高效液相色谱定性定量分析方法共37页

高效液相色谱法 PPT课件

①固定相：非极性键合相如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论（solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理：朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点：灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品，应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样气相流动相液相流动相气相柱温液相柱温
气体、容易转
气体、常用氢气液体、、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节高效液相色谱法的主要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法分配色谱法（partition chromatography）吸附色谱法（adsorption chromatography）离子交换色谱法（IEC）空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度）正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈

【精品课件】高效液相色谱定性定量分析方法

• 标样的可靠性及其配制的准确度 • 色谱方法的可靠性 • 色谱泵的精确度（GPC的影响更大） • 进样器的准确度，进样技术
定量分析基本要求
• 要有纯物质做标准 • 被定量组分峰要与其他组分达到基线分离 • 符合定性参数要求 • 选择合适定量方法
定量分析基本公式
• 在某些限定条件下，被测组分的浓度与检测器的响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度与峰面积不成线性，分别取对数后呈线性。）
两谱联用技术
1 如果标准物质缺乏或难以获得；或由于结构、理化性质相似，很多物质具有十分接近，甚至相同的保留值，则保留值定性准确度存在疑问。
2 可以运用红外光谱、紫外光谱、核磁共振光谱和质谱对化合物进行定性，目前两用技术有： HPLC-紫外光谱，HPLC-红外光谱，HPLC-MS, HPLC-NMR等。
高效液相色谱定性定量分析方法
色谱分析的目的：
对未知组分进行定性分析对已知组分进行定量分析
根据色谱图上某个色谱峰的保留时间和该色谱峰在检测器上的响应信号强度，对该谱峰进行初步定性定量分析。
液相色谱定性分析液相色谱定量分析影响定量分析的因素
色谱峰的定性鉴别：
通过保留值（通常指保留时间）进行定性需要制定保留时间误差范围
• 相关系数—用来表示线性关系的好坏程度；
• 相关系数越接近1，说明线性关系越好；
• 绘制标准工作曲线时一般选取3-6个不同浓度的标准样品，相关系数起码应在0.95以上。
如达不到要求，可பைடு நூலகம்存在以下原因：
1 所选浓度范围使检测器的响应值超出了该检测器
2
响应值的线性范围；
2 实验数据的精密度太差，过于分散。
3 无论何种原因，都应重新绘制标准工作曲线。

高效液相色谱法定性定量分析.正式版PPT文档

应用范围
高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产物；合成的和天然的高分子化合物等。它们涉及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及环境污染物等，约占全部有机化合物的80％。其余20％的有机化合物，包括永久性气体，易挥发低沸点及中等分子量的化合物，只能用气相色谱法进行分析。
进样器
进样器：目前采用较多的是六通
进样阀和自动进样器。对进样装置的要求：
密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。进样方式可分为：
隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。目前应用做多的是阀进样和自动进样。
色谱柱
色谱柱的要求：
柱效高、选择性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各种微粒填料好多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)、多孔碳等，其粒度一般为3，5，7，10μm等，柱效理论值可达5～16万/米。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效;对于同系物分析，只要500 即可;对于较难的分离物质对则可采用高达2万的柱子，因此一般10～30CM左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。
数据记录及处理
目前对于数据记录及处理所采用的是计算机，计算机的广泛应用使得HPLC操作更加迅速，简便，准确，精密和自动化，现在已经可以在互联网上远程处理数据，目前计算机在HPLC上的用途主要由： 1. 采集处理和分析数据； 2. 控制仪器； 3. 色谱系统优化和专家系统。
HPLC的固定相和流动相
检测器
色谱系统优化和专家系检统。测器是HPLC系统的三大关键部件之一，作用是把洗脱液中的组分的量市售的用于HPLC的各种微粒填料好多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)、多孔碳等，

色谱定性定量分析方法 ppt课件

效能指标：评价分析方法的尺度
效能指标包括: 精密度、准确度、专属性、检测限、定量限、
线性与范围、耐用性、稳定性、系统适用性等
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不同分析测定方法的要求
药品质量标准分析方法验证药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验
指导原则药物稳定性试验指导原则缓释、控释制剂指导原则
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②准确度（accuracy）：
意义：测量值与真实值接近的程度。
药物制剂的含量测定以回收率表示。
内容：即通过在空白基质中加入已知量不同浓度的对照
品，比较测定值和加入值确定。一般在期望浓度的80%、100%、120%三个
水平量，各测定三次，回收率均值在98-102%。
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③线性范围（linearity range）：
内容：
流动相的组成和pH、商品柱的品牌尺寸、柱温等
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⑧系统适用性（ system suitability test ）：意义：保证分析系统适用于定量分析。
内容：
条件优化时考察，包括理论塔板数、分离度、拖尾因子，考察进样精密度。
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三、不同检测器的色谱信号与物质浓度关系
FID、ECD、UV检测器的响应（峰面积）与样品的浓度呈线性关系；
ELSD响应的自然对数与样品的浓度或质量呈线性关系；
质谱（MS-ESI）检测器高浓度时的响应与样品的质量可能呈二次或更复杂的方式。
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四、色谱分析方法验证
目的：
证明所采用的色谱分析方法适合于相应的检验要求，判断能否用于药品分析。
China Pharmaceutical University

