荧光素酶报告系统 luciferase reporter assay design
利用ChIPseq双荧光素酶报告基因技术验证PPAR2的靶向基因MYH7
利用ChIPseq双荧光素酶报告基因技术验证PPAR2的靶向基因MYH7一、本文概述本文旨在利用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和双荧光素酶报告基因技术（Dual-Luciferase Reporter Assay）来验证过氧化物酶体增殖物激活受体2（PPAR2）是否直接靶向调控肌球蛋白重链7（MYH7）基因。
PPAR2作为一种核受体，在多种生物学过程中发挥着关键作用，包括脂肪代谢、炎症反应和细胞分化等。
MYH7，作为肌球蛋白家族的一员，主要参与肌肉收缩和细胞骨架组成，其表达调控对于肌肉发育和功能至关重要。
因此，探究PPAR2是否通过直接结合MYH7基因启动子区域来调控其表达，对于理解PPAR2在肌肉生物学中的作用具有重要意义。
本文首先利用ChIP-seq技术，通过高通量的方法寻找PPAR2在体内结合的DNA序列，从而确定MYH7基因是否为其潜在的靶向基因。
在此基础上，通过构建包含MYH7基因启动子区域的双荧光素酶报告基因质粒，利用荧光素酶活性的变化来反映PPAR2对MYH7启动子的转录激活作用。
这种方法结合了染色质免疫沉淀的高特异性和荧光素酶报告基因技术的高灵敏度，为验证PPAR2对MYH7的靶向调控提供了强有力的实验手段。
通过本文的研究，我们期望能够明确PPAR2是否直接调控MYH7基因的表达，揭示这一调控过程的具体分子机制，并为进一步理解PPAR2在肌肉生物学中的功能提供新的线索。
二、材料与方法1 细胞系：使用人源细胞系，例如HEK293T细胞，用于后续的ChIP-seq和双荧光素酶报告基因实验。
2 ChIP-seq试剂：染色质免疫沉淀（ChIP）试剂盒、蛋白酶抑制剂、DNA纯化试剂盒、DNA片段化酶、测序引物等。
3 双荧光素酶报告基因系统：包含PPAR2反应元件（PPRE）的荧光素酶报告质粒，以及用于转染细胞的荧光素酶底物。
4 PPAR2特异性抗体：用于ChIP实验的PPAR2转录因子特异性抗体。
荧光素酶报告系统
亦称发光酶。
是催化生物发光的酶系的总称。
它是光物质的冷水抽提物在氧中发光时，底物虫荧光素被消耗以后残余的对热不稳定的高分子成分。
现在对萤虫相海萤以及发光细菌的虫荧光素酶结晶物的研究得最多。
它们属于加氧酶（oxygenase），不含金属和辅酶。
对于发光，有的酶必须以ATP等作为辅助因子，有的则不需要。
其发光机制等已了解到可因种的不同而有很大的差异，虫萤光素酶具有高度的特异性，一般仅作用于来自近缘种的虫荧光素。
当然，萤虫、海萤的酶是不能互相代替引起发光的。
海萤的虫荧光素酶在干燥状态下相当稳定，可以保存双荧光素酶报告基因测试∶结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。
但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求,检测特点存在差异。
Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。
双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。
系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。
对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。
双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。
介绍双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。
检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。
通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。
报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。
荧光素酶互补实验原理
光素酶互补实验原理
荧光素酶互补技术能验证转录因子互作
转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。
某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。
荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。
其原理简述如下：
（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。
（2）将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。
如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。
（3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。
报告基因荧光素酶
报告基因荧光素酶1. 引言报告基因荧光素酶（Reporter gene luciferase）是一种用来研究基因表达的工具。
通过将荧光素酶基因与感兴趣的基因连接，我们可以追踪基因在细胞中的表达情况。
本文将介绍报告基因荧光素酶的原理、应用领域以及常见的实验方法。
2. 原理报告基因荧光素酶的原理基于反应底物荧光素与酶催化产生可见光的机制。
报告基因荧光素酶最常用的类型是火萤荧光素酶（Firefly luciferase）和海洋荧光素酶（Renilla luciferase）。
这两种酶的反应机制类似，都是在反应底物存在的条件下，通过氧化底物产生荧光。
