第三章 固定化酶 (1-3节)
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酶与细胞的固定化
变化少，因而酶活力损失很少。 参与交联的基团有: a-氨基, -NH2（Lys）, -SH(cys),咪唑基(His),酚基（Tyr),等
发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等 1）引入功能团和间隔臂；
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.
常见非共价法?常见共价法?
法。 少量的持续不断的配基的脱落;
交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高? 活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比. 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产 ，薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大 ，主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
在中性pH下优先与a-氨基反应,因此有一定的选择性 缺点：在包埋过程发生的化学反应同样会导致酶的失活。
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定
固定化过程中，酶分子空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。
发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等 1）引入功能团和间隔臂；
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.
常见非共价法?常见共价法?
法。 少量的持续不断的配基的脱落;
交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高? 活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比. 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产 ，薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大 ，主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
在中性pH下优先与a-氨基反应,因此有一定的选择性 缺点：在包埋过程发生的化学反应同样会导致酶的失活。
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定
固定化过程中，酶分子空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。
第三章固定化酶反
球状固定化酶之模型的建立
• 假定球状固定化酶的半径为R，在距球中心为r处取一壳层，其厚度为dr，底物通过微孔
由外向内扩散，且通过此壳层，底物在（r+dr）处扩散进入，在r处离开，并在壳层内发
生酶促反应而消耗底物，以扩散方面为正方向，则单位时间内扩散进入微元壳层的底物
的量为
N sr d r4(r d)2 r 4(r d)2 r D e sd drS r r dr
V
为固定化酶的体积
p
Ap为固定化酶的外表面积
对于球形固定化酶， R
3
rmax ，则有
Km Des
D e(sd d2S 2r2 rd d)S rrS D e[sd(d d d) rS r2 rd d]S rrS
d[d(S0 S)
•
Des{
d(Rr)
d(Rr)
2
Rr
dd((SR 0 r S))}K rm m aS xS rr
底物浓度沿半径分布图
• 从右图可以看出，对同一位置r 处，随着Φ 的增加，底物浓度 在减少。
• Ф 的大小，表征了内扩散阻力 的大小，因此随内扩散阻力的 增大，同一位置处底物浓度减 小，而且当Ф 不变时，愈往颗 粒内部，底物浓度越小。
上式可变为 (r2 2 rd dr 2)D red s drr S r d rr2 D ed s drr S r r2 dr r S，重排后得
D e[ sr ( 2 2 rd )d d r rS r r d rr 2d d rS r r ] r 2 d r r S
两边同除以r2dr， 得
即：d2S2 2 dS
固定化酶
⑵ 醚化，先把SESA以1：2的水浸泡，在 40℃时用1M Na2CO3调pH为6.5，除去渣， 以SESA：纤维素=1：1（干重）在pH13， 85℃，醚化30min，即得到ABSE-纤维素。
A．重氮法
⑶ 去除多余的苯胺基(用0.5 M NaOH洗三次，水洗至无 色）
⑷ 重氮化盐制备。用5% NaNO2及1MHCl在10℃以下反应 15min，然后用预先冷却的0.05M HCl及H2O洗涤抽干即 成。
举例：
链霉蛋白酶55℃，120min全失活；用乙烯和 马来酸酐聚合物固定化后，相同条件下存活30%； 用溴化氰活化的纤维素固定化后，相同条件下存 活50%。
用DEAE -纤维素通过离子结合固定化转化酶在 40℃下加热 30min活力仅存4%，而游离酶在同一 条件下存在100%。
固定化酶（细胞）热稳定性变化(延胡索酸酶，千烟一郎)
1） 分配效应 2） 空间障碍效应 3） 扩散限制效应
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液 称为宏观环境。
二．固定化后酶性质的变化-酶活性的影响
活力变化的原因：
1、酶分子在固定化过程中，空间构像可能发生了变化 有时活性中心的氨基酸也会参加反应。
2、固定化后的空间障碍效应的影响。 3、内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受
⑶ 叠氮化。肼解后的CM-纤维素（1g）加入150ml 2% HCl在冰浴中混合，搅拌滴加9ml 3% NaNO2反应 20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶
(4) 偶联：经叠氮化后的载体加入0.05N pH 8.0 磷酸 缓冲液（内含250-500mg酶），5℃搅拌2-3小时， 过滤，用 0.001N HCl，水洗涤，即为固定化胰蛋白 酶（冻干保存）
5． 底物特异性变化
A．重氮法
⑶ 去除多余的苯胺基(用0.5 M NaOH洗三次，水洗至无 色）
⑷ 重氮化盐制备。用5% NaNO2及1MHCl在10℃以下反应 15min，然后用预先冷却的0.05M HCl及H2O洗涤抽干即 成。
举例：
链霉蛋白酶55℃，120min全失活；用乙烯和 马来酸酐聚合物固定化后，相同条件下存活30%； 用溴化氰活化的纤维素固定化后，相同条件下存 活50%。
用DEAE -纤维素通过离子结合固定化转化酶在 40℃下加热 30min活力仅存4%，而游离酶在同一 条件下存在100%。
固定化酶（细胞）热稳定性变化(延胡索酸酶，千烟一郎)
1） 分配效应 2） 空间障碍效应 3） 扩散限制效应
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液 称为宏观环境。
二．固定化后酶性质的变化-酶活性的影响
活力变化的原因：
1、酶分子在固定化过程中，空间构像可能发生了变化 有时活性中心的氨基酸也会参加反应。
2、固定化后的空间障碍效应的影响。 3、内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受
⑶ 叠氮化。肼解后的CM-纤维素（1g）加入150ml 2% HCl在冰浴中混合，搅拌滴加9ml 3% NaNO2反应 20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶
(4) 偶联：经叠氮化后的载体加入0.05N pH 8.0 磷酸 缓冲液（内含250-500mg酶），5℃搅拌2-3小时， 过滤，用 0.001N HCl，水洗涤，即为固定化胰蛋白 酶（冻干保存）
5． 底物特异性变化
第三章Immobilized+Enzyme(1)
Disadvantages:
Increase the diffusion resistance, so decreases the reaction rate.
