第3章 高效液相色谱分析法 HPLC
高效液相色谱法 HPLC
1）硅胶： <>无定型硅胶 最早使用，传质慢、柱效低 <>薄壳型硅胶 直径为30~40μm的玻璃珠表面涂布一层1~2μm 厚的硅胶微粒，孔径均一、渗透性好、传质 快，但柱容量有限。 <>全多孔球型硅胶 粒度一般为5~10μm，颗粒和孔径的均一性都比 前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固定相 的主体，也是键合固定相的主要基质。
2．进样系统 a 隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室） >GC系统压力较小，可以 >HPLC系统压力太大，须停泵进样（早期） b 阀进样：不必停泵，六通阀
3．分离系统-色谱柱 >直径4~6mm,柱长10~30cm,多为不锈钢材料 >柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子） >色谱柱维护 >预柱和预饱和柱
（二）反相键合相固定相
1．分离机制：疏溶剂理论 正相——流动相与溶质排斥力强， 作用时间↑， k↑，组分tR↑ 反相——流动相与溶质排斥力弱， 作用时间↓， k↓，组分tR↓
二、HPLC与GC差别
1．分析对象的区别 GC：
适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品； 但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型 及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可 检测。(占有机物的20%)
HPLC： 适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶 液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分 子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测用途广泛。（占有机物 的80%）
高效液相色谱法分析药物代谢产物
高效液相色谱法分析药物代谢产物一、引言药物代谢产物的分析对于新药物的开发和药理学研究至关重要。
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）作为一种常用的分离和分析技术，被广泛应用于药物代谢产物的研究中。
本文将介绍HPLC分析药物代谢产物的原理、方法和应用。
二、高效液相色谱法的原理HPLC是一种在高压下进行的液相色谱技术，其基本原理是将混合样品中的各组分通过一个固定相和液相流动相的相互作用进行分离。
在分离过程中，样品溶液被加压通过色谱柱，不同成分会根据其相互作用的差异以不同速度通过柱床，并在检测器中得到信号记录。
三、HPLC分析药物代谢产物的方法1. 样品制备样品制备是HPLC分析的关键步骤之一。
首先，需要收集药物代谢产物的样品，可以通过体外试验或体内实验获得。
然后，样品需要进行前处理，包括萃取、浓缩和洗脱等步骤，以提取出目标代谢产物。
2. 色谱柱选择选择适当的色谱柱对于HPLC分析非常重要。
常用的色谱柱类型包括正相色谱柱、反相色谱柱、离子交换色谱柱等。
选择色谱柱的依据主要是根据药物代谢产物的性质和分离要求。
3. 流动相组成和条件优化根据色谱柱的选择和分析目标，应选择合适的流动相组成，并优化流动相的条件，如流速、温度等。
通过试错法和一系列实验，可以获得最佳的条件，以达到最好的分离效果和峰形。
4. 检测器选择和优化HPLC分析中常用的检测器包括紫外-可见检测器（UV-Vis Detector）、荧光检测器（Fluorescence Detector）、质谱检测器（Mass Spectrometer）等。
根据药物代谢产物的性质和检测要求，选择合适的检测器，并进行优化。
四、HPLC分析药物代谢产物的应用HPLC分析药物代谢产物的应用非常广泛，下面将介绍几个典型的应用案例。
1. 药物代谢研究HPLC可以用于研究药物在人体内的代谢途径和代谢产物的生成情况。
高效液相色谱法3
2.内标法 内标法分为 工作曲线法 内标一点法 内标二点法 内标对比法 校正因子法 在HPLC中最常用内标对比法。 选择内标物的三个条件(纯、样品中不含有、保留时 间接近)，在HPLC中的要求与GC完全一致。一般可选择 一个化学结构与待测物质相似、物理性质相近的纯物质作 为内标物，加到待测样品溶液中，经过样品前处理后进样。 使用内标法可抵消因仪器稳定性差、进样量不够准确等原 因带来的实验误差。
(一) 多环芳烃的分析 一 多环芳烃的分析(图21－18) 多环芳烃的分析，可用反相或吸附色谱法分析。反 相色谱法用ODS柱，用乙腈−水或甲醇−水为流动相。但用 甲醇−水时，保留时间较长，因此多采用梯度洗脱。多环 芳烃也可用硅胶(YWG等)柱，以不含水的正己烷为流动相， 也能获得较好的分离效果，但需注意溶解样品的溶剂应与 流动相的性质相近。许多多环芳烃是致癌物质，其含量监 测在食品分析与环境保护监测中都有实用意义。
(1)内标对比法： 这种方法不需知校正因子又具有内标法的定量准确 度与进样量无关的特点，方法简便实用。在药物分析中分 析结果(含量)常用标示量％表示:
( Ai / As )样品 (ms )样品 W 标示量% = × × ×100% ( Ai / As )对照 (ms )对照 m
(21.13)
式中(ms)样品与(ms)对照分别是内标物在试样溶液及对照溶液 中的量，W为平均片重(或丸重等)，m是取样量，其它符 号的含义同GC章。若试样溶液与对照溶液中加人内标物 的量相等，所称取的样品重与平均片重相同，则上式的后 二项均等于1。