具体而言，火萤荧光素酶催化底物荧光素，在氧气的参与下，荧光素通过氧化反应生成激发态氧化荧光素，并伴随着产生的荧光。
海洋荧光素酶则使用底物海洋荧光素，在氧气存在的条件下被酶催化氧化为产生荧光。
这两种荧光素酶所发出的荧光具有较高的强度和稳定性，因此广泛应用于基因表达研究和生物荧光成像等领域。
3. 应用领域3.1 基因表达分析报告基因荧光素酶通过转染至感兴趣的细胞中，能够随着目标基因的表达而发出荧光信号。
这使得基因表达的量化和动态变化的监测成为可能。
通过测量荧光强度，可以了解基因在不同条件下的表达水平，为基因调控和功能研究提供重要的数据依据。
3.2 药物筛选利用报告基因荧光素酶，可以构建新型的荧光素酶报告系统，用于药物筛选。
这种系统通过将荧光素酶与靶标基因连接，观察不同药物对基因表达的影响。
另外，荧光素酶可以被快速、准确地检测，从而提高药物筛选的效率。
3.3 细胞追踪研究报告基因荧光素酶可以用来追踪特定细胞在动物体内或培养基中的迁移、增殖和转化等过程。
通过将荧光素酶与标记细胞连接，可以观察细胞的迁移情况并实时监测。
4. 实验方法4.1 转染报告基因将报告基因荧光素酶载体构建成合适的质粒，并转染至目标细胞中。
转染方法可以选择常规的化学法、电穿孔法或者病毒载体转染等。
Dual-Luciferase 双荧光素酶报告基因检测系统
Dual-Luciferase®双荧光素酶报告基因检测系统产品包装目录号价格Dual-Luciferase® Reporter Assay System 100 次检测E19101000次检测E1960Dual-Luciferase® Reporter Assay System10-pack1000次检测E1980Dual-Luciferase® Reporter 1,000 AssaySystemPassive Lysis 5× Buffer 30ml E1941描述：普洛麦格公司的双荧光素酶报告基因(DLR™)检测系统为双报告基因检测提供有效手段。
在DLR™ 检测中，萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶和海肾(Renilla reniformis)荧光素酶可在单个样品中连续测量。
测量过程是：加入荧光素酶检测试剂II (LARII)产生萤火虫荧光信号，信号持续至少1 分钟，这样先测量萤火虫荧光素酶报告基因。
定量萤火虫荧光强度之后，再在同一样品中加入Stop & Glo®试剂，将上述反应猝灭，并同时启动海肾荧光素酶反应，同时进行第二次测量。
如果使用带有试剂自动注射器的荧光发光计，两个检测可在4秒内完成。
在DLR™检测系统中，两个报告基因产生的线性检测范围均在小于10-18摩尔的灵敏度范围内，两个报告基因在实验宿主细胞内均无内源活性。
另外，此系统中一体化形式的双荧光素酶检测既可快速定量检测转染细胞，也可用于快速定量检测无细胞转录/翻译反应体系中的两个报告基因。
普洛麦格公司的合成海肾基因phRL系列：普洛麦格公司曾为双荧光素酶报告基因（DLR™）检测系统设计了萤火虫荧光素酶报告基因载体和野生型海肾报告基因载体pRL系列。
phRL和pRL系列载体均提供海肾荧光素酶的组成性表达，可与任何实验用萤火虫荧光素酶载体组合，共同转染哺乳动物细胞。
双荧光素酶报告数据分析(3篇)
第1篇摘要：双荧光素酶报告系统（Dual Luciferase Reporter Assays, DLRA）是一种广泛应用于生物科学研究中的细胞功能检测技术。
通过分析荧光素酶的活性，可以评估细胞内信号通路的激活情况，从而研究基因表达调控、细胞增殖、细胞凋亡等多种生物学过程。
本文将对双荧光素酶报告数据分析的方法、注意事项以及结果解读进行详细阐述。
一、引言双荧光素酶报告系统是一种基于荧光素酶活性的细胞功能检测技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。
荧光素酶是一种在细胞内自然存在的酶，能够将荧光素底物催化生成荧光物质。
在双荧光素酶报告系统中，通常使用两种荧光素酶：萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase, FL）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase, RL）。
FL的荧光强度通常作为报告基因的活性，而RL的荧光强度则作为内参基因，用于校正实验误差和细胞活力。
二、实验原理双荧光素酶报告系统的基本原理是：将目的基因与荧光素酶基因（FL或RL）的启动子连接，构建报告基因质粒。
将报告基因质粒转染到细胞中，细胞内荧光素酶的活性与目的基因的表达水平成正比。
通过检测细胞内两种荧光素酶的荧光强度，可以评估目的基因的表达水平。
三、实验方法1. 构建报告基因质粒（1）设计荧光素酶基因（FL或RL）的启动子序列，并与目的基因序列连接。
（2）将连接好的基因序列克隆到载体质粒中，构建报告基因质粒。
2. 细胞培养与转染（1）培养细胞至对数生长期。
（2）用脂质体或电穿孔等方法将报告基因质粒转染到细胞中。
3. 荧光素酶活性检测（1）收集转染后的细胞，用荧光素酶底物进行孵育。
（2）使用荧光光度计检测细胞内FL和RL的荧光强度。
4. 数据分析（1）计算FL和RL的相对荧光强度（RFU）。
（2）计算目的基因的表达水平（FL/Rlu）。
四、数据分析方法1. 相对荧光强度（RFU）计算RFU = 荧光强度 / 标准曲线斜率2. 目的基因表达水平计算目的基因表达水平 = FL/Rlu其中，FL为FL的相对荧光强度，Rlu为RL的相对荧光强度。
转录因子研究方法
转录因子研究方法转录因子（transcription factor）是一类能够结合到特定DNA序列上，调控基因转录的蛋白质。
研究转录因子可以帮助我们理解基因表达调控的机制以及其在生物学中的重要作用。
下面将介绍一些研究转录因子的常用方法。
