原位杂交和RNA原位杂交
医学分子生物学名词解释-2
1.转录泡（三元复合物）：转录泡是由RNA聚合酶核心酶、DNA模板链以及转录形成的RNA新链三者结合形成的转录复合物。
在转录的延伸阶段，RNA聚合酶使DNA双螺旋解链，暴露出长度约为17bp的局部单链区，因外形酷似泡状结构故称之为转录泡2.3.密码子：mRNA上每 3 个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这 3 个核苷酸称为密码，也叫三联子密码4.摆动假说：在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以"摆动"，因而使某些tRNA可以识别1个以上的密码子。
5.SD序列：位于原核生物起始密码子上游7~12个核苷酸处的保守区，该序列能与16SrRNA的3端互补，促使mRNA与核糖体的结合，与翻译的起始有关。
6.校正tRNA：校正tRNA通过改变反密码子区校正突变。
可分为无义突变的校正RNA和错义突变的校正RNA、移码突变的校正RNA。
7.无义突变：在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子(UAG、UGA、UAA)，使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽的突变，叫做无义突变。
8.错义突变：错义突变是由于结构基因中某个核苷酸的变化而使一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码。
9.移码突变：在正常地DNA分子中，碱基缺失或增加非3地倍数，造成这位置之后的一系列编码发生移位错误的改变，这种现象称移码突变。
10.可读框：可读框是指mRNA上从起始密码子到终止密码子的一段序列。
11.信号肽：常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移（定位）的N-末端氨基酸序列（有时不一定在N端）。
12.分子伴侣：一类能帮助其他蛋白质进行正确组装、折叠、转运、介导错误折叠的蛋白质进行降解的蛋白。
当蛋白质折叠时，它们能保护蛋白质分子免受其它蛋白质的干扰。
很多分子伴侣属于热休克蛋白（例如HSP-60），它们在细胞受热时大量合成。
分子名词解释
.核小体（nucleosome):线性的DNA分子被折叠盘曲而包装的第一层次，数种真核细胞间期染色质经松解处理后呈现串珠样结构。
增强子（enhancer）指真核生物的一段DNA序列，不具有方向性，距离结构基因可远可近（甚至可以位于内含子）。
它与某些蛋白质因子结合后，通常能够增强启动子的转录活性，有时也可以抑制转录核酶（ribozyme）指具有催化活性的RNA，其作用底物是RNA，主要参与RNA的加工成熟。
分子伴侣（molecular chaperon）帮助新生多肽链折叠成天然空间构象的一类保守蛋白质（如热休克蛋白），在原核细胞和真核细胞中广泛存在。
分子伴侣：它是细胞中一类能够识别并结合到不完全折叠或装配的蛋白质上以帮助这些多肽正确折叠、转运或防止他们聚集的蛋白质，其本身不参与终产物的形成模板链：在转录过程中，RNA聚合酶以DNA双链中的一条链为模板，按照碱基互补配对原则合成RNA，这条作为模板的DNA链，就叫模板链。
原位杂交（in situ hybridization）：使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。
基因家族（Families of genes）：同一物种中结构与功能相似，进化起源上密切相关的一组基因。
转座子：存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位增强子（Enhancer）包括启动子上游或下游的一段DNA序列，可以增强启动子发动转录，提高转录效率。
指能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。
RNA的编辑（RNA editing）是指转录后的RNA在编码区发生碱基的突变、添加或缺失等现象。
RNA的再编码（RNA recoding)把RNA编码和读码方式的改变称为RNA的再编码核酶（ribozyme）具有催化功能的RNA为核酶核小体(nucleosome)是染色质的基本结构单位，由大约200bp 的DNA和组蛋白质八聚体及外围H1蛋白所组成转座子（transposon，Ｔn）：存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位分子伴侣(molecular chaperone)细胞中一类能够识别并结合到不完全折叠或装配的蛋白质上以帮助这些多肽正确折叠、转运或防止它们聚集的蛋白质，其本身不参与终产物的形成。
原位杂交
原位杂交原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。
其英文名为in situ hybridization,其中in situ为拉丁文，原义是"in its natural position". 字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。
原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。
这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。
该技术最早应用于6 0年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已被广泛应用，例如与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平。
