真菌＞细菌＞放线菌。

目前，大多数研究所用微生物种类主要还是从受污
染土壤中分离得到，属于土壤微生物，由于它们能在土壤中长时间生存，因此当大量施入土壤以后会造成土壤微生物群落的失衡，具有潜在的二次污染。

白腐真菌是一类在腐木上生长的真菌，研究表明[3]，某些种对污水中铅、镉等重金属具有很强的吸附作用，然而利用白腐真菌固体发酵来修复受重金属污染土壤，该方法目前国内外尚未报道。

2微生物修复土壤重金属污染的机理
微生物修复重金属污染土壤主要体现在 3 个方面。

2.1固定作用
土壤中重金属离子有5种形态:可交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机结合态、残渣态.前3种形态稳定性差,后2种形态稳定性强.重金属污染物的危害主要来自前3种不稳定的重金属形态。

微生物固定作用可将重金属离子转化为后2种形态或积累在微生物体内,从而使土壤中重金属的浓度降低或毒性减小[4]。

2.1.1 胞外吸附作用
胞外吸附作用主要是指重金属离子与微生物的产物或细胞壁表面的一些基团通过络合、螯合、离子交换、静电吸附、共价吸附等作用中的一种或几种相结合的过程。

许多研究表明细菌及其代谢产物对溶解态的金属离子有很强的络合能力,这主要因为细菌表面有独特的化学组成.细胞壁带有负电而使整个细菌表面带负电荷,而细菌的产物或细胞壁表面的一些基团如-COOH、-NH2、-SH、-OH等阴离子可以增加金属离子的络合作用[5]。

2.1.2 胞外沉淀作用
胞外沉淀作用指微生物产生的某些代谢产物与重金属结合形成沉淀的过程.在厌氧条件下,硫酸盐还原菌中的脱硫弧菌属( Desulfovibrio)和肠状菌属(Desulfotomaculum)可还原硫酸盐生成硫化氢,硫化氢与Hg2+形成HgS沉淀,抑制了Hg2+的活性。

某些微生物产生的草酸与重金属形成不溶性草酸盐沉淀。

2.1.3 胞内积累作用
胞内积累作用是指重金属被微生物吸收到细胞内而富集的过程.重金属进入细胞后,通过区域化作用分布在细胞内的不同部位,微生物可将有毒金属离子封闭或转变成为低毒的形式。

微生物细胞内可合成金属硫蛋白,金属硫蛋白与Hg、Zn、
Cd、Cu、Ag等重金属有强烈的亲合性,结合形成无毒或低毒络合物[6]。

如真菌木霉、小刺青霉和深黄被包霉通过区域化作用对Cd、Hg都有很强的胞内积累作用。

2.2氧化还原作用
微生物对重金属的氧化还原作用则可以改变土壤中重金属的价态，降低其毒性或迁移性。

如假单胞菌( Pseudomonad sp . )可以把六价铬还原为三价铬,从而降低其毒性。

Fwukowa从土壤中得到假单胞杆菌K-62,它能分解无机汞和有机汞而形成元素汞,元素汞的生物毒性比无机汞和有机汞低得多。

2.3转化作用
微生物对重金属的转化作用包括甲基化与去甲基化作用。

Frankenber等通过耕作、优化管理、施加添加剂等来加速硒的原位生物甲基化,使其挥发而降低硒的毒性,此生物技术已在美国西部灌溉农业中用于清除硒污染[7]。

3几种常见的微生物修复技术
3.1微生物刺激技术
生物刺激即向污染的土壤中添加微生物生长所需的氮、磷等营养元素以及电子受体,刺激土著微生物的生长来增加土壤中微生物的数量和活性.关于这方面
的研究国外文献已有报道.Reddy K R,Cutright T J对铬污染土壤的微生物修复进行的研究表明[8],限制铬污染场地修复进程的一个共同因素是污染场地通常缺乏足够的营养以供引进的外来微生物或土著微生物生长,以至这些微生物自身具备的还原Cr6+的潜力得不到充分发挥;为使其潜力得到充分发挥,需向其生活的环境中投加营养物质来刺激铬还原菌的新陈代谢和殖,促进铬污染土壤的修复。