1. DNA 亲和层析法（DNA affinity chromatography）DNA亲和层析法是一种常用的转录因子鉴定方法。
首先，需要合成一段包含感兴趣DNA序列的亲和标签。
然后将这些亲和标签与细胞核提取物混合，在水合胶柱中进行层析分离。
之后，通过洗脱和免疫印迹等方法可以鉴定特定转录因子与该DNA序列的结合。
2. 电泳迁移移位分析（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）EMSA是一种在体外研究转录因子结合DNA的常用方法。
该方法可以检测转录因子与DNA结合形成复合物后形成的新的电泳迁移带。
首先，需要纯化转录因子或使用细胞核提取物。
然后，将DNA序列与荧光标记等进行标记，并将其与转录因子混合。
之后，通过电泳迁移实验，观察复合物的电泳迁移带的变化，以判断转录因子是否与DNA结合。
3. 转录激活试验（Luciferase reporter assay）转录激活试验常用于研究转录因子对基因转录的调控作用。
该方法利用目标基因启动子区域的增强子或顺式作用元件（cis-acting elements），将其与荧光素酶（luciferase）等标记基因连在一起构建报告基因检测系统。
然后将转录因子与转染载体一起转染到细胞中，并测量荧光素酶的活性。
通过荧光素酶活性的变化，可以判断转录因子对基因转录的调控作用。
4. 冷凝点及位点测序（ChIP-seq）冷凝点及位点测序（chromatin immunoprecipitation followed by sequencing，ChIP-seq）是一种高通量测序方法，用于研究转录因子结合DNA 上的特定位点。
2015启动子克隆与荧光素酶报告基因分析
• 基因表达的必要条件
应用原理简述如下：
（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶 表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。 （2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共 转染实验需要的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启 动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与 转录因子的作用强度成正比。 （3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应， 产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活 性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。
质粒共转染
Luciferase assay
裂解细胞，添加buffer以及底物荧光素
底物过剩的情况下，转录 因子的作用越强，荧光素 酶表达量越高，萤光越亮。
Promega双萤光素酶检测试剂盒操作步骤：
1.制备细胞裂解液：加入足够的1X裂解缓冲液（室温平衡）以覆盖 细胞（如：六孔板加200ul） a.对于贴壁细胞，在吸尽细胞培养液后可以直接加入报告基因细 胞裂解液。 b.晃动培养皿数次以保证裂解缓冲液完全覆盖细胞。将细胞从培 养皿刮下。将细胞及所有的液体转移至一个离心管中。将离心管 置于冰上。 旋涡震荡离心管5-10 秒钟，然后以 12,000 x g 离心 15 秒钟（室温）或长至2 分钟（4℃）。将上清液转移至一个新 的试管中。 2.融解荧光素酶检测试剂，并达到室温。 3.按仪器操作说明书开启荧光测定仪，将测定间隔设为2秒，测 定时间设为10秒。 4.每个样品测定时，取细胞裂解液20ul，加入100ul荧光素酶检测试 剂，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU(relative light unit)。 以报告基因细胞裂解液为空白对照。 5.归一化=RLU萤火虫荧光素酶/RLU海肾荧光素酶
报告基因的特点： 1. 全序列已测定和已被克隆； 2. 表达产物在受体细胞中无内源表达； 3. 其表达产物能进行定量测定。 转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功 能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因 子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的 序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和 顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑 制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异 顺序结合的重要手段。
Luciferase报告基因系统
Luciferase报告基因系统Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。
荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。
然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。
荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。
是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。
实验原理：转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。
某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。
荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。
其原理简述如下：（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。
（2）将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染HEK293T细胞或其它相关的细胞系。
如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。
（3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。
Luciferase原理示意图基本实验步骤：1、实验第一天，消化并接种细胞（根据具体实验选择合适的细胞）于35 mm 细胞培养皿，置于5％ CO2、饱和湿度的37℃培养箱内培养过夜。
2、等细胞密度达到70％时用Luciferase 报告基因质粒、LacZ 的表达质粒及其它质粒（根据具体实验确定）共转染细胞（根据具体实验选择转染方法，如磷酸钙沉淀法、PEI、lipofectamine2000 等均可）。
luciferase assay原理
luciferase assay原理Luciferase assay原理引言：Luciferase assay是一种广泛应用于生物学研究中的实验技术，它基于荧光素酶（luciferase）催化底物产生可观测的荧光信号的原理。
这种技术在基因表达分析、蛋白质相互作用研究和药物筛选等领域都发挥着重要作用。
本文将详细介绍Luciferase assay的原理及其应用。
一、Luciferase assay的基本原理Luciferase assay的基本原理是利用荧光素酶催化底物发光的特性来检测目标生物分子的活性或表达水平。
荧光素酶是一种存在于许多生物体中的内源性酶，它能够氧化底物（如D-荧光素）产生光信号。
Luciferase assay通过向待测样品中添加荧光素底物，并测量产生的荧光信号的强度，来间接评估目标生物分子的活性或表达水平。
二、Luciferase assay的步骤1. 构建荧光素酶基因的表达载体：首先需要将荧光素酶基因克隆到一个适当的表达载体中，以便在细胞内高效表达。
这个载体通常包含一个启动子、转录终止子和荧光素酶基因的编码序列。
2. 转染细胞：将构建好的表达载体转染到目标细胞中，使细胞内产生荧光素酶。
3. 加入底物：加入荧光素底物，使荧光素酶与底物发生催化反应，产生荧光信号。
4. 测量荧光信号：使用荧光分析仪或荧光显微镜等设备，测量样品中产生的荧光信号的强度。
三、Luciferase assay的应用1. 基因表达分析：Luciferase assay可以用于研究基因的调控机制和功能。
通过将荧光素酶基因与目标基因的启动子或调控序列连接，可以检测到这些序列对基因表达的影响。
通过比较不同条件下荧光素酶活性的差异，可以评估目标基因的表达水平。
2. 蛋白质相互作用研究：Luciferase assay可以用于研究蛋白质的相互作用关系。
通过将荧光素酶基因与两个相互作用的蛋白质的编码序列连接，可以检测到这两个蛋白质的相互作用。
免疫共沉淀、DAPI、荧光素酶报告protocol
免疫共沉淀实验（Coimmunoprecipitation）1，细胞接种和质粒转染：将消化完全的293T细胞（8×105）接种于6孔板，待细胞密度达到50-70%时，按照标准磷酸钙沉淀法进行转染；或者将消化完全的BHK细胞或pk15细胞（（8×105）接种于6孔板，按照Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染试剂说明进行转染。
2，细胞蛋白的收取：细胞转染24h-36h后，弃取培养液，并用预冷PBS洗涤两次。
每孔加入200μl蛋白裂解液（50mM Tris.Hcl,PH 8.0；150mM Nacl; 5mM EDTA,1% NP-40; 10% Glycerol, 配制成蛋白裂解基础液。
使用前，加入100×proteinase inhibitor cocktail 和10mM DTT）。
冰上孵育10min，涡旋1min，重复三次。
4℃，12000rpm，离心20min，收集上清，即为收取蛋白液。
3，杂蛋白的去除：向收取蛋白液中加入20μl Gamma Bind TM G Sepharose Beads ,于 4℃旋转摇床作用1h左右，以去除同Beads 非特异性结合的蛋白质。
4，4℃，3000rpm，离心3min，取上清。
BCA法测定蛋白浓度，并取500μg，调整到500 μl。
加入到预先混匀的15 μlBeads 和2μg 抗体中。
颠倒混匀，4℃旋转摇床最慢速度作用，2h至过夜。
5，4℃，3000rpm，离心3min，去除上清，并使用Lysis Buffer 基础液洗涤三次。
最后加入20μl 2X Loading Buffer, 煮沸5-10min。
4℃，3000rpm，离心3min，取上清。
6，选用合适浓度的分离胶电泳。
转印后进行Western blot检测。
激光共聚焦实验（Confocal assay）1，将玻片（Fisher brand，cover slips）预先在培养基中浸润，轻轻放入培养板孔内。
双荧光素酶报告实验
13
03
参考案例
1
案例一