原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
核酸原位杂交可根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据其所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA杂交。
但不论哪种杂交都必须经过组织细胞的固定，预杂交，杂交，冲等一系列洗步骤及放射自显影或免疫酶法显色以显示杂交结果。
我们在这儿介绍的是整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。
整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。
rna原位杂交技术
rna原位杂交技术RNA原位杂交技术（RNA in situ hybridization）是一种用于研究细胞和组织中特定RNA分子表达的重要实验方法。
它通过特异性杂交的原理，能够对细胞和组织中特定的mRNA或非编码RNA进行定位和可视化，从而揭示基因表达的时空分布情况，为研究基因功能和疾病发生机制提供了有力的工具。
RNA原位杂交技术的基本原理是利用互补的核酸序列进行杂交。
在实验中，首先需要制备一段具有特异性的标记RNA探针，该探针的序列与目标RNA的互补部分相匹配。
标记通常使用放射性同位素或荧光染料进行，以便在细胞或组织中可视化。
在进行RNA原位杂交实验时，首先需要固定样本，以保持细胞和组织的形态结构。
然后，通过脱水和透明化等处理，将样本与RNA 探针进行杂交。
杂交后，通过洗涤去除未结合的探针，然后进行探针的检测。
对于放射性标记的探针，可以使用放射自显影的方法进行可视化；对于荧光标记的探针，可以使用荧光显微镜观察。
RNA原位杂交技术在生命科学研究中具有广泛的应用。
它可以用于研究胚胎发育过程中基因表达的时空分布，揭示基因在不同发育阶段和不同组织中的表达模式。
此外，RNA原位杂交技术还可以用于研究肿瘤的发生和发展机制，通过检测癌细胞中特定基因的表达情况，揭示肿瘤细胞的分化状态和侵袭能力。
近年来，随着高通量测序技术的发展，RNA测序已经成为研究基因表达的主流方法。
然而，与RNA测序相比，RNA原位杂交技术具有直接观察细胞和组织中RNA表达的优势。
它可以提供细胞和组织层面的信息，揭示基因在空间上的分布和相互作用。
因此，RNA 原位杂交技术与RNA测序技术相辅相成，共同推动了基因表达研究的深入发展。
尽管RNA原位杂交技术在研究中具有重要意义，但也存在一些局限性。
首先，由于RNA原位杂交实验需要杂交探针与目标RNA的互补配对，因此对探针的设计和合成具有一定的挑战性。
其次，在实验过程中，样本的固定和处理等步骤可能会对RNA的结构和表达产生一定的影响，因此需要进行严格的实验控制。
原位杂交操作流程
原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1)二甲苯于37°C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4)PBS清洗3分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗10分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37°C孵育15分钟；8)PBS清洗2次，每次3分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次3分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12)PBS清洗2次，每次5分钟；13)预杂交缓冲液孵育30分钟；14)准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85°C加热5分钟，置于冰块中10分钟；15)杂交；第二天16)将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17)PBS清洗3分钟；18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中)，37°C孵育30分钟；19)PBS清洗5分钟；20)室温，2XSSC清洗10分钟；21)37°C，1XSSC清洗10分钟；22)37°C，0.5XSSC清洗10分钟；23)缓冲液A孵育10分钟；24)缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟；25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液，来自BoehringerMannheim)，37°C孵育3小时；26)缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27)缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时;29)停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30)固红，脱水以及封片进行核的复染。