A的标示量％=(178024／202694)÷(154856／171222)×100％=97.l％ P的标示量％=(820968／202694) ÷(692272／171222)×100％=100.l％ C的标示量％=(407792／202694) ÷(372221／171222)×100％=92.5％
高效液相色谱分析
数 据 处 理
检 测 器
色 谱 柱
高效液相色谱仪一般可分为5个主要部分： 高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、 计算机控制及数据处理系统。此外还配有辅助装 置：如梯度洗脱，也叫梯度淋洗，自动进样及数 据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液 器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从 控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流 经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱 进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪 将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色 谱图。
纯 水 制 备 仪
超 纯 水 制 备 仪
乙腈 这是反相高效液相色谱常用的溶剂，实验室常用的 只能满足紫外检测器的需要。这样的试剂很难符合荧光 和电化学检测器的要求。 甲醇 反相高效液相色谱常用的溶剂之一，其杂质主要是 水。市面上能够买到紫外光谱纯的商品，但它的主要问 题也是有些特性满足不了荧光和电化学检测分析。 氯代烃类溶剂 在正相高效液相色谱中常用的二氯甲烷等 氯代烃类溶剂中，添加稳定剂甲醇或乙醇。乙醇能够提 高流动相的极性，缩短正相高效液相色谱分析中各组分 的保留时间。各批次之间浓度的变化也许会影响重复性。 国内市场上可能不容易买到不含稳定剂的氯代烃类溶剂， 但是可以用氧化铝柱吸附的办法或者用水萃取脱掉。不 含稳定剂的氯代烃类溶剂可以缓慢的分解，特别是与其 他溶剂共存时。分解的盐酸会腐蚀不锈钢部件，损害色 谱柱。以戊烯为稳定剂的氯代烃类溶剂可避免上述产生 的问题。
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相 阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输 液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是 核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐 腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流 泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱 引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其 流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差，它 们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称 机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的 是机械往复泵。
高效液相色谱法(HPLC)
高效液相色谱法(HPLC) High Performance LiquidChromatography§3-1 高效液相色谱法概述一、定义以高压输出液体为流动相，以小粒径填料填充色谱柱的色谱分析方法。
高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术.二、HPLC特点1、高压经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。
而现代液相色谱法中，流动相改为高压输送（150～350 ⨯105 Pa，最高输送压力可达450⨯105 Pa）;2、高速由于流动相流速高，分析时间大大缩短，几min、十几min可完成一个分析任务。
3、高效HPLC色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）。
4、高灵敏度利用高灵敏度的检测器，检测灵敏度大大提高。
紫外检测器10-9g荧光检测器10-11g高效液相色谱三、液相色谱分离原理及分类液相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化学键合相色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。
四、液相色谱与气相色谱的比较1、相同点（1）基本原理一致：不同组分在两相中的作用力不同。
（2）基本概念一致：基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。
（3）基本理论一致：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。
2、不同点由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和气体的有性质本质不同，因此，两种方法也有不同之处：（1）仪器设备和操作条件不同；（2）应用范围不同；气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。
对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。
高效液相色谱HPLC流程示意图PPT课件
论文内容
