邻苯三酚法测定SOD酶活
NBT光还原法_邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性的比较_简报_
河北职业技术师范学院学报 第14卷第2期,2000年6月Journal of Hebei Vocation2Technical Teachers College Vol.14 No.2 J une2000NB T光还原法、邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性的比较(简报)张文军1,葛 超2(1河北职业技术师范学院教务处,昌黎,066600;2河北职业技术师范学院食品工程系)关键词:SOD;酶活性测定方法;NB T光还原法;邻苯三酚自氧化法中图分类号:Q554+16 文献标识码:A 文章编号:1008-9519(2000)02-0068-03超氧化物歧化酶(SOD)是催化O-2歧化反应的酶类,它催化的反应是O-2+O-2+2H+H2O+ O2。
由于O-2是一种极不稳定的氧自由基,因此,检验SOD活性一直采用间接的方法。
笔者针对目前较普遍采用的邻苯三酚自氧化法和NB T光还原法,从灵敏度、精确度、反应特异性三个方面对两方法进行比较,以确定提纯过程中非纯品SOD及纯品SOD两种材料酶活测定的适用方法。
1 材料与方法111 材料纯品牛红细胞SOD、玉米SOD粗提液(自制)、超滤液(超滤膜MW=4000)、透析液(体积分数为014～019的硫铵分步沉淀后)。
本实验所用药品牛红细胞SOD为电泳纯、核黄素(上海化学试剂采购站供应,进口分装),Met(甲硫氨酸)、邻苯三酚为国产分析纯。
112 方法11211 NB T光还原法 根据Stewart和Bewley报导[1],在3mL反应液中含有13×10-3mol甲硫氨酸;75×10-5mol NB T;2×10-6mol核黄素;100×10-9mol ED TA;50×10-3mol磷酸缓冲液(p H 718),在4000lx光下照射15min后,NB T光化还原产物蓝色甲月替在560nm有最大吸收,在此条件下,反应被抑制50%所需酶量为1个活力单位。
邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性
2.1试剂和主要仪器
一.试剂
0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2，内含2mmol/L EDTA)：0.2mol/L Tris(内含4mmol/L EDTA)100ml与0.2mol/L HCl44.76ml混合，加双蒸水至200ml，调pH8.2±0.01;邻苯三酚(45mmol/L)：以10mmol/LHCl配制成6mmol/L溶液，存放于冰箱备用;所用试剂均为国产分析纯;实验用水为自制双蒸水;
目前超氧化物歧化酶sod活性测定结果混乱为提高测定结果的可比性对邻苯三酚自氧化法测定sod活性的方法进行了研究就该活力测定体系中缓冲溶液的介质组成浓度ph及所含的edta量等因素对测定结果响进行了探讨根据实验结果提出了新的改良方法超氧化物歧化酶sod是一种特殊的金属酶它能催化超氧阴离子自由基02发生歧化反应从而能有效清除机体内超氧阴离子自由基02是生物体重要的细胞防御系统之一具有防御氧毒抗辐射防衰老以及防治肿瘤和抗炎等药用功效1超氧化物歧化酶sod这一独特的生理功能使其在医药领域具有良好的应用前景激起了人们广泛的研究热情
2.SOD或粗醉抽提液的活性浏定:
测定时按表2加样，测定步骤与测邻苯三酚的自氧化速率同。
酶活力单位定义:在1ml反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为一个活力单位，即420nm0.030D/分为一个活力单位。若自氧化速率在36~65%，通常可按比例计算，不在此范围内的数值应增减样液量。
二、仪器:
721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)
操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率的测定:在试管中按表l加入缓冲液和双蒸水，25℃保温劝分钟，然后加入25℃预温的邻苯三酚(对照管用10mMHCI代替)，迅速摇匀，倒入比色杯中，在4加nm的分光光度计中，每隔半分钟测一次OD值，要求自氧化速率控制在0.060OD/分。
SOD活性测定(连苯三酚自氧化法)
SOD(超氧化物歧化酶)活性测定连苯三酚自氧化法(邓碧玉，袁勤生，李文杰．改良的连苯三酚自氧化测定超氧化物歧化酶活性的方法[J]．生物化学与生物物理进展．1991，18(2)：163) 一、原理超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD)普遍存在动、植物的体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下面的反应：o 2.-H++HO 222+O反应产物H 2O 2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