2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1)二甲苯于37C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4)PBS清洗5分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗5分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml，37C孵育10分钟；8)PBS清洗2次，每次5分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次5分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2XSSC清洗10分钟；18）37°C,1XSSC清洗10分钟；19）37°C,0.5XSSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37C孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。
分子生物学 重点
名词解释DNA的解链温度或称熔点：吸光度增加到最大值一半时的温度。
内含子的可变剪接或变位剪接：在个体发育或细胞分化时可以有选择性地越过某些外显子或某个剪接点进行变位剪接，产生出组织或发育阶段特异性mRNA。
核酶：指一类具有催化功能的RNA分子，通过催化靶位点RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性地剪切底物RNA分子，从而阻断基因的表达。
原位杂交：是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，通常分为RNA原位杂交和染色体原位杂交两大类。
RNA干涉：技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因确实的表型。
葡萄糖效应：有葡萄糖存在的情况下，即使在细菌培养基中加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麦芽糖等诱导物，与其相对应的操纵子也不会启动，产生出代谢这些糖的酶来。
DNA的半保留复制 DNA在复制过程中，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。
这样新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样。
因此，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式被称为DNA的半保留复制。
DNA的半不连续复制DNA复制过程中前导链的复制是连续的，而另一条链，即后随链的复制是中断的不连续的。
RNA编辑：是某些RNA，特别是mRNA的一种加工方式，它导致DNA所编辑的遗传信息的改变，因为经过编辑的mRNA序列发生了不同于模板DNA的变化。
操纵子：是指原核生物中由一个或多个相关基因以及转录翻译调控元件组成的基因表达单元分子伴侣：是细胞中一类能够识别并结合到不完全折叠或装配的蛋白质上以帮助这些多肽正确折叠、转运或防止它们聚集的蛋白质，其本身不参与最终产物的形成冈崎片段：是在DNA半不连续复制中产生的长度为1000—2000个碱基的短的DNA片段，能被连接形成一条完整的DNA链核定位序列：蛋白质中的一个常见的结构域，通常为一短的氨基酸序列，它能与入核载体相互作用，将蛋白质运进细胞核内基因定点突变：向靶ＤＮＡ片段中引入所需的变化，包括碱基的添加、删除或改变，是分子生物学研究中一种非常有用的手段基因家族：在基因组进化中，一个基因通过基因重复产生了两个或更多拷贝，这些基因即构成一个基因家族，是具有显著相似性的一组基因，编码相似的蛋白质产物基因敲除：针对一个序列已知但功能未知的基因，从ＤＮＡ水平上设计实验，彻底破坏该基因的功能或清除其表达机制，从而推测该基因的生物学功能核小体：是染色质的基本结构单位，由大约200bp的ＤＮＡ和组蛋白八聚体所组成聚合酶链式反应：是指通过模拟体内DNA复制方式在体外选择性的将DNA某个特定区域扩增出来的技术。
核酸分子杂交的几种类型 -回复
核酸分子杂交的几种类型-回复核酸分子杂交是一种用于研究DNA和RNA相互作用的常见实验技术。
该技术可以用于研究基因表达、蛋白质相互作用、突变分析等。
在核酸分子杂交中，两条核酸链通过互补配对形成杂交（或杂交化合物）。
下面将介绍几种常见的核酸分子杂交类型。
1. 片段杂交（Dot blot）片段杂交是一种最简单的核酸杂交技术。
在这种方法中，目标DNA片段（或RNA）以单链形式固定在固相载体上，如膜片或微孔板。
然后，配对探针标记有放射性同位素或荧光染料，与目标DNA一起进行杂交。
通过检测标记的探针，可以确定是否与目标DNA片段杂交。
2. 南方杂交（Southern blot）南方杂交是一种用于检测和定量目标DNA片段的杂交技术。
在这种方法中，DNA经电泳分离后，转移到膜片上。
然后，膜片上的DNA与互补的探针分子杂交，并通过标记的探针检测杂交的目标DNA。
3. 北方杂交（Northern blot）北方杂交是一种用于检测和定量RNA的杂交技术。
在这种方法中，RNA经电泳分离后，转移到膜片上。
然后，膜片上的RNA与互补的探针分子杂交，并通过标记的探针检测杂交的目标RNA。
4. 原位杂交（In situ hybridization）原位杂交是一种用于检测细胞和组织中RNA或DNA的特定序列的杂交技术。
在这种方法中，标记的探针与固定的细胞或组织中的目标核酸序列杂交。
然后，通过显微镜观察标记的探针和目标核酸的共定位，从而确定目标序列的存在。
5. 竞争性杂交（Competitive hybridization）竞争性杂交是一种用于研究不同核酸序列之间互相竞争结合的杂交技术。
在这种方法中，标记的探针与非标记的探针或样品中的DNA或RNA 竞争杂交。