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高效液相色谱(HPLC)流程示意图
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HPLC组成图
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HPLC组成示例
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高效液相色谱法的特点
▪ 高压：一般可以达到150~300kg/cm2 ▪ 高速：一般可以达到1~10mL/min ▪ 高效：一般可以达到60000理论塔板/米 ▪ 高灵敏度 ：微升数量级的就可以进行全分析
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➢分类：液—液分配色谱
液—固分配色谱 离子交换色谱 排斥色谱
➢选择：样品的分子量范围
溶解度 分子结构
❖20世纪60年代后期 液相色谱法得到了快速
发展
论文内容
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❖ 分配系数 K和分配比k K=(溶质在固定相中的浓度)/(溶质在流动相中的
浓度) =Cs / Cm
K为每一溶质的特征值，仅为固定相和温度有关， 与两相体积论文内容、柱管特性及仪器无关。 k=(组分在固定相中的质量)/(组分在流动相中的质 量)
论文内容
➢ 色谱分析方法发展概述 ➢ 分类 ➢ 基本原理
➢流出曲线及有关术语 ➢高效液相色谱简介
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❖1903年 Tswett创立色谱法（在碳酸钙上分 离了叶绿素）
❖20世纪四五十年代 出现了纸色谱（PC)和 薄层色谱法（TLC)
❖1952年 James和Martin提出了气相色谱法 （GC)
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高效液相色谱的应用
高效液相色谱，特别适用于分离 沸点高和热稳定性差的物质，目前已 广泛应用于化工、食品、医药、生化、 卫生、环境保护和高能化合物等生产 和科研工作中。
09第三章液相色谱
出峰顺序相反。
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性；
按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。
常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、
乙腈、水
采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极 性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
3. 流动相选择
非极性~中等极性组分（用于HPLC 80%）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
离子交换色谱 ion-exchange chromatography
固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液 ；阳离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；
基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组
4.7.2
离子色谱流程与装置类型
抑制型；非抑制型:
排阻色谱
size- exclusion chromatography
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分离。 小分子可以扩散到凝胶空隙， 由其中通过，出峰最慢；中等 分子只能通过部分凝胶空隙， 中速通过；而大分子被排斥在 外，出峰最快；溶剂分子小， 故在最后出峰。 全部在死体积前出峰； 可 对 相 对 分 子 质 量 在 100-105 范围内的化合物按质量分离
兼顾柱效和分析时间， 选择u 1ml / min
2）涡流扩散项及其影响因素
A 2 dp
A dp
，dp A H ，n 柱效
第三章
高效液相色谱
(High Performance Liquid Chromatography )(HPLC)
液相色谱仪
高效液相色谱分析HPLC
高效液相色谱
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第7讲
高效液相色谱
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§3-4 液相色谱法固定相
色谱柱是色谱法的心脏，固定相及装柱技术是关键。 一、液-液色谱法及离子对色谱法固定相 1.全多孔型担体：直径小于10µm（75/-4） 2.表面多孔型担体，目前不用。 3.化学键合固定相（P76及P69） a.成相：用化学的方法通过化学键把有机分子结合 到担体表面。常用18碳柱 b.特点76/-5：4点. 4.分离机制77/2：既不是全部吸附过程，亦不是典型 的液-液分配过程，而是双重机制兼而有之，只是 按键合量的多少而各有侧重.
第7讲
高效液相色谱
第16页
离子对色谱分离过程示意图
第7讲
高效液相色谱
第17页
五、离子色谱法 1.固定相:离子交换树脂 流动相:电解质溶液 检测器:电导检测器 主配件：抑制柱 2. 流程图：fig3-2 3.分离机制 （阴离子为例） a.双柱型：化学抑制型离子色谱法； b.单柱型：非抑制型，用低电导的洗脱液； 4.应用：从无机和有机阴离子到金属阳离子，从 有机阳离子到糖类、氨基酸等均可用该法分析.