二、材料、仪器设备及试剂(一)材料植物器官(花瓣、叶片等) (二)仪器设备冰箱、低温高速离心机、微量加样器 (1mL 、20μL 、 100μL)、移液管、精密电子天平、UV-752型紫外分光光度计、试管、研钵、剪刀、镊子(三)试剂(1) A ：Tris(三羟甲基氨基甲烷)0.2mol/L (121.14)：取24.228g 定溶至1000mL (2) B ：HCl (分析纯36-38％) 12当量：即12mol/L 取8.3mol/L 定溶至1000mL (3) 250mL A +200mL B 定溶至1000ml PH=8.3三、试验步骤 (一)酶液的制备(1)称取植物材料0.2g ，加50mmo·L -1的Tris-HCl 缓冲液(pH=8.3)1mL(分三次加) (2)2~4℃下研磨，12000r/m 离心15min ，制备粗酶液(每个样品设三个重复) (3)在25℃保温20min 的8mL50mmol/L(PH=8.3)Tris-Hcl 缓冲液中加入25℃预热的10µL 50mmol/L 的连苯三酚(对照管用10mmol/L 的Hcl 代替)先加酶液再加连苯三酚(二)酶活力的测定酶活性单位的定义：在1mL 反应液中每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50﹪的酶量定义为一个活性单位。
取两个石英比色杯(带盖)，按下表加入反应物试剂对照管样品管Tris-Hcl缓冲(pH=8.3) 8mL 8mL粗酶液－15μL连苯三酚溶液－10μLHCl 10μL －总量8mL 8mL从加入连苯三酚开始计时，迅速摇匀，使酶与底物充分反应,倒入比色杯，在752型分光光度计上每隔30s读取反应液的325nm处OD值，连续读6min。
邻苯三酚法测定超氧化物歧化酶缓释片中SOD的活性
! 5 6 5 6 供试品溶液的制备 取 9.: 骨架缓释片 +’ 片， 研细， 精密称取适量 （约相当于 9.: &’’ !<） ， 置 用 0, 3(’ 磷酸盐缓冲液定容至 )’’ !# 的量瓶中， 冰水浴间断超声 2’ !56， 用 ’(1 ! )’’ !#， ! 微孔滤膜 滤过， 弃去初滤液， 取续滤液作为供试品溶液。 ! 56 5 8 辅料对含量测定的影响 按骨架缓释片的 处方比例称取辅料适量， 置 &’’ !# 量瓶中， 照 “& J 2 J 项下方法处理， 取续滤液， 于 +’’ P /’’ 6! 范围内 2” 扫描， 结果表明辅料在 2+) 6! 处无吸收， 不影响测 定。 “ & J 2 J +” 项下的对照品 ! 56 5 9 线性关系的考察 取 溶液， 用 0, 3(’ 的磷酸盐缓冲液分别稀释成 O’、 /1、 ・!# % & O 种溶液， 照 “ & J 2 J &” 项下方法 2O、 +/、 &+、 O! < 测定 9.: 的活力， 以活力值对浓度进行线性回归， 在 得到回归方程： ; = 1N&(1) # Q /(&N。结果表明： %& ・ 线性关系良好 （ $ = ’(NNNO） 。 O’ P O ! < !# 范围内， ! 5 6 5 : 方法精密度考察 取一批 9.: 骨架缓释片， 照 “&J2J2” 项下方法制得供试品溶液， 再按 “&(2(&” 项 下方法进行活力测定， 分别测定 ) 次， %&’ = +(2)? 。 ! 56 5 ; 空白加样回收实验 按 处 方 量 的 1’? 、
其中邻苯三 的顺应性。测定 ;<= 活性的方法很多， 酚法简便易行， 现用其测定缓释片中 ;<= 的活性， 可有效地控制制剂的质量。
两种检测SOD酶活性方法的比较_曲敏
第5卷 第10期 食品安全质量检测学报 Vol. 5 No. 102014年10月Journal of Food Safety and Quality Oct. , 2014基金项目: 黑龙江省自然科学基金项目(C2011-24)、黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12511128)及黑龙江省博士后科研启动基金项目(LBH-Q13098)Fund: Supported by Natural Science Foundation of Heilongjiang Province of China (C2011-24), Science and Technology Research Project of Heilongjiang Province Department of Education (12511128) and Postdoctoral Scientific Research Start-up Fund Project of Heilongjiang Province (LBH-Q13098)*通讯作者: 曲敏, 教授, 主要研究方向为新型植物蛋白及食品添加剂。
E-mail: qumin777@*Corresponding author: QU Min, Professor, Harbin University of Commerce, Tongda Street 138, Daoli District, Harbin 150076, China. E-mail: qumin777@两种检测SOD 酶活性方法的比较曲 敏*, 秦丽楠, 刘羽佳, 范宏臣, 朱 姝, 王金凤(哈尔滨商业大学食品科学与工程省级重点实验室, 哈尔滨 150076)摘 要: 目的 比较邻苯三酚自氧化法和氮蓝四唑(NBT)光还原法分别测定超氧化物歧化酶(SOD)酶活力的差异。
方法 采用两种方法分别测定SOD 标准品、苜蓿和番茄两种植物提取物的不同来源SOD 酶活性, 比较其精确性和灵敏度。
SOD活性测定
SOD活性测定：SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。
阻止中间物的积累而测定其酶活性。
1、试剂及仪器(1)邻苯三酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。
(2)UV－754紫外分光光度计。
2、测定方法：(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。
在25度、45ml`50mmol/L、PH值8.3、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在0.0700d/mm 左右。