通过比较标记的探针与不同浓度的非标记探针或样品杂交的强度，可以确定不同序列之间的亲和力或结合特性。
总之，核酸分子杂交是一种重要的实验技术，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
分子生物学名词解释及分子生物学常见名词解释
重要名词：（下划线的尤其重要）1.常染色质：细胞间期核内染色质折叠压缩程度较低，碱性染料着色浅而均匀的区域，是染色质的主体部分。
DNA主要是单拷贝和中度重复序列，是基因活跃表达部分。
2.异染色质：细胞间期核内染色质压缩程度较高，碱性染料着色较深的区域。
着丝粒、端粒、次缢痕，DNA主要是高度重复序列，没有基因活性。
3.核小体：核小体是染色体的基本组成单位，它是由DNA和组蛋白构成的，组蛋白H3、H4、H2B、H2A各两份，组成了蛋白质八聚体的核心结构，大约200bp的DNA盘绕在蛋白质八聚体的外面，相邻两个核小体之间结合了1分子的H1组蛋白。
4.组蛋白：是染色体的结构蛋白，其与DNA组成核小体。
根据其凝胶电泳性质可将其分为H1、H2A、H2B、H3及H4。
5.转座子：是在基因组中可以移动和自主复制的一段DNA序列。
6.基因：原核、真核生物以及病毒的DNA和RNA分子中具有遗传效应的核苷酸序列，是遗传的基本单位。
它包括结构蛋白和调控蛋白。
7.基因组：每个物种单倍体染色体的数目及其所携带的全部基因称为该物种的基因组。
8.顺反子：由顺/反测验定义的遗传单位，与基因等同，都是代表一个蛋白质的DNA 单位组成。
一个顺反子所包括的一段DNA与一个多肽链的合成相对应。
9.单顺反子和多顺反子：真核基因转录的产物是单顺反子mRNA，即一个基因一条多肽链，每个基因转录都有各自的调控原件。
多顺反子是指原核生物一个mRNA分别编码多条多肽链，而这些多肽链对应的DNA片段位于一个转录单位内，享用同一对起点和终点。
10.转录单位：即转录时，DNA上从启动子到终止子的一段序列。
原核生物的转录单位往往可以包括一个以上的基因，基因之间为间隔区，转录之后形成多顺反子mRNA，可以编码不同的多肽链。
真核生物的转录单位一般只有一个基因，转录产物为单顺反子RNA，只编码一条多肽链。
11.重叠基因：是指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列重叠基因有多种重叠方式，比如说大基因内包含小基因，几个基因重叠等等。
rna原位杂交的原理及应用
RNA原位杂交的原理及应用概述RNA原位杂交（RNA in situ Hybridization）是一种常用的生物学技术，用于研究细胞和组织中特定RNA序列的存在和分布情况。
该技术通过将标记有合适探针的RNA与待检测样品中的互补RNA序列进行杂交，并利用探针的标记信号进行可视化，从而实现对特定RNA的检测和定位。
原理RNA原位杂交技术的基本原理主要包括以下几个步骤：1. 制备探针首先，需要制备用于杂交的RNA探针。
探针可以通过合成DNA或RNA，然后标记上荧光染料、辣根过氧化物酶（HRP）等信号源。
这些标记物的选择要根据具体实验需求和信号检测方法来确定。
2. 样品固定待检测的细胞或组织样品需要进行固定处理，以保持其形态和RNA分子的空间分布。
通常使用化学固定剂（如乙醛、甲醛）对样品进行固定。
3. 样品预处理为了提高杂交效率和信号强度，样品需要进行一定的预处理。
通常包括脱水、脱脂、蛋白酶消化等步骤，以去除样品中的干扰物质，提高标记物与目标RNA的结合。
4. 杂交将步骤1中标记的RNA探针与样品中的互补RNA序列进行杂交。
通常杂交反应在适当的温度下进行，可以使用特定的杂交缓冲液来提供合适的反应条件。
5. 信号检测与可视化通过标记物的信号来检测并可视化目标RNA的存在位置和数量。
常用的信号检测方法包括荧光显微镜观察、酶标法等。
对于荧光显微镜观察，可以利用荧光染料的特异性标记来检测目标RNA的存在。
应用RNA原位杂交技术在生物医学研究中有着广泛的应用。
以下列举几个主要应用领域：1. 基因表达和调控研究通过RNA原位杂交可以定位和检测特定基因在不同组织和器官中的表达情况，从而了解基因的空间和时间表达模式，探究基因调控机制。
2. 肿瘤研究RNA原位杂交可用于对肿瘤标志物基因的检测，帮助早期诊断和预测肿瘤发展的趋势。
此外，RNA原位杂交技术还可用于研究肿瘤相关基因的表达和定位。
3. 发育生物学研究通过RNA原位杂交可以跟踪特定基因在胚胎发育过程中的表达及细胞定位，揭示基因在发育和器官形成中的作用机制。
原位杂交技术
生物素：在动物细胞中是羧化酶的辅酶，在肝、肾、心、
肺等组织中丰富，主要集中在线粒体中。 地高辛：从洋地黄植物的花和叶中提取。
（动物细胞中不存在）
组织样品制备
（一）.去除或抑制RNA酶
方法有两类：
物理方法： 对耐高温的器具如玻璃器皿，不锈钢器具进行高
温烘烤（180-200℃干烤4-6小时）。
原理：碱基互补配对原则
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原位分子杂交
杂交体
杂交条件
严格度概念
DNA-DNA
杂交体
DNA-RNA RNA-RNA
稳定性：
DNA-DNA﹥DNA-RNA ﹥RNA-RNA
稳定性受以下因素影响：甲酰胺浓度 盐浓度等 温度等
原位杂交技术的条件
杂交液 探针浓度 温度 PH 时间
杂交液
对溶液和耐高温塑料器具作高温蒸汽消毒 化学方法：
焦磷酸二乙酯（DEPC） 作用机制：通过与组氨酸结合使蛋白质变性
（二）取材
组织要求新鲜，迅速投入到固定液中 标本置于低温环境下可抑制RNA酶作用
（三）固定
4％多聚甲醛培养2-6小时（培养细胞30分钟）
（四）包埋和切片
常规方法
（五）电镜杂交技术