§3.2 Applications of Immobilized Enzymes
Immobilized enzyme are employed in many fields.
a. Binding capacity, which is a function of charge density, functional groups, porosity, and hydrophobicity;
b. Stability and retention of the enzyme activity, which is a function of functional groups on support material and microenvironmental conditions.
Problems:
1. Leakage of enzymes into solution: Reducing the MW cutoff of membranes or the pore size of solid matrices; 2. Considerable diffusional resistance emerges: Reducing the particle size of the matrices and/or capsules; 3. Reduction of enzyme activity and stability: Alter the unfavorable microenvironmental conditions; 4. Lack of control of the microenvironment:
第三章酶的化学修饰
第三章酶的化学修饰第一节酶的分子修饰一、酶的化学修饰原因1、稳定性2、酶反应的最适条件3、酶的专一性4、米式常数过大5、临床应用的特殊要求6、酶种类的限制改变酶特性有两种主要的方法：1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。
2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。
二、酶分子修饰通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。
即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。
三、酶分子修饰的意义⏹提高酶的活力⏹增强酶的稳定性⏹降低或消除酶的抗原性⏹研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响化学修饰效果举例用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其溶血栓性提高了100倍。
用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的α－NHCH2COOH后，该酶对60℃热处理的稳定性增高了1000倍。
超氧化物歧化酶(SOD)、L-谷氨酰胺酶、L-天门冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG(聚乙二醇)修饰后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被清除的速度，酶的活力可以保存15％-45％。
四、酶化学修饰的基本原理1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。
使酶的天然构象产生“刚性”结构。
2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。
3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：A 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。
“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。
B 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
4、如何消除酶的抗原性酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。
5.酶的固定化与酶反应器
♫在包埋时发生化学聚合反应，酶容易失活； ♫只有水分子可以通过，高分子凝胶的网格扩散，只适用
于作用小分子底物和产物的酶。
孙利芹2013制作
逆胶束酶反应系统
逆胶束：表面活性剂等两性分子在有机相中自发形成聚集体，表面 活性剂亲水端连接成逆胶束的极性核，而疏水端向外进入有机相中。
酶以逆胶束形式被固定，并在有机相中参与反应。
孙利芹2013制作
微囊型：将酶或微生物包埋在高分子半透膜中的称
为微囊型。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
制备微囊型固定化酶的方法：
♫界面沉淀法：利用某些高聚物在水相和有机相界面上溶
解度极低而形成皮膜将酶包埋的方法。 常用的作为膜材料的高聚物有：硝酸纤维素、聚苯乙烯、 聚甲基丙烯酸甲酯等。 例如：三醋酸纤维能溶于二氯甲烷，但在甲苯溶液中沉 淀析出。酶水溶液+含醋酸纤维的二氯甲烷 乳浊液，在 搅拌的条件下，混入甲苯中，三醋酸纤维便在水相界面沉淀， 形成薄膜。
将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。
例如，将酶先用凝胶包埋后再用戊二醛交联，或先将酶 用硅胶等吸附后再进行交联等。这种固定化方法称为双重 固定化法。双重固定化法已在酶和菌体固定化方面广泛采 用，可制备出酶活性高、机械强度又好的固定化酶或固定 化菌体。
孙利芹2013制作
包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶 固定化的方法称为包埋法，又分为网格型和微囊型 两种方法。
一、基本概念
所谓固定化酶指在一定空间内呈闭锁状态存在 的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收利 用。
固定化所采用的酶，可以是经提取分离后得到的有 一定纯度的酶，也可以是结合在菌体(死细胞)或细胞碎 片上的酶或酶系。固定在载体上的菌体或菌体碎片称为 固定化菌体，它是固定化酶的一种形式。在固定化细胞 (活细胞)出现之前，也有人将固定化菌体称为固定化细 胞。
反应工程第三章 固定化酶反应过程动力学.