(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。
0.0700－A325mm/min----------------------------------------＊100％度0.70样液稀释倍数样液稀释倍数酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------50％样液体积3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。
蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。
4、比活(u/mg蛋白)的计算：单位活力(u/ml) 总活力比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
SOD酶的提取及测定
三．材料器具
2. 仪器：高速组织捣碎机；高速冷冻离心机；层析柱 （1×40cm）；自动部分收集器；恒流泵；进样器 和微量进样器；可见/紫外分光光度计。 3. 试 剂 ： （ 1 ） pH7.8, 5mmol/L磷 酸缓 冲 液 （ 内 含 1mmol/L EDTA）；（2）考马斯亮蓝溶液：称取 100mg考马斯亮蓝G―250于50ml 95%乙醇中，摇 动，待溶解后，加入100ml 85%磷酸，反复震动后 加 蒸 馏 水 定 容 至 1000ml, 过 滤 待 用 ； （ 3 ） pH8.2, 50mmol/L Tris-HCl缓冲液；（4）50mmol/L 邻苯 三酚溶液；（5）10mmol/L HCl溶液
邻苯三酚自氧化法原理：
邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出 O2 - （超氧阴离子自由基），生成带色的中间产物 （红桔酚），反应开始后反应液先变成黄棕色，几分 钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的 中间物不断氧化的结果。本实验中测定的是邻苯三酚 自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～ 45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在 4min的范围内，中间物在325nm波长出有强烈光吸收。 当有SOD存在时，由于它能催化O2 -与H+结合生成O2 和H2O2，从而阻止了中间有色产物的积累，导致吸光 值下降因此，通过测定它们在特定波长下得光吸收变 化速率计算出SOD的酶活性 。
四.实验操作
(一) SOD的提取
1. 取当年大豆适量,冷水浸泡24h,沥干，加冰 冻的pH7.8, 5mmol/L磷酸缓冲液适量，用 高速组织捣碎机捣碎。 2. 用高速冷冻离心机以8000rpm离心除去固型 物（需4—5次，每次15min）,上清液即SOD 酶液。
（二）SOD的凝胶层析分离纯化
邻苯三酚自氧化法
1、目的采用邻苯三酚自氧化法测定大蒜不同部位的SOD酶活性2、原理根据国际酶学委员会规定，酶的比活性（specific activity）用每mg蛋白质具有的酶活性单位（U∕mg蛋白）来表示。
因此，测定样品的比活性必须测定：每mL样品中的蛋白质mg数（m g∕mL）;每ml 样品中的酶活性单位数（U∕mL）。
酶的纯度越高酶的活性也就越高。
SOD酶活性测定方法很多，如邻苯三酚自氧化法、肾上腺素自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法等。
在一般情况下，SOD酶活性只能应用间接活性测定法，本实验采用邻苯三酚自氧化法测定。
利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。
反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。
加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm[1]处测定溶液的吸光度。
酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。
邻苯三酚自氧化速率随其浓度的升高而增加[1,2]。
3、仪器、试剂和材料1)仪器UV-260紫外分光光度计（或其他型号），比色杯，样品管，自氧化管2)试剂和材料a)取培育的大蒜等量的须根，茎，叶；b)所用试剂邻苯三酚、聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)、EDTA-2Na、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、30%H2O2、三(羟甲基)氨基甲烷、浓HCl,均为分析提纯。
c)Tris-HCl 缓冲液4、操作步骤4.1SOD粗酶液的提取称取鲜重3.00 g的样品,加入少量预冷的pH=7.8的磷酸缓冲液(含0.1 mmol/L的EDTA、质量浓度为4 %的聚乙烯吡咯酮烷),冰浴研磨.将匀浆液于4 000 r/min下离心20 min.取其上清液,于60℃水浴15 min,待其冷却后,于4 000 r/min离心20 min,弃去沉淀,将上清液定容到10 mL容量瓶,4℃冰箱中保存备用[3,4]。
超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法
超氧化物歧化酶（SOD ）活性的测定方法
一、试剂
1. 0.1mol/L HCl
2. 10mmol/L HCl
3. 0.1mol/L Tris 标准溶液：12.114g 三羟甲基氨基甲烷溶于蒸馏水，并定容至1000ml.