（六）冷冻切片
冷冻切片保存靶细胞较多，较易获得杂交 信号
原位杂交
（一）杂交前处理
1.灭活内源性酶 在用酶作为报告分子时
（过氧化物酶 碱性磷酸酶）
2.RNA酶处理 3.盐酸和乙酸酐处理 提高杂交效率并降低背景 4.通透处理 消化去除细胞表面和内部特别是靶细胞
周围的蛋白质，增加探针等反应分子对 靶核酸分子的接触机会
温度
杂交时温度一般低于相对杂交体Tm值25℃
重庆大学考研分子生物学题库+答案
高级分子生物学1.试述利用基因工程的技术调控基因表达的主要方法原位杂交技术原位杂交(In Situ Hybridization,ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。
通常可以分为两大类：1、RNA原位杂交：用放射性或非放射性(如地高辛、生物素等)标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，就可以通过检测放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物在细胞水平上作出定性定量分析；2、荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)：首先对于寡核苷酸探针做特殊修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体的位置。
定点突变技术定点突变是重组DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。
RNAi技术RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。
其过程一般为：1、在Dicer的参与下，细胞中的双链RNA首先被降解形成21-25个核苷酸的小片段双链RNA(siRNA)；2、siRNA中的反义链指导合成一种被称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)的核蛋白体；3、RISC再介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰基因表达的功能。
2.论述原核生物和真核生物基因表达调控的异同答：1、真核生物基因组大,染色体数量多,且结构复杂,存在基因家族和断裂基因；原核生物基因组小,染色体数量少,结构简单,有重叠基因和操纵子结构，基因表达调控可以在复制、扩增、基因激活、转录、转录后、翻译和翻译后等多级水平上进行,但转录水平调控是主要的。
分子生物学复习整理
1、增强子：能提高转录起始效率的序列被成为增强子或强化子。
增强子可位于转录起始点的5’或3’末端，而且一般与所调控的靶基因的距离无关。
2、C值反常：也称C值谬误。
指C值往往与种系的进化复杂性不一致的现象，即基因组大小与遗传复杂性之间没有必然联系，某些较低等的生物C值却很大，如一些两栖动物的C 值甚至比哺乳动物还大。
3、DNA重组技术：又称基因工程，将不同的DNA片段（如某个基因或基因的一部分）按照预先的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状的技术。
4、基因家族：在基因组进化中，一个基因通过基因重复产生了两个或更多的拷贝，这些基因即构成一个基因家族，是具有显著相似性的一组基因，编码相似的蛋白质产物。
5、SD序列：存在于原核生物起始密码子AUG上游7~12个核苷酸处的一种4~7个核苷酸的保守片段，它与16SrRNA3’端反向互补，所以可将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译作用。
根据首次识别其功能意义的科学家命名。
6、核酶：是一类具有催化活性的RNA分子，通过催化靶位点RNA链中的磷酸二酯键的断裂，特异性的剪切底物RNA分子，从而阻断基因的表达。
7、RNA干扰：是利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失表型的方法。
8、反式作用因子：是指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质。
9、操纵子：是指原核生物中由一个或多个相关基因以及转录翻译调控元件组成的基因表达单元。
10、基因组：生物有机体的单倍体细胞中的所有DNA，包括核中的染色体DNA和线粒体、叶绿体等亚细胞器中的DNA。
11、cDNA文库：真核生物基因组DNA非常庞大，而且含有大量重复序列，无论用电泳分离技术还是用杂交方法都难以直接分离到靶基因片段。
为了较快地分离到相关基因，通过反转录mRNA得到的cDNA不含冗余序列，通过特异性探针筛选的cDNA构成的cDNA文库。
原位杂交
原位杂交原位杂交组织(或细胞)化学 (In situ Hybridization Histochemistry, ISHH) 简称原位杂交(In Situ Hybridization)，属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。
根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。
根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。
直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。
间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。