rso
•外扩散控制：酶的催化效率很高，底物的传质速率很慢。
R si k La(Cso - Csi ) kLaCso rd
•介于上述两种情况之间
第三章 固定化酶反应动力学
Rsi总是接近于动力学反应速度和扩散速度两者中比较小的那个。
Rs rso
rd Rsi
主体浓度co
第三章 固定化酶反应动力学
2.0×10-4
第三章 固定化酶反应动力学
3.3.3影响固定化酶促反应的主要因素
1）分子构象的改变
溶液酶
分子构象改变
2）位阻效应
第三章 固定化酶反应动力学
溶液酶
位阻效应
3）分配效应
第三章 固定化酶反应动力学
宏观环境
cS0 cSg
cSi
由于固定化酶的亲水性、疏水性及静电作用等引起固定化酶 载体内部底物或产物浓度与溶液主体浓度不同的现象称为分 配效应。
E
有外扩散影响时的实际 反应速率 无外扩散影响时的固定 化酶外表面处的反应速
率
R si rso
R si
rmax csi Km csi
rso
rmax cso Km cso
E
cs (1 K) cs K
cs csi / cso
Km
Km cso
Da rmax k Lacso
第三章 固定化酶反应动力学
3.3.2 颗粒内的浓度分布与有效因子
（1）颗粒内的浓度分布
第三章 固定化酶反应动力学
De
(
dcS dr
4r2 )
r r
D
e
(
dcS dr
第三章固定化酶
活
化 载
辅基
体
连接臂
载体的选择
没有特异性吸附 具有多孔性 有适合引入配基的官能团 化学稳定性 具有适当的机械强度等。
目前使用的载体主要是琼脂糖，此外还有纤维素、玻 璃珠及合成高分子材料等。
4、化学结合法－共价结合法
原理: 酶蛋白分子上的功能基
团（酶的非活性必需侧 链基团）和固相支持物
表面上的反应基团之间 形成共价键，因而将酶 固定在支持物上。
最常用的偶联基团： -NH2、COOH、-SH、-OH、酚 基、咪唑基
两种固定方式
1. 将载体有关基团 活化，然 后此活泼基团再与酶分子上 某一基团反应形成共价键。
第三章
酶的固定化
第一节 酶的固定化 第二节 辅酶的固定方法 第三节 固定化细胞 第四节 固定化酶的性质及其影响因素 第五节 固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
交联法常与吸附法结合使用，或者与 包埋法配合，目的是使酶紧紧地结合 于载体上。
酶直接交联法
在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不 溶性衍生物。
固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pH和离 子强度、温度和反应时间之间的平衡。
例：木瓜蛋白酶在0.2％酶蛋白浓度、2.3％戊 二醛、pH5.2-7.2、0℃下交联24h，可形成固 定化酶。
定向固定化方法
① 酶和抗体的亲和连接 ② 酶通过糖基部分固定化 ③ 酶和金属离子连接 ④ 分子生物学方法 基因融合法
翻译后修饰法 特定位点基因突变法
第二节 辅酶的固定方法
原因
《酶的固定化》课件
01
02
03
酶的固定化步骤：
实验 木瓜蛋白酶的固定化
取出尼龙布，用0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH值7.8）反复洗涤，洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液（0.5～1mg/mL）在4℃下固定3.5h（酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8mL）。
从酶液中取出尼龙布（保留残余酶液作测定用），用0.5mol/L NaCl溶液（用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.2）配制），洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。
热处理法只适用于热稳定性较好的酶的固定化，在热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。
（4）热处理法
步骤step
总体积Volume(ml)
总活力Total activity(u)
总蛋白Total protein(mg)
比活力Specific activity(u/mg)
纯化倍数Purification(fold)
缺点
（2）固定化（增殖）细胞的优点和缺点
（3）固定化细胞的制备（P169-178）
一般说，对于一步和两步反应的转化过程，用固定化酶较合适；对多步转化，采用整体细胞有利。
合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等）
ⅰ.优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。 ⅱ.缺点：反应条件苛刻，操作条件复杂； 酶蛋白高级结构变化，破坏活性中心，活力降低。
1
2
3
4
5
6
1
重氮法
2
叠氮法
3
烷基化反应法
4
溴化氰法
⑤载体活化方法
A．重氮法
反应示意式
NH2
NaNO2/HCl
.缩短发酵周期，提高生产能力（产率）；
02
03
酶的固定化步骤：
实验 木瓜蛋白酶的固定化
取出尼龙布，用0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH值7.8）反复洗涤，洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液（0.5～1mg/mL）在4℃下固定3.5h（酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8mL）。
从酶液中取出尼龙布（保留残余酶液作测定用），用0.5mol/L NaCl溶液（用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.2）配制），洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。
热处理法只适用于热稳定性较好的酶的固定化，在热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。
（4）热处理法
步骤step
总体积Volume(ml)
总活力Total activity(u)
总蛋白Total protein(mg)
比活力Specific activity(u/mg)
纯化倍数Purification(fold)
缺点
（2）固定化（增殖）细胞的优点和缺点
（3）固定化细胞的制备（P169-178）
一般说，对于一步和两步反应的转化过程，用固定化酶较合适；对多步转化，采用整体细胞有利。
合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等）
ⅰ.优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。 ⅱ.缺点：反应条件苛刻，操作条件复杂； 酶蛋白高级结构变化，破坏活性中心，活力降低。
1
2
3
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6
1
重氮法
2
叠氮法
3
烷基化反应法
4
溴化氰法
⑤载体活化方法
A．重氮法
反应示意式
NH2
NaNO2/HCl
.缩短发酵周期，提高生产能力（产率）；
固定化酶简述 PPT课件 通用
固定化酶的应用固定能源开发化学分析生物工程临床诊断医学环境保护酶的固定化及应用研究已得到长足进展开发新型固定化技术进传统固定化方法和注重天然高分子载体改性是酶固定化研究的主要趋生物学及生物工程医学及生命科学仍是固定化酶应用的重要场合适于化学化工及环境科学领域应用的固定化酶具有生态环境材料的鲜明特应给予足够重视
不足：由于包埋 优点：酶不参加化
学反应，整体结 构保持不变，酶 的催化活性得到 很好保留。
物或半透膜具 有一定的空间 或立体阻碍作 用，因此对一 些反应不适用
• 形式较物理法少 • 过程较物理法复杂 • 与物理法比较可形成相对 分子质量更大、不溶性的 固定化酶
传统固定化技术的改进
• 基于传统载体材料的各自优点与不足，通 过改性充分发挥其优势并弥补不足，将会 显著提高所得固定化酶的性能，已成为固 定化酶载体材料研究的主要内容之一。 • 经过近几十年的不断发展，已经产生了很 多制备载体固定化酶的新方法。
水不溶性大分子载体结合或把酶包 埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊 体中制成的。
┌─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┐ │景┆等┆生┆的┆酶┆于┆便┆制┆系┆稳│ │。┆方┆产┆酶┆是┆自┆于┆，┆统┆定│ │ ┆面┆、┆应┆近┆动┆运┆能┆中┆性│ │ ┆有┆化┆用┆十┆化┆输┆反┆分┆增│ │ ┆诱┆学┆技┆余┆生┆和┆复┆离┆加│ │ ┆人┆分┆术┆年┆产┆贮┆多┆，┆，│ │ ┆的┆析┆，┆发┆。┆存┆次┆且┆易│ │ ┆应┆和┆在┆展┆固┆，┆使┆易┆从│ │ ┆用┆医┆工┆起┆定┆有┆用┆于┆反│ │ ┆前┆药┆业┆来┆化┆利┆。┆控┆应│ └─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┘