Higgins T E将堆肥、鲜肥、牛粪、泥炭加入铬污染土壤进行原位修复,提高了修复效果。

3.2 微生物强化技术
生物强化技术即向重金属污染土壤中加入一种高效修复菌株或由几种菌株组成的高效微生物组群来增强土壤修复能力的技术.所加入的高效菌株可通过筛选培育或通过基因工程构建,也可以通过微生物表面展示技术表达重金属高效结合肽,从而得到高效菌株。

3.2.1 高效菌株筛选
一是从重金属污染土壤中筛选;二是从其他重金属污染环境中筛选。

从重金属污染土壤中筛选分离出土著微生物,将其富集培养后再投入到原污染的土壤,这是本土生物强化技术[9]。

最新的研究成果，Robinson等研究了从土壤中筛选的4种荧光假单胞菌对Cd的富集与吸收效果,发现这4种细菌对Cd的富集达到环境中的100倍以上。

3.2.2基因工程的构建
基因工程可以打破种属的界限,把重金属抗性基因或编码重金属结合肽的基因转移到对污染土壤适应性强的微生物体内,构建高效菌株.由于大多数微生物对重金属的抗性系统主要由质粒上的基因编码,且抗性基因亦可在质粒与染色体间相互转移,许多研究工作开始采用质粒来提高细菌对重金属的累积作用,并取得了良好的应用效果。

3.2.3微生物表面展示技术
微生物表面展示技术是将编码目的肽的DNA片段通过基因重组的方法构建和表达在噬菌体表面、细菌表面(如外膜蛋白、菌毛及鞭毛)或酵母菌表面(如糖蛋白),从而使每个颗粒或细胞只展示一种多肽。

Sousa C等将六聚组氨酸多肽展示在E. coliLamB蛋白表面,可以吸附大量的金属离子,重组菌株对Cd2+的吸附和富集比E. coli大11倍，Kuroda K、Ued M将酵母金属硫蛋白(YMT)串联体在酵母表面展示表达后,四聚体对重金属吸附能力提高5.9倍,八聚体提高8.7倍[10]。

3.3 植物-微生物联合修复
植物-微生物联合修复是在植物修复的基础上，联合与植物共生或非共生微生物，形成联合修复体，促进植物营养吸收，增强植物抗逆性，借助增加生物量的手段提高修复能力；增加植物根部重金属浓度，促进重金属的吸收或固定。

微生物不仅通过其自身的组成成分如菌根外菌丝、几丁质、色素类物质和EPS等吸附重金属，而且通过其分泌的各种有机酸或特殊物质来活化重金属，增加其在植物根部浓度。

植物-微生物联合修复目前研究较多的主要是植物-菌根真菌联合修复与植物-根瘤菌联合修复，其中植物-菌根真菌联合修以AM菌（丛枝菌根）为例。

菌根是土壤中的真菌菌丝与高等植物根系形成的一种联合体，可以溶解转运土壤中的无机矿物元素，其中应用最广泛的有 2 类：泡囊-丛枝菌根真菌即内
生菌根真菌和外生菌根真菌。

在重金属污染情况下，菌根可以改善植物生长状况，减轻重金属对植物的毒害，影响植物对重金属的吸收和转运，加快土壤中重金属元素的植物萃取或植物稳定。

研究发现，向土壤中接种丛枝菌根真菌可促进海州香薷向地上部转运Cu，提高地上部Cu 含量。

接种菌根真菌能明显减少重金属复合污染土壤中三叶草对Cu，Cd和Pb 的吸收，地上部Pb 和Cd 质量分数分别下降24.2% ～55.3%和65％～97.9%，使三叶草地上部Cd 和Pb 含量均低于我国牧草重金属安全含量[11]。

3.3.1 丛枝菌根修复
丛枝菌根( Arbuscular Mycorrhizae，AM) 是土壤生态系统中一种同时具有植物根系和微生物特性的互惠共生体。

AM 真菌能与地球上90%以上的陆生维管植物根系建立共生关系，形成“菌根”结构。

菌根共生体的形成能促进宿主植物对土壤中P、N、K、Zn、Fe、Cu、Ca 等矿质元素的吸收，改善植物营养状况，提高植物产量，改进产品品质，并可提高干旱、盐渍胁迫生境中植物根系对水分的利用效率。