分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLOCADM1 WT和PGLO-CADM1 MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XX mimic和阴性对照质粒分别 共转染至肝癌细胞Huh7中，转染24 h后裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收集上清。使用双荧光素酶 报告基因检测系统 (Dual-Luciferase® Reporter Assay System，E1910，Promega) 检测荧光素酶活性 。每个细胞样品中加入100 μL萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶 (Firely lueiferase)，加入100 μL海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶 (Renilla lueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为 相对荧光素酶活性。实验重复3次。
报告基因检测系统 (Dual-Luciferase® Reporter Assay System，E1910，Promega) 检测荧光素酶活性
。每个细胞样品中加入100 μL萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶 (Firely lueiferase)，加入100
Step2：共转染 μL海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶 (Renilla lueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为
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03
参考案例
1
案例一
分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLOCADM1 WT和PGLO-CADM1 MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XX mimic和阴性对照质粒分别
Step1：构建载体 共转染至肝癌细胞Huh7中，转染24 h后裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收集上清。使用双荧光素酶
荧光素酶报告
荧光素酶报告检测结果：双萤光素酶报告基因检测（miRNA靶基因验证）实验摘要：本实验使用双萤光素酶报告基因检测系统验证hsa-mir-21对目的基因Tropomyosin 1（TPM1）的抑制作用；通过检测带有TPM1的3‟UTR的luciferase在hsa-mir-21过表达时的表达情况，同时结合带有突变预测结合位点的3‟UTR的luciferase的表达，进一步确定了hsa-mir-21与TPM1靶基因3‟UTR的作用位点。
关键词：hsa-mir-21，3‟UTR，Tropomyosin 1（TPM1），Dual-Reporter Assay一、实验原理:萤光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶。
单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。
Dual-Luciferase双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，两者没有种源同源性并对应不同的反应底物，故而没有交叉干扰。
得益于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于miRNA靶基因验证。
由于miRNA主要通过作用于靶基因的3‟UTR起作用，可以将目的基因3‟UTR区域构建至载体中报告基因luciferase的后面，通过比较过表达或者干扰miRNA后，报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用；结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3‟UTR 的作用位点。
二、实验目的验证hsa-mir-21与靶基因Tropomyosin 1 3‟UTR是否发生作用并进一步确定hsa-mir-21与靶基因Tropomyosin 1 3‟UTR的作用位点。
三、实验步骤1. 质粒转染细胞：1) 细胞铺板：将细胞按70%的汇合度接种到96孔板。
双萤光素酶分析实验操作步骤
双荧光报告基因检测系统简明操作步骤试剂准备：磷酸盐缓冲液(PBS)PBS 缓冲液，10X (每升)11.5g Na2HPO42g KH2PO480g NaCl2g KCl溶于1 升无菌去离子水中。
1XPBS的pH应为7.4.1. 制备被动裂解缓冲液1×PLB：将1 倍体积的5×Passive Lysis Buffer(PLB)加到4 倍体积的蒸馏水中。
混合均匀。
储存在4℃（≤1 个月）。
建议每次使用前配制新鲜的1XPLB。
5XPLB 应储存在-20℃。
2．LARⅡ：用Luciferase Assay Buffer Ⅱ溶解冻干粉Luciferase Assay Substrate。
存于-20℃（≤1 个月）或-70℃（≤1 年）。
3．Stop & Glo 试剂：a. 取2.1ml 50×Stop & Glo® Substrate 加到105ml的Stop&Glo® Buffer。
在提供的棕色Stop&Glo® Reagent 瓶中，振摇10 秒。
在-20℃存15 天。
b.若配制少量的1×Stop & Glo® Reagent：将一定量的50×Stop & Glo® Substrate 加入到所需要量的Stop & Glo® Buffer 中，使终浓度成为1 倍浓度。
（例如，加0.2ml的50×Stop & Glo® Substrate到10ml 的Stop & Glo® 缓冲液中，制成1×Stop & Glo® Reagent 溶液。
）细胞裂解1．除去培养细胞中的培养基。
2．用1×PBS 清洗培养细胞。
去掉清洗液。
3．按推荐体积（见下表）将1×PLB 加入到培养孔中。
双荧光素酶报告基因检测系统的开发