超高效液相色谱.pptx

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4 超高效液相色谱的应用
药物分析如天然产物中复杂组分的分析
生化分析如蛋白质、多肽、代谢组学等生化样品
食品分析如食品中农药残留的检测
环境分析如水中微囊藻毒素的检测
其他
如化妆品中违禁品的检测
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高分辨串联质谱QTOF micro
灵敏度高(pg-fg级) 和选择性强得到的质谱谱图数据完整、品质高。因而，在天然产物，新药开发，药代研究和蛋白质组学领域的定性、定量分析研究方面占有重要地位。
2.2 超高速度
高通量实验室始终要求在单位时间内提供更多的信息和处理更多的样品并保证提供高质量的数据。
较小的颗粒能超乎寻常地提高分析速度而不降低分离度。
L N ∝ dp
颗粒度减小后，柱长可以按比例缩短而保持柱效不变
1
最佳流速∝ ——
dp
颗粒度越小，最佳流速也越大，进而可以通过提高流速
来进一步加快分离速度
两元溶剂管理：
• 高压混合 • 两元梯度 • 四溶剂选择 • 在线脱气 • 低扩散设计 • UPLC的耐压能力
3.1 超高效液相色谱的C18色谱柱
固定相粒度
直径可达
dp
1.7µm
色谱柱长可
达3-5cm
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色谱柱颗粒化学
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色谱柱硬件
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筛板、柱管和连接件，可在超过 140MPa压力下装填，保证色谱柱高柱效和长寿命。
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2.理论基础
在高效液相色谱速率理论中， Van Deemter方程式的简化表达式：
如果仅考虑固定相的粒度对的影响，其简化方程式可表达为：

定性分析用高效液相色谱法确定未知样中的成分课件

液相色谱仪工作原理图
三．仪器和试剂：
1．高效液相色谱仪，VWD（254nm）检测仪。 2．色谱柱：C18 3．超声波发生器或水泵(用于过滤或排气) 4．注射器：50微升
5．流动相： 80%甲醇+20%的水，制备前，先调节水(用酸或缓冲盐)的PH=3.5，进入系统色谱前，用超声波发生器或水泵脱气。
3、哪些条件会影响浓度测定值的准确性？
4.、为什么流动相和样品要进行脱气，否则会产生什么影响？
注意:
关机前，用过缓冲盐溶液必须先用100% 的水冲洗系统（打开排液阀，调流速为 5ml/min，冲洗约5 min，然后调流速为 1ml/min，待流速降下来后，关闭排液阀，再冲洗冲洗约20 min）；
在分配色谱中，组分在色谱柱上的保留程度取决于它们在固定相和流动相中的分配系数K：
K=（组分在固定相中的浓度）/（组分在流
动相中的浓度）
显然，K值越大，组分在固定相上的停留时间越长，容易理解：溶质流经色谱柱时，K值越大停留的时间也越长，K值越小，停留的时间也越短，当组分在固定相的K不同，就会出现差速迁移，从而达到分离的目的。
一．实验目的：
1．学习高效液相色谱仪的基本操作方法；
2．学习用高效液相色谱法确定未知样中的组分，掌握采用高效液相色谱法对物质进行定性分析。
二．实验原理：
液相色谱法就是同一时刻进入色谱柱中的各组分，由于在流动相和固定相之间溶解、吸附、渗透或离子交换等作用的不同，随流动相在色谱柱中运行时，在两相间进行反复多次（103～106次）地分配过程，使得原来分配系数具有微小差别的各组分，产生了保留能力明显差异的效果，进而各组分在色谱柱中的移动速度就不同，经过一定长度的色谱柱后，彼此分离开来：

高效液相色谱仪的定性、定量分析(未知样品中苯甲酸含量的测定)