4. 50mmol/LTris 缓冲溶液：50ml0.1mol/L Tris 标准溶液中加入0.1mol/L HCl 19.9～22.0ml,定容至100ml ，PH 为8.20。
5. 30mmol/L 邻苯三酚盐酸溶液：3.7833g 邻苯三酚溶于10mmol/LHCl 中，并用10mmol/LHCl 定容至1000ml.
二、仪器
1. 紫外分光光度计
2. 酸度计
3. 恒温水浴锅
三、操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率测定
在试管中加入4.5ml 50mmol/LTris 缓冲溶液，于25℃保温20min,加入10～20ul 30mmol/L 邻苯三酚，立即计时并摇匀，倾于比色杯内，于325nm 下，每隔1min 测吸光值一次，空白以10mmol/L HCl 代替邻苯三酚，要求自氧化速率控制在0.070 OD/min 左右。
%1004
min 1min 5⨯值值－第第自氧化速率＝OD OD 2.SOD 活性测定
将样液加入到Tris 缓冲溶液中，其余步骤同自氧化速率测定方法。
活力单位定义：将一定条件下使每毫升反应液自氧化速率抑制50%的酶量定义为一个单位（u ）。
样品质量样液体积样品稀释倍数自氧化速率速率自氧化速率－样液氧化＝活力（⨯⨯⨯⨯5.4%50%100)/SOD ml u。
邻苯三酚自氧化法测定sod活性及含量
邻苯三酚自氧化法测定sod活性及含量一、实验原理:邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。
当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过测定光吸收即可求出SOD的酶活性。
二、实验试剂：大宝sod蜜、冷丙酮、磷酸缓冲液（PH7.8，0.05mol/L)、氯仿-乙醇混合液、邻苯三酚、浓盐酸、天平、石英砂、研钵、冷冻离心机、50mL离心管 8个、紫外-可见分光光度计、250mL三角瓶8个、玻璃棒8根、试剂瓶250mL 3个、500mL 3个、250mL烧杯16个、试管带胶塞80根、移液管各5根这个液体貌似是不能研磨的，而且本身就是酶，正常的生物体内的酶不都是可溶的？研磨是为了破碎细胞的。
我觉得应该是通过加水——打碎胶体，把抗氧化剂全都搞到水中（这个拜托查下）——分液——乙醇-氯仿沉淀（用来鉴别是带Mn还是CuZn）（不知道会不会有另外两种抗氧化剂干扰）——透析（去离子电泳用）乙醇-氯仿的浓度比酶的保存问题：测一下大宝pH应该可以作为参考，但是这个酶种类太多了，要点就是pH至少不能小于6，关于最适合pH是否也要测量？还是说我们是为了测量大宝里面SOD的活性所以就按照大宝的pH保存。
还有一个小小的想法就是。
这部分是1次做完还是两次做完？EDTA二钠：几乎不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值约为5.3。
用于络合金属离子和分离金属。
干扰物，但是没有氧化性三、实验步骤：（1）SOD提取：取大宝sod蜜加入15mL的PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。
(留出1mL备用，准确量取剩余上清液体积，记录)（2）除杂蛋白：提取液加入1/4体积的氯仿-乙醇混合液搅拌10min，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。
超氧化物歧化酶(SOD)活力测定
胞外抗氧化酶类酶活力的测定
原理:在碱性条件下,邻苯三酚发生自氧化反应,并产生O2-,在SOD存在下,自氧化反应受到抑制。
参考邻苯三酚测活法(Marklund 法)孙 [66]，按下表加入0.1M Tris-HCl（PH 8.0,内含1mM EDTA）和ddH2O，25℃恒温水浴20 min，加入1 mL 待测液后加入25℃预热的邻苯三酚溶液，摇匀，立即于320nm测吸光值A320，每0.5 min测定一次，持续测到5 min。
邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活力
酶活力的定义为：温度25 ℃，pH 8.0，波长320 nm处，在每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50％的酶量为1个酶活力单位，酶活力按下式计算。
单位菌体SOD酶活力（U/g）=
1
-
50%
A A
V N V A
V W
∆∆
⨯⨯⨯∆
⨯⨯
邻菌
邻
A∆
邻:1分钟邻苯三酚自氧化时A320的变化量；A∆
菌：加入待测液后1分钟邻苯三酚氧化
时A320的变化量；V：待测液总体积；N：待测液稀释倍数；V0：加入的待测液的体积;W:菌体重；V1：反应总体积。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶是生物体内重要的防御系统，它们通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。
其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是三种主要的抗氧化酶。
测定这些酶的活性对于评估生物体的抗氧化能力具有重要意义。
本文将介绍几种常用的抗氧化酶活性测定方法。
1. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法SOD是一种能够催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）的酶。
常用的SOD活性测定方法包括：氮蓝四唑（NBT）法：利用NBT在超氧阴离子自由基存在下被还原成蓝色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算SOD活性。