Dual-luciferase reporter assay kit(1) Promega公司双荧光素酶报告基因(DLR TM)检测系统试剂盒组分：Promega的DLR TM检测试剂盒专利给出了Luciferase assay bufferII和Stop & Glo® buffer的相关组分和浓度范围，没有具体的数值。
我在专利和文献中也没有找到针对DLR TM检测试剂盒中的passive lysis buffer的成分。
Assay protocol：(2) 文献中用到的几种非商业性双荧光素报告基因检测系统细胞裂解液（cell lysis buffer）配方：(a)源自promega公司的单荧光素酶报告试剂盒：T ris-phosphate（PH7.8）25mMEGTA or EDTA2mMDTT2mMBSA1mg/mlTriton X-1001%Glycerol10%(b) Make the following stock solutions.1M HEPES pH 8 (室温RT)1M DTT (4℃)100mM MgCl2 (RT)裂解液第二种配方（100ml体系）：来自/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=250710ml 1M HEPES PH80.5ml 1M DTT2ml 100mM MgCl22ml Triton X10085ml distilled water反应缓冲液：Firefly Luciferase Assay；Renilla Luciferase Assay Reagent。
a>“A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis”文献作者给出了2种荧光素酶活性检测的反应试剂配方，并与promega公司试剂盒进行了效果比较，检测效率和灵敏度都很高，不逊于promega产品。
荧光素酶报告基因
应用
主要应用领域： 1、荧光素酶标记基因-潜在启动子/启动子核心区域检测； 2、潜在增强子/抑制子等调控子核心元件检测； 3、启动子区可能的转录因子结合位点检测； 4、启动子/增强子与转录因子的相互作用； 5、病毒/细胞相互作用-荧光素酶标记细胞； 6、药物等化学诱导因素对启动子活性的调节（抑制或增强）； 7、射线等物理诱导因素对启动子活性的调节（抑制或增强）； 8、荧光素酶标记微生物
目的
1，知其然知其所以然 2，能让非专业人员理解 3，能够和专业人员基础交流 4，能跟上生产商的培训 5，做一名专业的销售
培训方式
1，原理 2，目的 3，应用 4，客户 5，竞争对手及优势
目的及流程
• 是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。 • 转录子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为
D. 转录终止
当RNA链延伸到终止位点时，RNA将停止合成，转录泡瓦解，DNA链复原，新 生RNA链和RNA聚合酶将被释放下来。这即是转录终止。
C. 转录延伸 转录延伸即是RNA聚合酶释放σ因子离开启动子后，核心酶沿着模板DNA移
动并使新生RNA链不断伸长的过程。 D. 转录终止 当RNA链延伸到终止位点时，RNA将停止合成，转录泡瓦解，DNA链复原，
• 启动子是基因（gene）的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。 启动子是位于结构基因5ˊ端上游的一段DNA序列，能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合， 活化RNA聚合酶，启动基因转录。
双荧光素酶报告基因检测系统-promega
Dual-Luciferase® Reporter Assay试剂准备Luciferase Assay Buffer II 10mlLuciferase Assay Substrate 1vialStop & Glo® Buffer 10mlStop & Glo® Substrate, 50X 200ulPassive Lysis Buffer (PLB), 5X 30ml1.1X PLB: 加1体积的5X Passive Lysis Buffer (PLB)到4体积的dH0中，40C2保存（一个月）。
R II：将Luciferase Assay Substrate重悬于10ml Luciferase Assay BufferII 中（-200C保存1个月，-700C保存1年）。
3.1X Stop & Glo 试剂：1体积50X Stop & Glo® Substrate加入49体积的Stop& Glo® Buffer中（-200C保存15天）。
（每次试验需要100ul）细胞处理1. 吸除细胞培养液2. 1X PBS轻柔的冲洗细胞3. 加入1X PLB（推荐用量）4.细胞溶解室温条件下，轻摇细胞15min，瞬时转染和报告基因实验采用脂质体介导技术转染。
重组质粒分别为p-629/+100，p-401/+100，p-238/+100，p-80/+100，p-25/+100。
pGL3- basic为阴性对照;同时以转染phRL-tk(海肾荧光素酶)作内对照。
具体转染方法参照转染(Polifectamine Reaent)说明书进行。
1. 将质粒DNA(3.2µg)与phRL-tk (0.8µg)按1:4混合后为A液，混匀30s，PolyFect(QIAGEN)与无血清无抗生素的DMEM按1:50混匀后为B液，混匀30s;2. A+B混匀(B加入A)15s，室温下孵育5-10 min;3. 吸出六孔板中的培养液，用无血清无抗生素的DMEM洗3遍，然后加入AB混合液，每孔0.8mL;4. 6h后，加入2mL完全DMEM;5. 24h后，倒出旧培养液，换为完全DMEM;6. 100µg H2O2或B(a)P处理lh或24h;（200 µM MMS，24h-溶解于Me2SO, Sigma)；（H2O2不引起OGG1升高）7. 采用Promega公司的双报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性，检测仪器为化学发光仪(30IOC化学发光测定仪)，所有实验严格平行操作。