研究表明，AM 真菌能够显著提高宿主植物在重金属污染土壤中的耐受能力。

长期生长于胁迫环境中的植物经过一段时间的适应，会逐渐具备耐受胁迫的能力，这种能力对植物的生长发育起着非常重要的作用，AM 真菌能够促进宿主植物提高对重金属胁迫的耐受性，减轻重金属对植物生长造成的危害[12]。

Slomka 等发现AM 真菌能够帮助三色堇( Viola tricolor) 降低对重金属的吸收从而保护植株的组织和器官。

Lins 等也发现接种幼套球囊霉( Glomus etunicatum ) 的银合欢( Leucaena leucocephala) 植株地上部分Cu 含量比不接种处理低。

长喙田菁( Sesbania rostrata) 、田菁( Sesbania cannabina) 和紫花苜蓿( Medicago sativa) 接种AM 真菌后，根中Cu、Zn、Pb 和Cd 的含量相比地上部分显著提高。

菌根化的香根草( Vetiveria zizanioides) 体内重金属含量也明显降低。

以上结果说明AM 真菌对重金属进行了固定、隔离，减少了重金属向地上部分的转移[13]。

另一方面，也有研究发现，在重金属污染条件下，AM 真菌侵染宿主植物后不会减少植株对重金属的吸收，但是能够提高植株对重金属的耐受性，从而帮助植物在较高浓度重金属水平下存活。

通过对不同植物与重金属的研究发现，接
种AM 真菌能够促进植物的形态建成，增加对Zn、Pb、Cu、As和Cd等重金属胁迫的耐受性。

3.3.2 植物-根瘤菌联合修复
在重金属污染地，重金属毒性和养分不足是重金属污染地植被恢复的主要限制因子，而氮素的极端不足又是养分不足的核心问题，提高重金属污染地氮素含量水平成为重金属污染地生态修复的首要工作。

根瘤菌-豆科植物共生体系是已知固氮能力最强、固氮量大、抗逆能力强的生物固氮体系之一，它们之间是一种紧密互利关系，是其适应胁迫环境(如营养物质匮乏、干旱、重金属污染等) 的有效策略之一。

把豆科植物作为重金属污染地的先锋植物，利用根瘤菌-豆科植物共生体系的固氮作用来加速污染地氮素积累，进而促进污染地的营养元素循环和积累，已成为重金属污染地植被恢复研究的热点问题之一。

SRIPRANG 等发现了一种紫云英属野豌豆与根瘤菌的共生体，每个植株上的100 个左右的根瘤可多去除140 nmol Cd2+。

经过基因工程改良后，共生体对Cd2+的吸收增加了 1.5 倍[14]。

Wani 等从印度马图拉重金属污染地生长的Pea 和Greengram 的根瘤中分别分离出对镍锌具有很好的抗性的两种根瘤菌在培养基上耐受350 μg/mL 的Ni 和1500 μg / mL 的Zn。

4 问题与展望
微生物修复技术的局限性微生物修复技术也具有一定的局限性，今后需要做更多的工作来进一步解决这些问题以便使微生物修复土壤重金属污染的方法能够早日投入实际运用。

(l)由于土壤环境本身的非均质性,加之外界环境条件变化比较复杂,难以确定不同土壤条件下重金属对土壤微生物的毒害临界值以及寻找有价值的微生物学评价指标,因而尚未定量制定出统一的土壤重金属环境质量标准。

(2)目前这方面研究侧重于室内培养试验,研究结果与野外实际条件存在很大的差异,仍然需要作大量的野外试验以获得准确的试验参数来验证室内实验的结果,以期建立较为标准的研究方法。

(3)目前应用微生物修复重金属污染环境仍存在许多技术上的难题。

比如,环境中的重金属污染往往呈复合形态,怎样将具有不同修复功能的高效菌株加以混合培养?怎样将微生物修复技术与其它环境净化技术进行有效的组装、配套等
问题。

随着分子生物技术和基因工程技术的迅速发展,有待于从分子水平上去研究重金属对土壤微生物的影响机制,为进一步研究和运用微生物生物修复技术提供科学依据。

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