羟胺法：利用羟胺与超氧阴离子自由基反应硝酸盐，通过测定硝酸盐的量来计算SOD活性。
2. 过氧化物酶（POD）活性测定方法POD是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的POD活性测定方法包括：愈创木酚法：利用愈创木酚在过氧化物酶存在下被氧化红色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
邻苯三酚法：利用邻苯三酚在过氧化物酶存在下被氧化紫色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
3. 过氧化氢酶（CAT）活性测定方法CAT是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的CAT活性测定方法包括：紫外分光光度法：利用过氧化氢在紫外光下具有吸收的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算CAT活性。
酶偶联法：利用过氧化氢在过氧化物酶存在下被氧化水的特性，通过测定水的量来计算CAT活性。
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定的实验步骤与注意事项实验步骤1. 样品准备提取酶：根据实验目的，选择合适的组织或细胞提取酶。
常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、TrisHCl缓冲液等。
离心：将提取液离心，分离上清液和沉淀物。
上清液中含有目标酶，沉淀物则含有杂质。
蛋白质定量：使用 Bradford 法或 Lowry 法等蛋白质定量方法测定上清液中的蛋白质浓度。
邻苯三酚法测定3种食用菌超氧化物歧化酶_SOD_活性_张中林
185第11卷 第5期 2009 年 5 月辽宁中医药大学学报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol. 11 No. 5 May，2009邻苯三酚法测定3种食用菌超氧化物歧化酶（SOD）活性张中林1，孙宏伟2，郑剑玲1，李 岩1，王美惠1，段 薇1（1.辽宁中医药大学职业技术学院，辽宁 沈阳 110101；2.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032）摘 要：目的：比较3种食用菌中超氧化物歧化酶（SOD）活性。
方法：选取辽宁省农科院食用真菌研究所提供的3种鲜菌菇，采用邻苯三酚法对食用菌进行SOD 活性的测定。
结果：3种食用菌中SOD 酶活性均为阳性。
结论：3种食用菌SOD 酶活性依次递增顺序为鲜金针菇、滑子菇、草菇。
关键词：超氧化物歧化酶；邻苯三酚；食用菌中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1673-842X (2009)05- 0185- 02Determination of the Superoxide Dismutase in Three Typesof Edible Fungi by Hepatocyes Autoxidation ZHANG Zhong-lin 1, SUN Hong-wei 2，ZHENG Jian-ling 1, LI Yan 1，WANG Mei-hui 1，DUAN Wei 1（1.Vocational and Technical Education College of Liaoning University of TraditionalChinese Medicine ,Shenyang 110101, Liaoning,China；2. Liaoning University ofTraditional Chinese Medicine，Shenyang 110032, Liaoning, China）Abstract：Objective :To compare the superoxide dismutase （SOD ）activities of the three types of edible fungi. Methods : Fresh edible fungi were chosen from edible fungi institute liaoning academy of agricutural sciences. The SOD activities were determined by hepatocytes autoxidation. Results : It was showed that SOD activities were fond in three types of edible fungi. Conclusion : The SOD activities increases by a golden needle mushroom, pear mushroom, straw mushroom.Key words：SOD; Hepatocytes Autoxidation ; Edible Fungi 收稿日期：2008-12-02作者简介：张中林 (1963-) ，女，辽宁沈阳人，实验师，学士，主要从事免疫生化工作。
邻苯三酚自氧化法测定SOD活性中测定波长的选择
3经验交流3邻苯三酚自氧化法测定SOD活性中测定波长的选择孙雪奇,陈齐英,别小琳(四川省药品检验所,四川成都610034)提要:用岛津UV-240型、260型和T-1901紫外可见分光光度计进行实验,确定邻苯三酚自氧化法测定S OD活性的最适波长非文献使用的420nm和325nm,而应为320nm。
