蛋白质免疫印迹技术及常见问题
免疫印迹实验注意事项
免疫印迹实验注意事项一、实验概述免疫印迹（Western blot）是一种重要的蛋白质检测技术，在生物医学研究中被广泛应用。
该实验通过将蛋白质样品经电泳分离，并将其转移到膜上，最终使用特异性抗体探测目标蛋白质。
然而，为了确保实验结果的准确性和可靠性，实验过程中需要注意以下事项。
二、实验仪器和试剂准备在进行免疫印迹实验之前，需要准备合适的仪器和试剂。
以下是一些注意事项：1. 仪器准备•确保电泳仪、转印仪和成像仪等仪器的功能正常，并进行必要的校准和测试。
•清洁仪器，避免污染和干扰实验结果。
2. 试剂准备•使用优质的试剂，并根据说明书正确配制试剂溶液。
•为避免批次差异，建议每次实验使用同一批试剂。
•试剂保存在适当的温度和条件下，以保证其稳定性。
3. 溶液准备•使用无菌、纯净的水和试剂配制实验所需的溶液。
•确保溶液的 pH 值正确，并进行必要的调整。
•溶液保存在适当的温度和条件下，避免污染和变质。
三、实验操作注意事项在进行免疫印迹实验时，需要注意以下操作事项：1. 样品处理•样品的制备和处理应严格按照实验要求进行，以确保样品的完整性和稳定性。
•样品处理过程中应尽量避免使用可能影响蛋白质结构和功能的试剂和条件。
2. 蛋白质的电泳分离•样品电泳前，必须对电泳胶进行适当的处理和准备，确保其质量和性能。
•样品电泳条件的选择要考虑样品性质和目标蛋白质的分子量等因素。
•电泳过程中，要严格控制电流和电压，避免产生异常结果。
3. 转膜过程•使用合适的滤纸和膜材料，并按照正确的方法和条件进行转膜操作。
•转膜时间和电压的选择要根据蛋白质的分子量和转膜效率进行调整。
4. 抗体探测和成像•使用具有较高亲和力和特异性的抗体进行探测，以提高结果的准确性和可靠性。
•抗体的浓度和反应时间应根据需要进行调整，避免产生过度或不足的信号。
•成像过程中，要确保暗室环境的光线充足、胶片或成像仪的参数设置正确。
5. 数据分析和结果解读•在进行数据分析和结果解读时，应使用合适的软件和方法，确保结果的准确性和可靠性。
蛋白质免疫印迹技术
将蛋白质免疫印迹技术与基因测序技术相结合，有助于解析基因表达与蛋白质功能之间的关联，为精准医学和个性化 治疗提供有力支持。
与单细胞测序技术结合
通过将蛋白质免疫印迹技术与单细胞测序技术相结合，可以在单细胞水平上研究蛋白质的表达和功能， 揭示细胞异质性和疾病发生发展机制。
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改进方向
优化样品处理方法 简化样品制备过程，提高处理效 率，降低对实验技能的要求。
提高检测灵敏度和特异性 通过改进技术和方法，提高蛋白 质免疫印迹技术的检测灵敏度和 特异性，进一步减少背景干扰和 假阳性结果。
缩短实验周期 通过改进技术和方法，减少实验 步骤和时间，提高实验效率。
降低成本 寻找更经济实惠的抗体、显影剂 和其他试剂，降低实验成本。
研发自动化、智能化的蛋白质免 疫印迹系统，简化操作流程，减 少人为误差，提高实验效率和准 确性。
定量分析能力
发展蛋白质免疫印迹技术的定量 分析能力，实现蛋白质表达水平 的准确测量，为深入研究生物过 程和疾病机制提供有力支持。
应用领域的拓展
临床诊断
将蛋白质免疫印迹技术应用于临床诊断，为疾病诊断、病情监测和 预后评估提供可靠的蛋白质标志物检测手段。
转膜
选择合适的转移膜
根据实验需求，选择适当的转移 膜，如硝酸纤维素膜或聚偏二氟
乙烯膜。
预处理转移膜
将转移膜在缓冲液中浸泡，使其充 分湿润。
转膜
将凝胶上的蛋白质条带转移到预处 理的转移膜上，完成转膜过程。
抗体孵育与显色
01
一抗孵育
将特异性抗体与转印到膜上的蛋 白质进行孵育，使抗体与目标蛋 白质结合。
原理
基于抗原-抗体反应的特异性，通过将蛋白质样品电泳分离后转印至固相支持物 上，再与特异性抗体进行反应，通过显色反应检测目标蛋白质的存在、表达量 及修饰状态等信息。
蛋白Western blot电泳——试验中常见问题及解答
蛋白质电泳与western blot1Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术。
（1）原理（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色（3）主要试剂（4）主要程序（5）实验常见的问题指南 1. 参考书推荐 2. 针对样品的常见问题 3. 抗体 4. 滤纸、胶和膜的问题 5. Marker 的相关疑问 6. 染色的选择7. 参照的疑问8. 缓冲液配方的常见问题 9. 条件的摸索10. 方法的介绍 11. 结果分析（1）原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
（3）主要试剂1、(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
western blotting(蛋白免疫印迹)
7
蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分
子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开 二硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解 聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结 合形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。 ③ 蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量 ，而与其形状及所带电荷的性质无关。
电泳缓冲液：pH8.3 Tris- 甘氨酸系统
12
PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，简称PAG): 单体 丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 交联剂 N,N-甲叉双丙烯酰胺 加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED) 催化剂 过硫酸铵 三维网状结构的凝胶，该凝胶化学惰性强，具有 一定的机械强度和透明度，是良好的电泳介质， 以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电 泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称 PAGE)。
对 策
5. 抗体浓度过高
35
Thanks！
36
压太高。转膜过程注意降温
34
四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 2. 3. 4. 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉 反应
1. 转膜前用100%甲醇将膜完 全浸湿 2. 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 3. 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 4. 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
蛋白质免疫印迹技术详解
1
主要内容
一、Western Blot 简介 二、Western Blot 一般流程
WB实验常见问题与解决方案讲座
含SDS 不含SDS
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
一抗的种属来源： 一般市面上主要的一抗来源是鼠和兔，一抗的选择 应与你现有的二抗相匹配，例如：
如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选 ，
抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）； 如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体或者兔 单抗，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
一抗属于哪个类或亚类：
针对单克隆抗体，除了要与一抗的种属来源相一致，二抗还需 与一抗的类别或亚类相匹配。
单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述， 如果您的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM抗体。如果 单克隆一抗是小鼠 IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么 几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者您也可选择专门针对这一亚类 的二抗，例如，如果您的一抗是小鼠IgG1，那么您可以选择抗IgG1的二抗 ，此种抗体在双标记实验中尤其适合。
抑制剂名称
作用
PMSF
抑制丝氨酸蛋白酶
EDTA
抑制金属蛋白水解酶
Cocktail(蛋白酶抑 根据混合物的成为不同，抑制各种蛋白酶的作用 制剂混合物) （一般包括PMSF ，EDTA ，胃蛋白酶抑制剂 ， 亮抑蛋白肽酶 等蛋白酶抑制剂混合物）
Na3VO4
激活的矾酸钠具有抑制去磷酸化的作用
（原矾酸钠）
NaF （氟化钠）
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
抗体的交叉反应： 交叉反应：有时一种抗体可以与分子结构并不完全相同 但具有类似抗原决定簇的不同抗原起反应。
例如：你想做人和大鼠的实验，那么就希望买的抗 体可以同时针对人和大鼠，相反如果有人只做一个种属 的试验，那么可能就希望抗体的特异性更高点，那么就 和其他种属的交叉反应越少越好
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
western blot实验技术及常见问题探讨-珍藏版
6 反应显色
•辣根过氧化物酶法（HRP）
•碱性磷酸酶法（AP）
•化学发光显色法(HRP)
A液
B液
ECL工作 混合 液
暗室操作！
1
:
1
膜
在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶 或辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶可以将无色的 底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(BCIP)转化为蓝色的 产物；而辣根过氧化物酶可以以H2O2为底物， 将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯 萘酚氧化成蓝色产物。
膜的选择：
最常用于Western Blot的转移膜主要是 硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚 偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维 素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似, 主要用于核酸杂交。
几种膜的对比
3
目的蛋白 与其它蛋白 的互作
2
目的蛋 白的表达 量分析
4
二 Western Blot技术流程
蛋白样品的制备
•SDS-PAGE •转膜
•封闭
•一抗杂交
•二抗杂交 •底物显色