高效液相色谱
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第三章
高效液相色谱分析（HPLC）
§3-1高效液相色谱的特点 一、定义：液相色谱法是指流动相为液体的色谱 技术。 二、特点 1.高压: 可达150～350×105 Pa 2.高速: 例，分离20种氨基酸，经典色谱法要20 多小时，用HPLC只需1小时。 3.高效：3万塔板/米（GC2000塔板/米） 4.高灵敏度： 紫外检测器10-9 g 荧光检测器10-11g
高效液相色谱
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第7讲
高效液相色谱
第7页
高效液相色谱分析
（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。
（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外 检测器时，流动相不应有紫外吸收。
五、 影响分离的因素 1. 影响分离的因素 （1） 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 在高效液相色谱中 , 液体的扩散系数仅为气体的万 分之一，则速率方程中的分子扩散项 B/U较小，可以忽 略不计，即： H=A+Cu 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所 示。
5. 离子色谱 ion chromatography 离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的 一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了 特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为 柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，
是测定混合阴离子的有效方法。
6. 尺寸排斥色谱 size- exclusion chromatography
固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；
化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键 合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。
C-18柱（反相柱）。
2. 液-固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatography
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使
用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
高压 高速
3 . 流程及主要部件 （1） 流程
（2）主要部件
① 高压输液泵
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ <10m），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
仪器分析 第三章高效液相色谱分析
主要分离机理
吸附能，氢键 疏水分配作用 溶质分子大小 库仑力 立体效应 生化特异亲和力
主要分析对象或应用领域
异构体分离、族分离，制备 各种有机化合物的分离、分析与制备 高分子分离，分子量及其分布的测定 无机离子、有机离子分析 手性异构体分离，药物纯化 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
第二节 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
同时消耗样品少。
2、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
（1）速度快-通常分析一个样品在15～30 min，有些样 品甚至在5 min内即可完成。 （ 2 ）分辨率高 - 可选择固定相和流动相以达到最佳分离 效果。 （3）灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学 检测器可达0.1pg。 （ 4 ）柱子可反复使用 - 用一根色谱柱可分离不同的化合 物。 （ 5 ）样品量少，容易回收 - 样品经过色谱柱后不被破坏， 可以收集单一组分或做制备。
基本要求： ①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定 量的准确性至关重要；②流量准确可调，0.1～10 ml/min， ③输出压力高，一般应能达到 150 ～ 300kg/cm2 ；④液流稳 定，无脉动；⑤ 死体积小，要求小于0.5ml。⑥密封性能好， 耐腐蚀。
泵的使用及注意事项： ①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂 质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预 先过滤除去流动相中的任何固体微粒，泵的入口都应连接 砂滤棒。 ②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动 相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况 下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏， 甚至只是由于溶液的静臵，就可能析出盐的微细晶体，这 些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。 因此，用后必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于 色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（如对于反相键合硅胶 固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。
大学 师范类 化学专业 仪器分析学科 第三章高效液相色谱法
阳离子交换
- + M++ RSO3 H
H+ + RSO3 M+
-
阴离子交换
Cl X RNR+ + 3
阳离子交换树脂
RNR3 X + Cl-
+
-
3、流动相
水相缓冲液+有机溶剂
调节选择性的 主要参数
盐种类及浓度 pH值
各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：
2 2 2 柠檬酸离子 SO4 C 2O4 I NO3 CrO4 Br
( BH+ RSO3 )m ( BH+ RSO3 ) s
离子对
+ + 通式 B+ + A ( ) ( B B A A )s m 疏水性离子对不易在水中离解而迅速进入有机相中， 存在下述萃取平衡：
X+水相+ Y-水相
[B A ]s [ B A ]s KB A [B ]m [B ]m [A ] m
故要减小He，提高柱效，应采用小颗粒固定 相并填充均匀。
HPLC
2、分子扩散相Hd（纵向扩散项）
cd Dm Hd u