关键词:邻苯三酚自氧化法;S OD活性;波长中图分类号:R917文献标识码:B文章编号:1006-0103(2004)05-0404-02 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,S OD)为体内自由基的清除剂,在生物体的正常代谢中起重要作用,其活性测定常用邻苯三酚自氧化法[1]。
该方法主要是通过测定邻苯三酚自氧化前4min内, S OD对自氧化初始中间产物增加的抑制作用来测定S OD活性。
文献报道的测定波长主要有420nm[1]和325nm[2]。
为探讨初始中间产物的吸收峰位置,进而确定测定波长,特对此进行了研究。
1 实验部分111 仪器与试剂 UV-260和UV-240紫外可见分光光度计(日本岛津公司);T-1901紫外可见分光光度计(上海科学仪器厂)。
试剂均为国产分析纯。
112 方法 吸取4.5ml100mm ol・L-1的T ris-HCl缓冲液(pH812)和4146ml蒸馏水,混匀后置25℃水浴中20min,立即加入在25℃预热的30mm ol・L-1邻苯三酚40μl(10mm ol・L-1的HCl溶液配制),立即混匀,迅速倒入比色池中,以10mm ol・L-1的HCl溶液为空白,分别用上述3种型号的紫外可见分光光度计测定邻苯三酚自氧化中间产物的吸光度。
113 结果 UV-240紫外可见分光光度计测定可知,邻苯三酚自氧化初始中间产物的吸收峰在320～319nm 处。
T-1901和UV-260紫外可见分光光度计两种仪器测得的λmax均出现在320nm波长处,此时在420nm处吸光度还很小,到5min时吸光度<011,可见420nm处吸光度的变化不能反映中间产物的积累,因此,用420nm进行S OD酶活性测定是不正确的。
邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶的活性
超氧化物歧化酶（SOD）的活性测定——邻苯三酚自氧化法一、实验原理本实验采用邻苯三酚自氧化法测定SOD的活力。
邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出超氧阴离子O2-，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。
这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长出有强烈光吸收。
当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。
酶活力单位定义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。
该法所用试剂和仪器比较普通，测试方便，灵敏度高，是目前应用最广泛的一种测试方法，但对温度、PH、邻苯三酚浓度、SOD待测液存放时间等诸因素比较敏感，因此测定时严格控制这些因素。
二、试剂和器材1、试剂（1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用双蒸水溶解至80mL 左右，用HCl调节pH =8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。
（2）10mmol/L HCl（3）50 mmol/L邻苯三酚称取邻苯三酚(A.R)0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。
（4）SOD样液2、器材（1）恒温水浴槽（2）紫外分光光度计（3）试管、刻度吸管、微量注射器三、方法和步骤1、邻苯三酚自氧化速率的测定取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s 读数一次，测定4min 内每分钟光吸收值的变化。
改良后的邻苯三酚自氧化法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性
改良后的邻苯三酚自氧化法A.1试剂的制配A.1.1A液：pH8.200.1mol/l三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸缓冲溶液（内含1mmol/L EDTA·2Na）。
称取1.2114g Tris和37.2mg EDTA·2Na溶于62.4ml0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100ml。
A.1.2B液：4.5mmol/l邻苯三酚盐酸溶液。
称取邻苯三酚（A.R）56.7mg溶于少量10mmol/L盐酸溶液，待邻苯三酚完全溶解后，用10mmol/L盐酸溶液定容至100ml。
A.1.310mmol/l盐酸溶液。
A.1.4供试品溶液：取1ml于500ml容量瓶中，用蒸馏水定容到500ml。
即得供试液。
A.1.5蒸馏水：双重石英蒸馏水。
A.2仪器紫外-可见分光光度仪，精密酸度计（精密度0.01pH），试管数支，100μl移液枪，1000μl移液枪，10ml移液枪。
A.3方法A.3.1调零在25℃左右，取2支试管，分别依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.15ml；在325nm波长条件下，调零。
A.3.2邻苯三酚自氧化速率测定△A325在25℃，取2支试管（A管和B管），A 管中依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.00ml；B管中分别加入B液0.15ml，把A管倒入B管中，迅速摇匀，倾入比色皿，以A液2.35ml+蒸馏水2.15ml作为空白对照，在325nm波长下每隔30s记录一次A值，共测6次，要求自氧化速率控制在0.060（±0.003）OD/min。