Βιβλιοθήκη 高效液相色谱测定饮料中的苯甲酸
一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量分析方法。
二。实验原理：高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似，流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物，更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化合物。
4．进样阀从装载转向进样位，同时按进样按扭，工作站开始记录并出图11。 5．苯甲酸的色谱峰出完后，按照4-5步骤连续操作四次，获得从最低浓度到最高浓度的标准试液的五张色谱图，分别为11，12，13，14，15（15为流动相进样，设浓度为0 mg/ml）。 6．按照4-5步骤取25微升的未知样品，进样，出谱图W1。
四．实验步骤：（ESTD法） 1．标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂，用纯水或去离子水溶解，定容到 100 毫升，浓度为 1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2．打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE 工作站。设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（ 40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水 =60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基线稳定后，开始进样。 3．进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上），注入进样阀中。

现代色谱法分析技术—高效液相色谱法(分析化学课件)

分析乙苯及二甲苯三个异构体的样品，用归一化法定量结果如下，计算各组分百分含量。
组分峰面积A 重量校正因子
乙苯 120 0.97
对二甲苯 75 1.00
间二甲苯 140 0.96
邻二甲苯 105 0.98
（乙苯21.15％；对二甲苯17.50％；间二甲苯31.35％；领二甲苯24.00％）
高效液相色谱定量分析方法 ——内标法
高效液相色谱定量分析方法
目录
01 面积归一化法
02 外标法
03 内标法
高效液相色谱定量分析方法
什么是定量分析方法
实质是搞清楚样品里各组分含量有多少的问题。
高效液相色谱法：能将组分分离后再分析含量。
高效液相色谱定量分析方法—案例
怎样测出食品中的添加剂是符合标准的呢？
高效液相色谱定量分析方法—案例
高效液相色谱定性分析方法
目录
01 高效液相色谱法定性分析原理
02 高效液相色谱法定性分析方法
高效液相色谱定性分析方法
天麻为天麻片的主药，怎么鉴别天麻片里是否真正含有天麻呢？
功效祛风除湿舒筋通络活血止痛
医学用途治疗肢体拘挛治疗手足麻木治疗腰腿酸痛
高效液相色谱定性分析方法 01.定性分析原理
高效液相色谱定性分析方法
课后思考
复方感冒片里主要有伪麻黄碱、对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、右美沙芬这四种成份，请你结合
前面所学知识，说一说如何采用高效液相色谱法定性鉴别这四种成份呢？如下图所示，这个样品中是否含有这四种有效成份呢？
高效液相色谱法概念
高效液相色谱法概述
一、高效液相色谱法简介
液相色谱分析是在经典的液体柱色谱基础上，引入了气相色谱的理论；

色谱定性和定量分析PPT课件

1) 与化学方法配合进行定性分析
带有某些官能团的化合物，经一些特殊试剂处理，
发生物理变化或化学反应后，其色谱峰将会消失或
提前或移后，比较处理前后色谱图的差异，就可以
初步辨认试样含有哪些官能团。
2)与质谱、红外光谱等仪器联用
较复杂的混合物经色谱柱分离为单组分，再利
用质谱、红外光谱或核磁共振等仪器进行定性鉴定。
等量的物质得不出相等峰面积。或者说，相同的峰
面积并不意味着相等物质的量。
因此，在计算组分的量时需将面积乘上一个换算
系数，使组分的面积转换成相应物质的量。即必须将
峰面积A乘上一个换算系数进行“校正”。
1）绝对校正因子
wi=fi’Ai
比较困难的。而用ri,s定性，则只要温度一定即可。
具体做法：
在样品和标准中分别加入同一种基准物 s，将样品
的ri,s 和标准物的ri,s 相比较来确定样品中是否含有 i
组分。
4. 保留指数定性
该指数定性的重现性最佳。当固定液和柱
温一定时，定性可不需要标准物。
设正构烷烃的保留指数为碳数100。测定时，将碳数为n 和
GC是在常压下工作，而MS是在高
真空下工作，因此，必须有一个
连接装置，将色谱柱流出的载气
除去，使压强降低，样品分子进
入离子室。这个连接装置叫做分
子分离器。目前一般使用喷射式
分子分离器
载气带着组分气体，一起从色谱柱流出，经过一
小孔加速喷射进入分离器的喷射腔中，分离器进行抽
气减压，由于载气分子量小，扩散速度快，经喷咀后，
加热（可用红外线加热）汽化并由真空泵抽去，组分进入
离子源。这种方法适于非极性流动相溶剂的除去，而对于
极性溶剂，由于其汽化速度慢而不适用。