cd ：常数
Dm ：分子在流动相中的扩散系数
u :
流动相流速
Dm 一般很小，当u较大时，Hd很小，Hd可忽略
HPLC
3、传质阻力项
HPLC
（1） 固定相传质阻力项
Hs Cs d f Ds u
硅烷化反应
硅胶
十八烷基 氯硅烷
ODS(C18)键合相 非极性
键合固定相类 型 疏水基团 烷烃（C8和C18）、苯基等 极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
第3章+高效液相色谱分析
不同待测离子与反离子形成离子对的能力不同， 分配系数存在差异，导致在固定相中滞留时间不同， 从而实现色谱分离。
离子对的容量因子k可表示为：
VS 1 k DX K XY [Y ]水相 VM
则组分的保留时间：
L 1 t R (1 K XY [Y ]水相 ） u
分析实例：
§3-4 液相色谱的流动相
当固定相选定时，流动 相的种类、配比能显著地影 响分离效果，因此流动相的 选择很重要。
1.选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相（防止微量杂质长 期累积，损坏色谱柱和使检测器噪声增加) 。 （2）避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度。 （4）溶剂的黏度小些为好。 （5）流动相同时还应满足检测器的要求。比如当使用 紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。
子或反离子)，加到流动相中与溶质离子结合形成疏
水性离子对，从而控制溶质离子的保留行为。 阴离子分离：对离子常用烷基铵类，如氢氧化十 六烷基三甲铵。 阳离子分离：对离子常用烷基磺酸(己烷磺酸钠)。 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C18 柱)， 含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样
离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-。
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分离。小分子 可以扩散到凝胶空隙中通过，出 峰最慢；中等分子只能通过部分 凝胶空隙，中速通过；而大分子 被排斥在外，出峰最快；溶剂分 子小，故在最后出峰。 相对分子质量在100～105范围 内的化合物按质量分离。
空间排阻色谱固定相
（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构。 水为流动相。适用于常压排阻分离。 （2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶。 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性 溶剂 （3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；如可控孔径玻璃微球，具有 恒定孔径和窄粒度分布。 化学稳定性，热稳定性好，机械强度大，流动相性质 影响小，可在较高流速下使用。
高效液相色谱法(HPLC)的概述
此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC主要内容包括：1.高效液相色谱法（HPLC）的概述2. 高效液相色谱基础知识介绍（1——13楼）3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类4. 液相色谱的适用性5.应用高效液相色谱法（HPLC）的概述以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。
由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用X围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）为最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
系统组成：（一）高压输液系统由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。
1.贮液罐由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。
贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。
仪器分析课后题答案（第四版）
仪器分析课后题答案（第四版）第⼆章⽓相⾊谱分析1. 当下列参数改变时:(1)柱长缩短,(2)固定相改变,(3)流动相流速增加,(4)相⽐减少,是否会引起分配系数的改变?为什么?答:固定相改变会引起分配系数的改变,因为分配系数只与组分的性质及固定相与流动相的性质有关.所以（1）柱长缩短不会引起分配系数改变（2）固定相改变会引起分配系数改变（3）流动相流速增加不会引起分配系数改变（4）相⽐减少不会引起分配系数改变2.当下列参数改变时: (1)柱长增加,(2)固定相量增加,(3)流动相流速减⼩,(4)相⽐增⼤,是否会引起分配⽐的变化?为什么?答: k=K/b,⽽b=VM/VS ,分配⽐除了与组分,两相的性质,柱温,柱压有关外,还与相⽐有关,⽽与流动相流速,柱长⽆关.故:(1)不变化,(2)增加,(3)不改变,(4)减⼩3．能否根据理论塔板数来判断分离的可能性?为什么?答: 不能,有效塔板数仅表⽰柱效能的⾼低,柱分离能⼒发挥程度的标志,⽽分离的可能性取决于组分在固定相和流动相之间分配系数的差异.4．在⼀根2 m 长的⾊谱柱上,分析⼀个混合物,得到以下数据:苯、甲苯、及⼄苯的保留时间分别为1?20“, 2…2”及3?1“；半峰宽为0.211cm, 0.291cm, 0.409cm ，已知记录纸速为1200mm.h-1,求⾊谱柱对每种组分的理论塔板数及塔板⾼度。
解：三种组分保留值⽤记录纸上的距离表⽰时为：苯：（1+20/60）×[（1200/10）/60]=2.67cm甲苯：(2+2/60) ×2=4.07cm⼄苯: (3+1/60) ×2=6.03cm甲苯和⼄苯分别为：1083.7,0.18cm; 1204.2,0.17cm5．试述速率⽅程中A, B, C三项的物理意义. H-u 曲线有何⽤途?曲线的形状主要受那些因素的影响?解: A 称为涡流扩散项, B 为分⼦扩散项，C 为传质阻⼒项。
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B tR ，B Dg
Dg
T
或Dg
T M
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2、 HPLC：H He Hs u （忽略纵向扩散项后）
Hd Cd Dm
Dm
T
柱温T 低，流动相 大 B相忽略
讨论：
1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）
u 1cm / s时，H u u H ，n 柱效 ，但tR