简讯
我国自主开发成功固定化酶技术
“ 十五” 国家科技攻关计划’ 纳米材料 技术及应用开发 ’ 延续项目——纳米结构固 定化酶组装技术的开发，上 周在北京通过了 中国石油和化学工业协会、 中国钢协粉末冶 金协会共同组织的专家验收。这一成果可望 使我国 摆脱依赖进口载体生产固定化青霉素 酰化酶催化剂的被动局面，促进我国固定化 酶技术提升和抗生素产业可持续发 展。
不足：由于包埋 优点：酶不参加化
学反应，整体结 构保持不变，酶 的催化活性得到 很好保留。
物或半透膜具 有一定的空间 或立体阻碍作 用，因此对一 些反应不适用
• 形式较物理法少 • 过程较物理法复杂 • 与物理法比较可形成相对 分子质量更大、不溶性的 固定化酶
传统固定化技术的改进
• 基于传统载体材料的各自优点与不足，通 过改性充分发挥其优势并弥补不足，将会 显著提高所得固定化酶的性能，已成为固 定化酶载体材料研究的主要内容之一。 • 经过近几十年的不断发展，已经产生了很 多制备载体固定化酶的新方法。
水不溶性大分子载体结合或把酶包 埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊 体中制成的。
┌─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┐ │景┆等┆生┆的┆酶┆于┆便┆制┆系┆稳│ │。┆方┆产┆酶┆是┆自┆于┆，┆统┆定│ │ ┆面┆、┆应┆近┆动┆运┆能┆中┆性│ │ ┆有┆化┆用┆十┆化┆输┆反┆分┆增│ │ ┆诱┆学┆技┆余┆生┆和┆复┆离┆加│ │ ┆人┆分┆术┆年┆产┆贮┆多┆，┆，│ │ ┆的┆析┆，┆发┆。┆存┆次┆且┆易│ │ ┆应┆和┆在┆展┆固┆，┆使┆易┆从│ │ ┆用┆医┆工┆起┆定┆有┆用┆于┆反│ │ ┆前┆药┆业┆来┆化┆利┆。┆控┆应│ └─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┘
简讯
我国自主开发成功固定化酶技术
“ 十五” 国家科技攻关计划’ 纳米材料 技术及应用开发 ’ 延续项目——纳米结构固 定化酶组装技术的开发，上 周在北京通过了 中国石油和化学工业协会、 中国钢协粉末冶 金协会共同组织的专家验收。这一成果可望 使我国 摆脱依赖进口载体生产固定化青霉素 酰化酶催化剂的被动局面，促进我国固定化 酶技术提升和抗生素产业可持续发 展。
第3章 固定化酶催化反应过程动力学
由表面浓度 CSi 求解和由有效因子η E 求解。 （1）表面浓度 CSi 求解。由式
12
生物反应工程习题精解
第三章 固定化酶催化反应过程动力学
k L a(CS 0 − CSi ) = 引入CS＝
rmax CSi r CSi ⇒ CS 0 − CSi = max K m + CSi k L a K m + CSi
(2)、η =
3.2L－乳酸－2－单加氧酶固定在球形琼脂颗粒上，进行下述酶反应： C3H6O3+O2—C2H4O2+CO2+H2O （乳酸） （乙酸） 球形颗粒直径 4mm，浸入一完全混合溶液中，该溶液溶氧为 0.5mmol/l , 在高乳 酸 浓度下 氧 是速率 控制 的底物。 氧 在 琼脂 中有效扩散 系数 De=2.1 × 10-9m2/s , Km=0.015mmol/l , rmax=0.12mol/(kg 酶·s)。颗粒内含有 0.012kg 酶/m3 凝胶，外扩 散限制效应可忽略不计。若氧的消耗按零级动力学处理，试求： （1） 画出在球形颗粒内氧的浓度分布。 （2） 催化剂活性体积所占的分率是多少？ （3） 确定最大反应速率时所允许的最大颗粒直径是多少？ 解：由该反应为零级反应，因此可采用式 3-68 来计算最大颗粒半径。
rmax CSi ；底物由液相扩散到催化剂表面速率可表示为 K m + C Si
rmax CSi 。 K m + C Si
RSd = k L a (CS 0 − CSi ) 。在稳态时，应存在 RSi = RSd ，即 k L a(CS 0 − CSi ) =
5、固定化酶催化反应外扩散效应影响下反应速率的求解。主要包括两个方面：
衡算时，生成项为零。因此可得： N r i4π r 2 − N r+∆r i4π (r + ∆r ) 2 = 4π r 2 i∆r irS
12
生物反应工程习题精解
第三章 固定化酶催化反应过程动力学
k L a(CS 0 − CSi ) = 引入CS＝
rmax CSi r CSi ⇒ CS 0 − CSi = max K m + CSi k L a K m + CSi
(2)、η =
3.2L－乳酸－2－单加氧酶固定在球形琼脂颗粒上，进行下述酶反应： C3H6O3+O2—C2H4O2+CO2+H2O （乳酸） （乙酸） 球形颗粒直径 4mm，浸入一完全混合溶液中，该溶液溶氧为 0.5mmol/l , 在高乳 酸 浓度下 氧 是速率 控制 的底物。 氧 在 琼脂 中有效扩散 系数 De=2.1 × 10-9m2/s , Km=0.015mmol/l , rmax=0.12mol/(kg 酶·s)。颗粒内含有 0.012kg 酶/m3 凝胶，外扩 散限制效应可忽略不计。若氧的消耗按零级动力学处理，试求： （1） 画出在球形颗粒内氧的浓度分布。 （2） 催化剂活性体积所占的分率是多少？ （3） 确定最大反应速率时所允许的最大颗粒直径是多少？ 解：由该反应为零级反应，因此可采用式 3-68 来计算最大颗粒半径。
rmax CSi ；底物由液相扩散到催化剂表面速率可表示为 K m + C Si
rmax CSi 。 K m + C Si
RSd = k L a (CS 0 − CSi ) 。在稳态时，应存在 RSi = RSd ，即 k L a(CS 0 − CSi ) =
5、固定化酶催化反应外扩散效应影响下反应速率的求解。主要包括两个方面：
衡算时，生成项为零。因此可得： N r i4π r 2 − N r+∆r i4π (r + ∆r ) 2 = 4π r 2 i∆r irS
第三节酶的固定化
第三节酶的固定化随着酶学研究的深入和酶工程的发展，酶的应用越来越广泛。
将酶用物理或化学的方法固定在不溶于水的载体上，形成一种可以重复使用的酶，叫固定化酶。
固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不稳定性，具有可反复或连续使用、易与反应产物分离等显著优点，广泛应用于医药、轻工、食品等行业。
一、固定化酶的制备方法制备固定化酶的方法很多，有包埋法、吸附法、共价偶联法，以及交联法等（图2-3）。
1．包埋法将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。
包埋法根据载体材料和方法的不同，可以分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。
凝胶包埋法是将酶和含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶的方法。
最常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺等。
微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中，制成微胶囊固定化酶的方法。
常用的半透膜有尼龙膜、醋酸纤维膜等。
2．吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称为吸附法。
吸附法常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羧基磷灰石等。
吸附法制备固定化酶，操作简便、条件温和，不会引起酶的变性失活，载体价廉易得，而且可反复使用。
但由于是靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不太牢固而易脱落。
3．共价偶联法利用酶活性中心外的非必需基团与固相载体上的基团共价结合而制成固定化酶的方法叫共价偶联法，也叫共价结合法。
这种方法的优点是酶与载体牢固，制得的固定化酶稳定性好。
缺点是制备过程中反应条件较为强烈，难以控制，易使酶变性失活。
共价偶联法常用的载体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖、甲壳素等。
4．交联法交联法是采用双功能试剂使酶分子之间或酶分子与固相载体之间发生交联作用而制成固定化酶的方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。
其中应用最广泛的是戊二醛。
用交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时使用。
理学食品酶学本固定化酶课件
（1）酶的底物为小分子化合物
一般来说，当酶的底物为小分子化合物时，固定化酶的底物特异性大多数情况下不发生变化。例如，氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶等，酶的底物为大分子化合物