尽管同位素标记(如35S，3H，32P等)仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展(尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针)，更引起科技工作者的极大兴趣。
一、基本要求组织取材：组织取材应尽可能新鲜。
由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30min内固定。
固定：目的是(1)保持细胞结构；(2)最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；(3)使探针易于进入细胞或组织。
最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂(如戊二醛)不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：(1)稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。
组织和细胞标本亦可用0.2M HCl 处理10min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。
(2)去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。
原位杂交
DNA链。
3.寡核苷酸探针：10-50bp，测序、点突变。 4.RNA探针：以DNA两条链中的任意一条为模板转录 生成RNA。稳定性高、特异性强。
各种探针比较种类 来源 基因组某 一基因的全部 或编码序列 以mRNA为模板 反转录cDNA mRNA 优点 制备简单 不易降解 标记方法成熟 无内含子 缺点 非特异性杂 交 不易获得
证明，病毒的存在。 EB HBV HPV
３ 神经内分泌学：检查编码调节肽的mRNA,
确定激素的合成部位。
４ 病理学：癌基因表达。
５ 免疫学： Ag基因定位 ６ 发育生物学：基因的选择表达 原位杂交：mRNA （转录） 免疫组化：蛋白（翻译） ７ 其他：细胞外基质蛋白的来源。 胶原基因表达，Ig起源细胞
原位杂交
In situ hybridization
于 丽
一、概 述
Gall和Pardue于1969年建立。
应用于组织学、病理学、遗传学、微生物 学等多种生命学科。
检测组织细胞本身的或外源的DNA或RNA 序列。从基因水平认识疾病的本质，且在组 织细胞原位显示，有助于诊断或研究信息。
临床应用于病毒性疾病、遗传性疾病等。
A
C
B
D
原位杂交
(In situ hybridization ）
应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针
与组织、细胞中待测的核酸按碱基配对的原则
进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与
标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫
组织化学方法在核酸原有位置进行细胞内定位。
1.核酸分子杂交技术
单链的核酸分子在合适的温度和离
双链DNA
原位杂交和RNA原位杂交
原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA 或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。
为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物(曾呈奎等2000)。
RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。
该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。
其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体 (Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。
RNA原位杂交技术经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。
尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。
1 基因组原位杂交技术基因组原位杂交(Genome in situ hybridization，GISH)技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。
它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。
GISH技术最初应用于动物方面的研究(Pinkel et al.,1986)，在植物上最早应用于小麦杂种和栽培种的鉴定(余舜武等2001；王文奎等2000)。
2 荧光原位杂交技术荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位杂交技术。
rna原位杂交的应用
rna原位杂交的应用
RNA原位杂交是一种分子生物学技术，可以在组织或细胞水平上检测RNA分子的位置和表达水平。
它被广泛应用于研究发育生物学、病理学和神经科学等领域。
在发育研究中，RNA原位杂交可以帮助确定特定基因在不同细胞类型、不同发育阶段和不同组织中的表达模式。
例如，通过在果蝇胚胎中应用RNA原位杂交技术，可以确定各种基因在胚胎发育过程中的表达模式，从而深入理解果蝇胚胎发育的分子机制。
在病理学中，RNA原位杂交可以用于诊断和研究各种疾病。