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HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向 作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相 极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例 的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选 择性。 3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
)2
W1 2
k
t
' R
t0
neff
n理
( 1
k
k
)
2
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二、速率理论（与GC对比）
1、 GC：H A B / u C u （填充柱）
或 H B / u C u （毛细管柱）
A 2 dp
A dp
B 2 Dm 2 Dg
利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面。 （1）分离机制：分配 + 吸附（以LLC为基础）
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（2）特点： 不易流失 热稳定性好 化学性能好 载样量大 适于梯度洗脱
2、液固吸附色谱法（LSC） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂。
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2）涡流扩散项及其影响
He 2 dp He dp
，dp A H ，n 柱效
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3）纵向扩散项
Hd
Cd Dm u
分子在液相中的扩散系数比气相中要小4-5个数量
级，当流动相的线速度大于 0.5 cm/s时，此项可以忽
略。
4）传质阻力项及其影响
（1）固定相传质阻力项
Hs
Cs
d
2 f
Ds
u
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（2）流动相传质阻力项 ①流动的流动相传质阻力项
Hm
Cmd
2 p
Dm
u
②滞留的流动相传质阻力项
H sm
Csm
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（1）分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
S
tR
t0 (1
K
Vm
)
kK S Vm
分离前提：K不等或k不等
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3-3 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理
1.液液分配色谱法（LLC）及化学键合固定相色谱
（CBC） （1）分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异 （2）固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）
缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液——极性
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3-2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 理论与气相色谱一致。
一、塔板理论
H理 L / n理
n理
(tR
)2
5.54( tR W1 2
)2
16(tR W
)2
Heff L / neff
neff
16( t
' R
)
2
W
5.54(
t
' R
第3章 高效液相色谱分析法 HPLC
（High Pertormance Liquid Chromatography）
3-1 高效液相色谱法的特点
一、高效液相色谱法特点
高效液相色谱法特指一种用液体为流动相的色谱 分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了 高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检 测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。
固定液——非极性
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（3）正相色谱——固定液极性 > 流动相极性 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于
分离极性组分。 反相色谱——固定液极性 < 流动相极性 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于
分离非极性组分。 （一）常规化学键合相
T Dm Ht ，但易产生气泡
T Dm ， ，柱阻
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结论： 1、提高柱效，必须提高柱内填料装填的均匀性 和减小粒度以加快传质速率。 2、液相色谱的柱效比气相高的多，且流速比 GC流速小近一个数量级。 3、HPLC还要主意柱外展宽，包括柱前扩展和 柱后扩展，前者主要是由进样所引起，后者主 要是由连接管、检测器流通池体积所引起。
d
2 p
Dm
u
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化学化工学院HtHmFra bibliotekHsm
Hs
Hm
H
（忽略固定相传质阻抗）
sm
HPLC：H He Cm u Csm u
dp 2 H m H sm Dm
H dp2 Dm
Dm
T
dp Ht H ，n 柱效
Dm H ，n 柱效
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高压：150-350×105 Pa
高速：一般在1h内完成 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测） 二、HPLC与GC差别 1．分析对象的区别
GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样 品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测占有 机物的20%。
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HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有 机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制， 对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测。用途广泛，占有机物的 80%。 2．流动相差别的区别
GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。