luciferase萤光素酶检测系统操作步骤
萤光素酶检测系统1.说明2.产品组成和储存条件3.进行萤光素酶化验前的准备工作A确定光探测的线性范围B萤光素酶测定试剂的制备C溶解缓冲液D用于制备细胞溶解物的协议E植物和细菌细胞溶解物和组织同质体的协议4.萤光素酶测定规程A手动光度计的规程B单管光度计与自动喷射器的规程C5.一般考虑A光强度优化B仪器仪表C萤火虫荧光素酶报告基因矢量6.缓冲液和溶液的组成7.相关产品8.参考文献1.说明细胞内信号转导.翻译后处理.检测很灵敏因为它的光产物有很高效的量子对于化学发光反应，和在宿主细胞和检测化学过程中无背景发光.检测快速，每个样本仅需要几秒钟萤光素酶检测系统在灵敏度和操作简易度都优于传统检测方法。
荧光素氧化电子跃迁。
单体，催化作为共基。
内聚辅酶A为改进的动力学。
氯霉素乙酰基转移酶。
荧光素酶检测系统定量检测哺乳动物细胞中报告基因。
2.储存荧光剂检测试剂（酶和缓冲液）应保存于-20℃一个月或-70℃一年。
不能和干冰一起储存。
融化试剂温度低于25℃，并使用前混匀。
储存荧光检测酶作用物在黑暗中。
报告基因溶解缓冲液储存于室温和避免光照。
荧光素酶细胞培养溶解试剂应该被储存于-20℃。
3.检测前的准备在首次开始荧光素酶测定之前，准备荧光素酶测定试剂（第3.B部分）和裂解缓冲液（部分3.C-D）。
第3.A节中注明了重要的光检测考虑因素。
此外，第5节提供了有关优化光强度和光检测仪器选择的信息。
3A.确定光探测的线性范围在进行实验之前，确定发光计的光线检测线性范围非常重要，因为发光计可以在高光强下经历信号饱和。
为了产生光单位与相对酶浓度的标准曲线，在补充有1mg / ml BSA的任何1X裂解缓冲液中连续稀释荧光素酶（纯化的荧光素酶或细胞培养物裂解物）。
添加BSA对于确保荧光素酶不会通过吸附从溶液中丢失是必要的。
重组萤火虫荧光素酶可从Promega获得（QuantiLum®重组荧光素酶，Cat。
＃E1701）。
双荧光素酶系统实验-..
荧光素酶（Luciferase）：是能够催化不同底物氧化
发光的一类酶的统称，哺乳细胞无内源性荧光素酶。
荧光素酶报告基因的优点
蛋白不需要翻译后加工，所以一旦翻译立即产生报告活性。 在所有的化学发光反应中，它的光产物具有最高的量子效
率，因而非常灵敏。另外，在宿主细胞及检测试剂中均检 测不到背景发光。
4. 测量结束后，取出EP管，再加入50μl Stop & Glo® Reagent， 吹打2-3次混匀（尽量不要吹出气泡），再次置于检测仪， 点击“Measure” 开始读数（为内参海肾荧光素酶反应强 度）。（Stop & Glo® Reagent 现配现用，不能保存）
5. 记录读数: 每个样品会有3个数值：RLU1——萤火虫荧光 素酶反应强度, RLU2——内参海肾荧光素酶反应强度, Ratio——RLU1/ RLU2。一般记录Ratio 值即可，但RLU1 和RLU2为实际荧光强度值，可以反映细胞的转染效率，也 可根据实际荧光强度来调整报告质粒与内参的比例。
刺激物处理 转染细胞 启动子-Luc
未处理对照
LUC
细胞内目的基因 的转录被激活
启动子
测得的荧光值
启动子-Luc的 启动子被激活
Luc的转录 Luc表达量
同时，为了减少内在的变化因素（如：培养细胞的数目 和活力的差别，细胞转染和裂解的效率等）对实验准确 性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（Rinilla luciferase） 的质粒（phRL-TK）作为对照质粒与报告基因质粒共转 染细胞，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验 条件变化的干扰。
为取得最佳测定效果，测定时，样品和测定试剂混 合后到测定前的时间应尽量控制在相同时间内（12秒）。
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11
Bioluminescence In Nature
Marine algae (Gonyaulax)
Lantern fish (Lampanyctodes)
Squid (Euprymna) bacteria (Vibrio)
Mushroom (Armillaria)
Post-translational regulation
• Protein stability • Protein localization • Protein:protein interactions
Disease/Immune responses
• Cellular response to infection • Cellular response to therapy • Infectious agent replication/response to therapy
Firefly luciferase - Luc2
61 kDa, ATP-dependent enzyme; utilizes beetle luciferin (D-luciferin)
• • • •
NanoLuc® - Nluc
19 kDa, ATP-independent enzyme; utilizes novel coelenterazine analog (furimazine)
Response Element fusion
transcription
REPORTER ASSAY
Figure 1
REPORTER CONSTRUCT
Promega Corporation
©2014 Promega Corporation.