1.蛋白样品的制备
通过水溶法或有机溶剂制备总蛋白
水溶液提取法
针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白
质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性
一般封闭条件为：室温或者 37℃缓慢摇荡 1～2h，特殊情况也可 4℃过夜，根据结果情况 调整封闭试剂的浓度和类型。比如有时 BSA 比 脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗 体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背 景。封闭完成后要进行洗膜，以去除膜上未结合 的封闭试剂。洗涤液使用TBST 或者PBST。
蛋白质印迹技术及实验中常见问题分析
Western blot ：
➢ 把电泳分离的蛋白质转移到固定膜上，并用抗原抗 体反应进行特异性目的蛋白的检测的过程。
➢ 是集电泳、转印和免疫标记为一体的蛋白质分离检 测技术,结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定 的特异敏感等特点，可检测到低至1～5ng（最低可 到10－100pg）的靶蛋白。
Western blot ：
在待分离蛋白质稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互 作用的缓冲液都可以使用。常见的凝胶电泳缓冲液有两 种： Tris-甘氨酸：分离范围宽，可用于分离分子量
•快速5～15分钟， 颜色稳定； •深浅随不同蛋白质 变化; •标准曲线有轻微的 非线性
•较快40分钟内， •抗干扰能力强
二.SDS-PAGE电泳
SDS-PAGE电泳，是在PAGE系统中引进SDS（十二烷基硫 酸钠）
同时电泳系统中存在强还原剂（DTT或β-巯基乙醇）能使半 胱氨酸之间的二硫键断裂，使得ＳＤＳ-ＰＡＧＥ的电泳中 的蛋白处于完全变性状态
概论
Sout概her论n blot
The Southern blot is used for DNA analysis and was routinely used for genetic fingerprinting and paternity testing prior to the development of microsatellite markers for this purpose.
考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合呈蓝 色，在波长595nm 吸收峰，在一定的 范围内与蛋白质的 含量呈线性关系
高 （约1～5μg/ml）,
BCA法基于双缩脲 很高 原理，碱性条件下 （0.5-20μg/ml ） 蛋白质将Cu2+还原 成 Cu+ ，BCA螯合 Cu1+ 作为显色剂， 产生兰紫色并在 562 nm有吸收峰
蛋白质免疫印迹技术常见问题分析 (1)
常见问题分析一.无信号一抗和二抗不匹配：二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。
没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白：使用高浓度抗体。
4 °C 延长孵育时间（如过夜）。
封闭剂与一抗或二抗有交叉反应：使用温和的去污剂如吐温-20，或更换封闭剂（常用的脱脂奶粉、BSA、血清或明胶）。
一抗不识别待检物种的蛋白：参照说明书，比对免疫原序列和蛋白序列以确保抗体和目的蛋白会发生反应，设置阳性对照。
蛋白上样量不足：每条泳道蛋白上样量不低于20μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照。
组织中目的蛋白含量低：浓缩使信号最大化。
转膜不充分：使用可逆染色剂如丽春红检测转膜效果，检查转膜操作是否正确。
PVDF 膜需预先浸在甲醇中，然后浸到转移缓冲液中。
洗膜过度：勿过度洗膜。
过度封闭使目标蛋白不能显色：使用0.5% 奶粉或无奶粉代替5% 奶粉的抗体稀释液，或更换封闭剂，减少封闭时间。
一抗失效：使用新鲜抗体，重复使用有效浓度会降低。
二抗受叠氮钠抑制：避免叠氮钠和HRP 标记抗体一起使用。
检测试剂盒过期和底物失活：使用新鲜的底物。
二．背景高未进行非特异性封闭或封闭不充分：延长封闭时间，考虑更换合适的封闭剂。
一抗浓度过高：稀释抗体至合适浓度，以更高稀释度抗体延长孵育时间（耗时长但特异性结合最好）。
二抗与封闭剂非特异性结合或反应：设置二抗对照（不加一抗）。
未结合蛋白质洗涤不充分：增加洗涤次数。
选膜不当产生的高背景：硝酸纤维素膜比PVDF 膜背景低。
膜干燥：在孵育过程中防止膜变干，每一步都要保证膜有充分的反应液，可放入搅拌子不断搅动或轻轻振荡使膜浸在溶液里。
三．多带现象细胞传代次数过多，蛋白表达不同：使用原始未传代的细胞株，和现在的细胞株一起做平行对照实验。
体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等：参考文献，使用试剂使样品去磷酸化、去糖基化来证明翻译后的修饰。
蛋白样本降解（蛋白质分子量降低）：在样品缓冲液中加入足够的蛋白酶抑制剂。
Western Blot 的原理,流程及常见问题分析
Blocking Buffer ：3%BSA
5% Milk Room Temperature 1 h
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步骤六、抗体孵育
一抗的选择 ：
确定所研究的目的蛋白，根据目的蛋白名称查询相关抗体。
抗体所检测的种属：人、小鼠、大鼠等
注意：抗体的稀释倍数是由底物和目的蛋白质的丰度决定的， 为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行预实验，以确定具体的实验参数.