例如，通过在肿瘤组织中应用RNA原位杂交技术，可以检测癌细胞中特定基因的表达水平，进而确定肿瘤的类型和严重程度。
在神经科学中，RNA原位杂交可以帮助研究神经元的分子特征和连接方式。
例如，在大脑切片中应用RNA原位杂交技术，可以确定不同区域中神经元的表达模式，从而深入理解大脑网络的组成和功能。
总之，RNA原位杂交技术是一种强大的分子生物学工具，可以在不同领域中帮助研究者深入了解细胞和组织水平的RNA表达模式和
功能。
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原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA 或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。
为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物(曾呈奎等2000)。
RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。
该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。
其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体 (Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。
RNA原位杂交技术经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。
尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。
1 基因组原位杂交技术
基因组原位杂交(Genome in situ hybridization，GISH)技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。
它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。
GISH技术最初应用于动物方面的研究(Pinkel et al.,1986)，在植物上最早应用于小麦杂种和栽培种的鉴定(余舜武等2001；王文奎等2000)。
2 荧光原位杂交技术
荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位杂交技术。
它利用荧光标记的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切片上的特异fl-N：~行杂交，通过荧光检测系统(荧光显微镜)检测信号DNA序列在染色体或DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂交位点。
FISH技术检测时间短，检测灵敏度高，无污染，已广泛应用于染色体的鉴定、基因定位和异常染色体检测等领域。
FISH是原位杂交技术大家族中的一员，因其所用探针被荧光物质标记（间接或直接）而得名，该方法在80年代末被发明，现已从实验室逐步进入临床诊断领域。
基本原理是荧光标记的核酸探针在变性后与已变性的靶核酸在退火温度下复性；通过荧光显微镜观察荧光信号可在不改变被分析对象（即维持其原位）的前提下对靶核酸进行分析。
DNA荧光标记探针是其中最常用的一类核酸探针。
利用此探针可对组织、细胞或染色体中的DNA进行染色体及基因水平的分析。
荧光标记控针不对环境构成污染，灵敏度能得到保障，可进行多色观察分析，因而可同时使用多个探针，缩短因单个探针分开使用导致的周期过程和技术障碍。
3 多彩色荧光原位杂交技术
多彩色荧光原位杂交(Multicolor fluorescence in situ hybridization，mFISH)是在荧光原位杂交技术的基础上发展起来的一种新技术，它用几种不同颜色的荧光素单独或混合标记的探针进行原位杂交，能同时检测多个靶位，各靶位在荧光显微镜下和照片上的颜色不同，呈现多种色彩，因而被称为多彩色荧光原位杂交。
它克服了FISH技术的局限，能
同时检测多个基因，在检测遗传物质的突变和染色体上基因定位等方面得到了广泛的应用(杨明杰等1998)。
4 原位PCR
原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR技术的有机结合，即通过PCR技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数增加，然后通过原位杂交技术进行检测，从而对靶核酸序列进行定性、定位和定量分析。
原位PCR技术大大提高了原位杂交技术的灵敏度和专一性，可用于低拷贝甚至单拷贝的基因定位，为原位杂交技术的发展提供了更广阔的发展前景。
原位杂交技术因其高度的灵敏性和准确性而日益受到许多科研工作者的欢迎，并广泛应用到基因定位、性别鉴定和基因图谱的构建等研究领域。
目前原位杂交技术在植物中的应用比较广泛，例如在棉花、麦类和树木等的遗传育种方面取得了显著的成就，在畜牧上原位杂交技术主要用于基因定位和基因图谱的构建以及转基因的检测和性别鉴定等方面。
在水产方面，原位杂交技术则主要应用于基因定位(多见于对鱼类和贝类等水生物的研究)和病毒的检测(多见于虾类)。
此外，原位杂交技术做为染色体高分辨显带技术的补充和发展，在水生物的细胞遗传学的研究领域将发挥更重要的作用。
同其他的生物技术一样，原位杂交技术在其发展与应用的过程中会出现一些问题，但随着原位杂交技术的不断改进与完善以及检测手段的改进，原位杂交技术的优越性越来越突出，其应用也会更加广泛。