A.3.3酶活测定在25℃，在试管中加入A液2.35ml，蒸馏水1.8ml，在25℃的水浴中预热5min,然后加入Vml的样液，再加入0.15mlB液，迅速摇匀，倾入比色皿，以A液2.35ml+蒸馏水2.15ml作为空白对照，在325nm波长下每隔30s 记录一次A值，共测6次。
在此条件下，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率50%的酶量定为1个活力单位，即△A′325=1/2△A325。
邻苯三酚自氧化法简易操作图解-测量SOD活性方法
邻苯三酚自氧化法简易操作图解-测量SOD活性方法连苯三酚自氧化法测定·O2-自由基的清除能力简介（适用于：SOD及各种抗氧化剂）文献来源[1] Xican Li. Improved Pyrogallol Autoxidation Method: A Reliable and Cheap Superoxide-scavenging Assay Suitable for All Antioxidants. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60:6418-6424.操作图解具体方法1 溶液配制1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。
1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。
1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA）40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mgNa2EDTA，混合，稀释到80 mL。
用pH计测量，pH应为7.4。
用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。
（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。
1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中）取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。
再往里加连苯三酚14.6 mg (M。
W.126.1 )，即得。
（当天有效,以上为1个样品的用量）。
2 测试液2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。
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邻苯三酚法测定SOD酶活—修改的Marklund方法
1、本方法检出限1.17U/ml.
2、定义：25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%时所需要的SOD酶量为一个酶活力单位。
3、原理：在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化生成红橘酚，同时生成O2-，连苯三酚的
自氧化速率与O2-的浓度有关。
SOD能催化O2-发生歧化反应生成H2O2和O2，从而抑制连苯三酚的自氧化。
样品对连苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映样品中的SOD的含量。
4、试剂
4.1 A液：pH 8.20、0.1 mol/l Tris-HCl缓冲溶液（内含1 mmol/L Na2EDTA）。
称取1.2114 g Tris 和37.2 mg Na2EDTA溶于62.4 ml的0.1 mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100 ml。
4.2 B液：4.5 mmol/L邻苯三酚盐酸溶液。
称取邻苯三酚（A.R）56.7 mg 溶于少量10 mmol/l 盐酸溶液，并定容至100 ml。
4.3 10 mmol/l 盐酸溶液。
4.4 0.200 mg/ml 超氧化物歧化酶。
4.5 蒸馏水。
5、样品制备样品测定前需离心，取上清液测定。
6、分析步骤
6.1 邻苯三酚自氧化速率测定：在25℃左右，于10ml比色管中依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.00ml，B液0.15ml，加入B液立即混合并倾入比色皿，分别测定在325nm波长条件下初始时和1min后吸光值，二者之差即邻苯三酚自氧化速率△A325（min-1），本实验确定△A325（min-1）为0.060。
6.2 样液和SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率测定按以上步骤分别加入一定量样液或酶液使抑制率约为1/2 △A325（min-1），即△A’325（min-1）为0.030。
SOD活性测定加样程序见表1。
表1 SOD活性测定加样表
试液空白样液SOD液
A液/ml 2.35 2.35 2.35
蒸馏水/ml 2.00 1.80 1.80
样液或SOD液/μl200μl200μl B液/ml0.150.150.15
7、结果
式中：U/ml——SOD酶活力单位；
△A325——邻苯三酚自氧化速率；
△A’325——样液或SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率；
V——所加酶液或样液体积，单位为毫升（mL）；
D——酶液或样液的稀释倍数；
4.5——反应液总体积，单位为毫升（mL）。
计算结果保留三位有效数字。
8、精确性
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。