2层滤纸
垫片 黑色夹板（负极）
12
56mA /膜 1h
转膜后确认
丽春红 • 可逆染色，检测转膜效率。 • 与下游WB检测完全兼容，无任何干扰。 蛋白预染Marker • 实时监测
丽春红染色结果
• 分子量参照
• 与目的蛋白同时转秱至印迹膜上，检测 转膜效率。
对转膜后的凝胶进行考染
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步骤五、封 闭
FITC、Cy2、Dylight488 AMCA
近红外线
Cy5
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步骤七、检测方法
化学发光法：
HRP酶标系统----ECL鲁米诺（Luminol） 特点：无毒害、灵敏度高、速度快； 特异性好、节省抗体、线性宽； 可重新剥离检测。
化学显色法：
酶标系统HRP----TMB和DAB 酶标系统AP-----BCIP和NBT 特点：方便、便宜； 具有一定毒性、灵敏度较低、反应速度慢； 检测后的膜不可重新剥离检测。
上样前煮沸样品 上样量：30-100 μg 蛋白Marker
8
步骤四、转膜
• 膜的选择：
NC、PVDF、尼龙膜
• 转膜方法：
半干转、湿转
3
WB过程中常见问题和处理方法
5、转膜不充分,或洗膜过度
• 使用丽春红S检测转膜效果,PVDF膜需浸透,
需正确的转膜操作,勿过度洗膜
• 6、曝光时间过短
延长曝光时间 更换更灵敏的发光液
背景有白色/黑色斑 1、转膜时有气泡或抗体分布不均 尽量去除气泡,抗体孵育时保持摇动
2、抗体与封闭剂结合 过滤封闭剂
放映结束 感谢各位的批评指导！
3、抗体孵育温度过高 ——4℃孵育
4、二抗非特异性结合 或与封闭剂交叉反应 ——设置二抗对照<不加一抗>,降低二抗浓度 5、洗膜不充分 ——增加洗涤次数,增加洗膜次数
没有阳性条带或很弱
1、一抗、二抗等不匹配
订购试剂时认真选取一抗与组织种属,一抗与 二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体 及底物. 可通过设置内参可以验证二级测系 统的有效性
拖尾 样品溶解不好
• 纹理〔纵向条纹 • 样品中含有不溶性颗粒
• 条带偏斜
电极不平衡或者加样位置偏斜
条带两边扩散 加样量过多
Western blot 结果曝光问题
背景过高且不均匀 1、封闭不充分
——延长封闭时间； ——更换合适的封闭剂〔脱脂奶粉,BSA,血清等
2、一抗浓度过高 ——增加一抗稀释倍数；
i一定要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极 易产生较高的背景
4、封闭
a 脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白 标记的抗体一起使用,因为脱脂奶粉含有糖 蛋白和生物素
b如果封闭剂中含磷酸酶,用磷酸化特异性抗 体分析磷酸化蛋白受到影响,因为磷酸酶与 印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸 化
c检测磷酸化抗体时,不能使用酪蛋白/脱脂奶 粉作为封闭剂
转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的 转移液浸泡 20min；
WesternBlot蛋白免疫印迹原理及常见问题（FAQ）
WesternBlot蛋白免疫印迹原理及常见问题（FAQ）1. Western blot结果中的背景为什么较高?可能的原因及建议1.膜封闭不够——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
2.一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
3.一抗孵育的温度偏高——建议4℃结合过夜。
4.膜在实验过程中干过——实验过程中要注意保持膜的湿润。
5.检测时曝光时间过长——减少曝光时间。
2. Western blot结果中杂带较多可能的原因及建议1.目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。
2.查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
3.目的蛋白有其它剪切本——查阅文献或生物信息学分析可能性。
4.样本处理过程中目的蛋白发生降解——加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
5.上样量过高，太敏感——适当减少上样量。
6.一抗特异性不高——重新选择或制备高特异性的抗体。
7.一抗不纯——纯化抗体8.一抗或者二抗浓度偏高——降低抗体浓度。
3. Western blot结果中无信号或显示信号弱可能的原因及建议1.检测样本不表达目的蛋白——选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。
2.检测样本低表达目的蛋白——提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
3.转移不完全或过转移——可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。