当酶的底物为大分子化合物时，如蛋白酶、α-淀粉酶、磷酸二酯酶等，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。这是由于载体引起的空间位阻作用，使大分子底物难以与酶分子接近而无法进行催化反应，酶的催化活力难以发挥出来，催化活性大大下降；而分子量较小的底物受到空间位阻作用的影响较小，与游离酶没有显著区别。 酶底物为大分子化合物时，底物分子量不同，对固定化酶底物特异性的影响也不同，一般随着底物分子量的增大，固定化酶的活力下降。例如，糖化酶用CMC叠氮衍生物固定化时，对分子量8000的直链淀粉的活性为游离酶的77％，而对分子量为50万的直链淀粉的活性只有15%～17％。
以上四种固定化酶方法各有其优缺点（见表4-1）。往往一种酶可以用不同方法固定化，但没有一种固定化方法可以普遍地适用于每一种酶。在实际应用时，常将两种或数种固定化方法并用，以取长补短。
各固定方法的特点与比较
四、 固定化酶的特性
（一）固定化酶的形状 （二）固定化酶的性质 （三）酶活力 （四）固定化酶的稳定性 （五）固定化酶的反应特性
酶经固定化后，其对蛋白酶的抵抗力提高。这可能是因为蛋白酶是大分子，由于受到空间位阻的影响，不能有效接触固定化酶。例如，千畑一郎发现，用尼龙或聚脲膜包埋，或用聚丙烯酰胺凝胶包埋的固定化天门冬酰胺酶，对蛋白酶极为稳定，而在同一条件下，游离酶几乎全部失活。另外固定化后酶对有机试剂和酶抑制剂的耐受性也得到了提高。
固定化可延长酶的贮藏有效期。但长期贮藏，活力也不免下降，最好能立即使用。如果贮藏条件比较好，亦可较长时间保持活力。例如，固定化胰蛋白酶，在0.0025mol/L磷酸缓冲液中，于20℃保存数月，活力尚不损失。
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共价键结合法制备固定化酶的“通式”
首先载体上引进活泼基团
然后活化该活泼基团
关键
最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键
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（4）载体活化的方法
A．重氮法 B．叠氮法 C．烷基化反应法 D．硅烷化法 E．溴化氰法
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A．重氮法
反应示意式如下
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A．重氮法
目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯 磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖 凝胶和琼脂等
该方法需要载体具有芳香族氨基
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A．重氮法
反应式及原理
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B 叠氮法
例 用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白
酶，步骤如下：
⑴ 酯化 ⑵ 肼解 ⑶ 叠氮化 (4) 偶联
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B 叠氮法
对含有羧机基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与 亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后于酶偶联
原因：酶结构的变化
空间位阻
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二． 固定化酶的性质
2． 固定化对酶稳定性的影响 （1） 操作稳定性提高
（2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 (3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 (4 ) 对分解酶的稳定性提高。 （5） 对变性剂的耐受力升高
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2 ．固定化后酶稳定性提高的原因：
（一） 吸附法 （二）结合法 （三）交联法 （四） 包埋法（entrapping method）
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（一） 吸附法
1． 物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体
吸附在其表面上。
选择载体的原则
（1）要有巨大的比表面积 （2） 要有活泼的表面 （3） 便于装柱进行连续反应。
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（二）结合法 1 离子键结合法 2 共价键结合法☆
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（三）交联法常用试剂
常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N，N’乙烯马来亚胺、双 重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都 可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱(shiff)
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（三）交联法的形式
交联法有2种形式： 酶直接交联法
双重固定法
酶辅助蛋白交联
（1） 吸附交联法
（2） 交联包埋法
不可能 低
不变
较广
小分子底物、 药用酶
2． 选择方法依据：
（1） 酶的性质 （2） 载体的性质 （3） 制备方法的选择
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3． 固定化后酶的考察项目：
（1） 测定固定化酶的活力，以确定固定化过 程的活力回收率。 （2） 考察固定化酶稳定性 （ 2） 考察固定化酶最适反应条件
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二． 酶的固定化方法
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pH对固定化酶的影响
1） 载体带负电荷，pH向碱性方向移动。
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为 宏观环境。
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3． pH的变化
载体带正电荷，pH向酸性方向移动。 （2）产物性质对体系pH的影响
催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的 pH值高；反之则低
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一． 影响固定化酶性质的因素 1． 酶本身的变化，主要是由于活性中
心的氨基酸残基、高级结构和电荷状 态等发生了变化。
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一． 影响固定化酶性质的因素
2． 载体的影响
（1） 分配效应 （2） 空间障碍效应 （3） 扩散限制效应
3. 固定化方法的影响
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二．固定化后酶性质的变化
1． 固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反 应速度下降
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1 离子键结合法
概念
常用载体:DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶 使用注意：pH、离子强度、温度
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2 共价键结合法
（1）概念
（2）可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫 键
（3）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机 载体
Enzyme Engineering 酶工程