高效液相色谱六种定量方法原理及使用条件 PPT

杂质检查法
• 与外标法区别
外标法：对照和待测组分为同一物质，只能校正进了对照溶液的组分。（主成分对应主成分对照，杂质对应杂质对照）
自身对照法：对照一般为待测供试品。（所有待测组分均对应主成分对照）
如：阿昔洛韦USP有关物质中鸟嘌呤为外标法。其他杂质为自身对照法。
内标法
1、原理
• 按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子f：
质的主成分自确。首次验证时用相应首次验证时需对照品确定校正因子
检身对照法对照品确定校正因子后，
查
样品检测时要用供试
法
品就好。只需验证时确
不加校正因定校正因子，样品检测同外标法子的主成分时只需定位或RRT判定
自身对照法保留时间，节省杂质对
照品。
应用范围主要用于原料中间体等对定量要求不高的产品
高效液相色谱六种定量方法原理及使用条件
六种定量方法
• 1、峰面积百分比法 • 2、峰面积归一法 • 3、外标法
加校正因子的主成分自身对照法
• 4、杂质检查法
不加校正因子的主成分自身对照法
• 5、内标法
峰面积百分比法
• 按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。
峰面积归一法
在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液（一般为 100%限度加样溶液），进样，记录色谱图，按

高效液相色谱定性定量分析方法

2
1
134.2
220.2
0 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 Counts vs. Mass-to-Charge (m/ z)
由分子量及其质谱图可以确定该代谢物为乙酰化氨脒
定性分析—两谱联用定性
定性分析—其他方法
1 收集洗脱物后进行定性分析
` 收集色谱分离后的每一个分离组分 ` 对所得组分分别进行仪器、化学分析或其他物理
参数（如熔点、沸点、折光、旋光等）测定
定性分析—其他方法
收集组分时应注意
` 某些情形，如色谱分析，宜采用非破坏性检测器，电化学检测器不可；
` 如使用破坏性检测器，则须在检测器前分流，使分离后的一小部分组分进入检测器
` 可根据文献数据和对照品选用已知标准物，再用已知标准物进行定性
定性分析—保留值定性
3 利用已知物增加峰高法定性
将已知标准物质加到待测样品，若某一峰增高，且改变色谱柱或流动相组成后仍能使该峰增高，则可基本认定该峰与已知标准物为同一物质
定性分析—保留值定性
4 用三维图谱检测器定性
` 如果HPLC仪配备有三维图谱检测器，除比较未知组分与已知标准物保留时间外，还可比较两峰的立体构形
条件下应该有相同的保留值；但相反结论却不成立，即相同色谱条件下
，具有相同保留值的两个物质不一定是同一个物质。尚需一些辅助技术 ` 利用两谱联用定性；
其他方法定性
定性分析—保留值定性
1 已知物保留值直接对照法定性
` 未知峰保留值(t’R或V’R)与某标准物完全相同，可初步确定为同一物质
` 改变色谱柱或流动相组成，二者保留值仍完全相同，则可认定为同一物质

色谱定性、定量分析方法

外标法：外标法也称为标准曲线法。
特点及要求：外标法不使用校正因子，准确性较高，
操作条件变化对结果准确性影响较大。对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。
2024/1/5
内标法：
内标物要满足以下要求：（1）试样中不含有该物质；（2）与被测组分性质比较接近；（3）不与试样发生化学反应（4）出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰影响。试样配制：准确称取一定量的试样W，加入一定量内标物mS 计算式：
和0.85处分别测定峰宽，由下式计算峰面积： A = h·（Y 0.15 + Y 0.85 ）/ 2
（3）峰高乘保留时间法：在一定操作条件下，同系物的半峰宽与保留时间成正比，对于难于测量半峰宽的窄峰、重叠峰（未完全重叠），可用此法测定峰面积：
A = h·b·tR （42）024自/1/5动积分和微机处理法：
2. 定量校正因子
试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比，即： m i = fi ·Ai
比例系数f i ：绝对校正因子，单位面积对应的物质量： f i =m i / Ai
定量校正因子与检测器响应值成倒数关系： f i = 1 / Si
相对校正因子f ’i ：即组分的绝对校正因子与标准物质的绝对校正因子之比。
• 当mi、mS以摩尔为单位时，当mi、mS用质量单位时, 以（f ’W）,表示。
2024/1/5
3. 常用的几种定量方法
归一化法：
特点及要求：
归一化法简便、准确。进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大，仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。
4.与其他分析仪器联用的定性方法
（1）色谱-质谱联用；（2）色谱-红外光谱联用；进行结构、官能团鉴定。