6
Transcriptional Fusion To The Reporter Gene
Fold Expression
3’-UTR
fusion
post-transcriptional
REPORTER ASSAY
Figure 1
translation REPORTER CONSTRUCT
Promega Corporation
©2014 Promega Corporation.
7
Translational Fusion To The Reporter Gene
• Reporters may be used in cells, tissues, or whole
organisms
Promega Corporation
©2014 Promega Corporation.
4
Basic Reporter Assay Principle
Fold Expression
Gene expression:
Transcription and posttranscriptional regulation
• Promoters/response elements • Enhancers • 5’- and 3’-UTRs • Transcriptions factors • RNA binding proteins & miRNAs
Reporter as a translational fusion
•
• •
Genetic Reporter.
Reporter as a transcriptional fusion
•
Short protein half-life
maximally responsive
Small, compact protein
©2014 Promega Corporation.
What is a Reporter?
• Genetic reporters are indicators of gene expression
or cellular events coupled to gene expression
• Reporters can mark any gene product
Fold Expression
Protein
fusion
post-translational
REPORTER ASSAY
Figure 1
REPORTER CONSTRUCT
Promega Corporation
©2014 Promega Corporation.
8
Reporters Can Be Used For A Variety Of Applications
CMV-driven NLuc/Nano-Glo™ Assay CMV-driven FLuc/ONE-Glo™ Assay
Promega Corporation
©2014 Promega Corporation.
9
Promega Corporation
©2014 Promega Corporation.
Reporter Assay Design Considerations
Reporter Choice & Reporter Design
Reporter Design
Reporter Choice Controls
Cellular Events:
Receptor activation/signaling
• Receptor ligands, agonists & antagonists • Nuclear receptors
Pathway analysis
• Defining pathways • Protein:protein interactions
Promega Corporation
©2014 Promega Corporation.
Glow worms (Arachnocampa)
Jellyfish (Aequorea)
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Bioluminescence In The Lab - Luciferase As A Reporter
Luciferase is the generic name for the class of enzyme
Lytic
Promega Corporation
©2014 Promega Corporation.
-OR-
Live Assay
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Properties Of A Good Reporter
• • • • •
Enzyme - signal amplification Active upon synthesis - no processing or assembly No endogenous analog (protein or substrate) – low background Convenient assay Quantitative, sensitive & wide dynamic range Protein Fusion Reporter
TREATMENT
REPORTER ASSAY
Figure 1
REPORTER CONSTRUCT
Promega Corporation
©2014 Promega Corporation.
5
Transcriptional Fusion to the Reporter Gene
Promoter
or
Fold Expression
Transgenesis
Cell Culture Detection Assay
Promega Corporation
©2014 Promega Corporation.
Properties Of A Good Reporter
• •
Enzyme - signal amplification Active upon synthesis - no processing or assembly
Reporter Choice
Controls
Good Data
Transgenesis Cell Culture Detection Assay
Promega Corporation
©2014 Promega Corporation.
2
Reporter Assay Basic Concepts
Promega Corporation
•
• •
No endogenous analog (protein or substrate) – low background
Convenient assay Quantitative, sensitive & wide dynamic range
CAT β-gal GFP luciferase
Promega Corporation
• • • •
Sequence optimized
codon utilization & “cleaned”
Sequence optimized
codon utilization & “cleaned”
ห้องสมุดไป่ตู้
~200-fold increased signal compared to native luc per gene copy number Luc2 protein half-life ~ 3 hr Further destabilized version, Luc2P, ~1.5 hr protein half-life
Further ~100-fold increase in signal compared to luc/luc2 per protein copy number Nluc protein half-life >6 hr NlucP destabilized version, ~30 minute protein half-life