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第三章 固定化酶
第一节 概述 第二节 固定化酶的性质及其影响因素 第三节 固定化酶的制备 第四节 固定化细胞 第五节 固定化辅酶和原生质体 第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）
的应用
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第一节 概述
固定化酶的发展史
细胞
非生长
生长
悬浮 固定化
反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活 力。
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第二节 固定化酶的性质及其影响因素提要
影响固定化酶性质的因 素
酶本身的变化 载体的影响
固定化酶的性质
固定化对酶活性的影响 固定化对酶稳定性的影响 最适pH的变化 最适温度变化 底物特异性与游离酶不同 米氏常数Km的变化
评价固定化酶的指标 评价指标
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（1） 吸附交联法
先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其 他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交 联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。
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（2）交联包埋法
把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合 体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。这 样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。
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各类固定化方法的特点比较:
比较项目
制备难易 固定化程度 活力回收率
载体再生 费用
底物专一性
吸附法
结合法
物理吸附 .共价键结合 离子键结合
易 弱 较高 可能 低 不变
难 强 低 不可能 高 可变
易 中等 高 可能 低 不变
适用性
酶源多
较广
广泛
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交联法
包埋法
较难 强 中等 不可能 中等 可变
较难 强 高
酶液
固定化
材料
膜固定
连续
再循环系统
凝胶 吸附 化学连接物
半连续 分批
凝胶 吸附
生物催化剂
可溶
连续
吸附
包埋
间歇
间歇
酶 固定化
交联
化学连续 间歇
连续 活塞模式
搅拌连续反应器
连续 活塞模式 搅拌连续反应器
图6-1 生物催化剂作用方式示意
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什么是固定化酶？
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
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②界面聚合法
是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界 面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起 来。
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②界面聚合法
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固定化酶方法研究热点
1 热处理法： 2 结晶法： 3 分散法：
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第三节提要
一般方法及特点
酶的固定化方法
吸附法 结合法 交联法 包埋法
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第三节结束
点击返回
4.
或称偶联效率，活力保留百分数。
5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与
游离酶活力的比值称为相对酶活力
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四 固定化酶的活力测定方法介绍
1. 振荡测定法：
2. 酶柱测定法：
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四 固定化酶的活力测定方法介绍
3. 连续测定法 利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶
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三． 评价固定化酶的指标：
1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶
活力单位。
或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示
（酶膜、酶管、酶板）。
2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需 要的时间（t1/2）
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三． 评价固定化酶的指标：
3.
活力测定方法
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第二节结束
点击返回
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第三节 固定化酶的制备
一． 一般方法及特点 二． 酶的固定化方法
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一． 一般方法及特点
关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体 以及稳定性研究、改进。
1． 四大类方法： 吸附法（包括电吸附法） 结合法（无机多孔材料） 交联法（双功能试剂） 包埋法（微胶囊法）
4． 最适温度变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。
5． 底物特异性变化
作用于低分子底物的酶
特异性没有明显变化
既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。
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6． 米氏常数Km的变化，Km值随载体 性质变化
（1） 载体与底物带相同电荷，Km’>Km固定化酶降低了 酶的亲和力。
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2．微囊型包埋法
是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制 成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只 有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
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微囊化法制备固定化酶有两种方法
① 界面沉淀法 ②界面聚合法
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① 界面沉淀法
这是一种简单的物理法，它是利用某些高聚物在水相和 有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。
（2） 载体与底物电荷相反，静电作用，Km'<Km
退出
三． 评价固定化酶的指标：
1． 酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个
微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。
1Kat=1mol/s=60mol/min=60*106umol/min
=6*106IU
2. 酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA) 所具有的酶活力单位
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D．硅烷化法
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E ．溴化氰法
本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维 素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数 （大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的 固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好 的性能。
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E ．溴化氰法
共价键结合法制备固定化酶的“通式”
首先载体上引进活泼基团
然后活化该活泼基团
关键
最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键
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（4）载体活化的方法
A．重氮法 B．叠氮法 C．烷基化反应法 D．硅烷化法 E．溴化氰法
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A．重氮法
反应示意式如下
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A．重氮法
目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯 磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖 凝胶和琼脂等
该方法需要载体具有芳香族氨基
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A．重氮法
反应式及原理
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B 叠氮法
例 用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白
酶，步骤如下：
⑴ 酯化 ⑵ 肼解 ⑶ 叠氮化 (4) 偶联
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B 叠氮法
对含有羧机基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与 亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后于酶偶联
原因：酶结构的变化
空间位阻
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二． 固定化酶的性质
2． 固定化对酶稳定性的影响 （1） 操作稳定性提高
（2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 (3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 (4 ) 对分解酶的稳定性提高。 （5） 对变性剂的耐受力升高
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2 ．固定化后酶稳定性提高的原因：
（一） 吸附法 （二）结合法 （三）交联法 （四） 包埋法（entrapping method）
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（一） 吸附法
1． 物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体
吸附在其表面上。
选择载体的原则
（1）要有巨大的比表面积 （2） 要有活泼的表面 （3） 便于装柱进行连续反应。
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（二）结合法 1 离子键结合法 2 共价键结合法☆
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（三）交联法常用试剂
常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N，N’乙烯马来亚胺、双 重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都 可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱(shiff)
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（三）交联法的形式
交联法有2种形式： 酶直接交联法
双重固定法
酶辅助蛋白交联
（1） 吸附交联法
（2） 交联包埋法
不可能 低
不变
较广
小分子底物、 药用酶
2． 选择方法依据：
（1） 酶的性质 （2） 载体的性质 （3） 制备方法的选择
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3． 固定化后酶的考察项目：
（1） 测定固定化酶的活力，以确定固定化过 程的活力回收率。 （2） 考察固定化酶稳定性 （ 2） 考察固定化酶最适反应条件
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二． 酶的固定化方法
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pH对固定化酶的影响
1） 载体带负电荷，pH向碱性方向移动。
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为 宏观环境。
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3． pH的变化
载体带正电荷，pH向酸性方向移动。 （2）产物性质对体系pH的影响
催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的 pH值高；反之则低
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一． 影响固定化酶性质的因素 1． 酶本身的变化，主要是由于活性中
心的氨基酸残基、高级结构和电荷状 态等发生了变化。
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一． 影响固定化酶性质的因素
2． 载体的影响
（1） 分配效应 （2） 空间障碍效应 （3） 扩散限制效应
3. 固定化方法的影响
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二．固定化后酶性质的变化
1． 固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反 应速度下降
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1 离子键结合法
概念
常用载体:DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶 使用注意：pH、离子强度、温度
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2 共价键结合法
（1）概念
（2）可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫 键
（3）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机 载体
Enzyme Engineering 酶工程
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第三章 固定化酶
第一节 概述 第二节 固定化酶的性质及其影响因素 第三节 固定化酶的制备 第四节 固定化细胞 第五节 固定化辅酶和原生质体 第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）
的应用
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第一节 概述
固定化酶的发展史
细胞
非生长
生长
悬浮 固定化
反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活 力。
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第二节 固定化酶的性质及其影响因素提要
影响固定化酶性质的因 素
酶本身的变化 载体的影响
固定化酶的性质
固定化对酶活性的影响 固定化对酶稳定性的影响 最适pH的变化 最适温度变化 底物特异性与游离酶不同 米氏常数Km的变化
评价固定化酶的指标 评价指标
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（1） 吸附交联法
先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其 他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交 联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。
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（2）交联包埋法
把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合 体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。这 样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。
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各类固定化方法的特点比较:
比较项目
制备难易 固定化程度 活力回收率
载体再生 费用
底物专一性
吸附法
结合法
物理吸附 .共价键结合 离子键结合
易 弱 较高 可能 低 不变
难 强 低 不可能 高 可变
易 中等 高 可能 低 不变
适用性
酶源多
较广
广泛
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交联法
包埋法
较难 强 中等 不可能 中等 可变
较难 强 高
酶液
固定化
材料
膜固定
连续
再循环系统
凝胶 吸附 化学连接物
半连续 分批
凝胶 吸附
生物催化剂
可溶
连续
吸附
包埋
间歇
间歇
酶 固定化
交联
化学连续 间歇
连续 活塞模式
搅拌连续反应器
连续 活塞模式 搅拌连续反应器
图6-1 生物催化剂作用方式示意
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什么是固定化酶？
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
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②界面聚合法
是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界 面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起 来。
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②界面聚合法
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固定化酶方法研究热点
1 热处理法： 2 结晶法： 3 分散法：
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第三节提要
一般方法及特点
酶的固定化方法
吸附法 结合法 交联法 包埋法
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第三节结束
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4.
或称偶联效率，活力保留百分数。
5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与
游离酶活力的比值称为相对酶活力
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四 固定化酶的活力测定方法介绍
1. 振荡测定法：
2. 酶柱测定法：
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四 固定化酶的活力测定方法介绍
3. 连续测定法 利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶
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三． 评价固定化酶的指标：
1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶
活力单位。
或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示
（酶膜、酶管、酶板）。
2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需 要的时间（t1/2）
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三． 评价固定化酶的指标：
3.
活力测定方法
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第二节结束
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第三节 固定化酶的制备
一． 一般方法及特点 二． 酶的固定化方法
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一． 一般方法及特点
关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体 以及稳定性研究、改进。
1． 四大类方法： 吸附法（包括电吸附法） 结合法（无机多孔材料） 交联法（双功能试剂） 包埋法（微胶囊法）
4． 最适温度变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。
5． 底物特异性变化
作用于低分子底物的酶
特异性没有明显变化
既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。
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6． 米氏常数Km的变化，Km值随载体 性质变化
（1） 载体与底物带相同电荷，Km’>Km固定化酶降低了 酶的亲和力。
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2．微囊型包埋法
是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制 成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只 有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
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微囊化法制备固定化酶有两种方法
① 界面沉淀法 ②界面聚合法
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① 界面沉淀法
这是一种简单的物理法，它是利用某些高聚物在水相和 有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。
（2） 载体与底物电荷相反，静电作用，Km'<Km
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三． 评价固定化酶的指标：
1． 酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个
微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。
1Kat=1mol/s=60mol/min=60*106umol/min
=6*106IU
2. 酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA) 所具有的酶活力单位
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D．硅烷化法
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E ．溴化氰法
本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维 素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数 （大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的 固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好 的性能。
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E ．溴化氰法