4.抗体不能识别测试种属的相关蛋白——购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
5.一抗孵育时间不足——建议4℃结合过夜。
6.二抗与一抗不匹配——选择针对一抗来源的种属的抗体。
7.洗膜过度——洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。
4. 其它现象：1.膜上多处出现黑点或黑斑——抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。
WB免疫印迹实验常见问题全汇总
【干货收藏贴】WB常见问题精品全集锦做了很久的WB（western blot），走了很多弯路，但是WB想要做好并不难，总结WB实验中可能会遇到的问题，分析可能的原因及对应的解决方案，这就是实验成功的基石。
以下，我们先解决很多技术菌的疑惑，然后再着手汇总实验中常见问题和可能原因分析以及给出建议解决方案。
WB常见问题分析1.为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？原因有很多：a) 细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 细胞中的蛋白质被降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性；c) 抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题；d) 酶降解可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长。
2.我做的蛋白质分子量很小（10KDa），请问怎么做WB？a)可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起，再转移。
其他按步骤即可；b)也可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系。
3.我的目的带很弱，如何加强？a)可以加大抗原上样量，这是最主要的；b)也可以将一抗稀释比例降低；c)还可以延长曝光时间。
4.DAB好还是ECL好？DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECL结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg级抗原。
5.胶片是一片空白，是怎么回事？如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 一抗选择不当二抗失活；e) 二抗失活。
6.磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。
但是不加也可以，大部分时候是不用加的。
7.细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB？一般5×106就足够。
Western Blot常见问题及解决方法
Western Blot（蛋白质印迹）技术是生物医学研究中常用的蛋白质分析技术之一，可以用于检测蛋白质样品中的特定抗原。
然而，在进行Western Blot实验时，可能会遇到一些问题，下面列举了一些常见问题及解决方法：1.电泳条带不清晰或无条带：解决方法：•检查样品质量，确保待检测样品是可用的，无降解或污染。
•调整电泳参数，如电压、电流和时间等，以优化电泳效果。
•更换抗体，确认抗体的特异性，避免非特异性结合。
2.膜上背景过重：解决方法：•在抗体孵育之前，使用封闭剂封闭膜上的非特异性位点，减少抗体非特异性结合。
•减少一抗和二抗的浓度，减轻非特异性结合。
•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和蛋白质。
3.目的蛋白信号弱或无：解决方法：•调整一抗和二抗的浓度，提高特异性结合的信号强度。
•选择更灵敏的显色方法，如化学发光法等。
•在转膜前，优化样品处理，如提取、纯化和浓缩等步骤。
4.非特异性条带：解决方法：•检查抗体特异性，确认抗体的特异性，更换抗体以减少非特异性结合。
•检查样品处理步骤，避免样品中的杂蛋白干扰。
•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和非特异性结合的蛋白质。
5.显影后膜上条带处变为黄色或白色：解决方法：•可能是由于曝光时间过长或显影液浓度过高导致的，可以降低曝光时间和减少显影液浓度来解决问题。
•在膜清洗时使用甲醇或乙醇等有机溶剂，清除膜上的多余抗体和显色剂。
6.条带内无显影的白点：解决方法：•在转膜前检查是否存在气泡，气泡会影响转膜效果和条带形成。
•增加转膜时间和电流，以促进蛋白质的转移。
•检查显影液是否过期或存在质量问题。
7.存在散在小圆斑：解决方法：•这可能是由于封闭液中的杂质颗粒导致的，可以通过过滤封闭液来清除杂质。
•检查一抗和二抗是否含有杂质抗体或存在抗体污染的情况，更换抗体可以解决问题。
•检查显色液是否存在问题，如过期或存在杂质等，更换显色液可以解决问题。
8.条带变形或不均匀：解决方法：•检查电泳胶的质量和制备过程是否存在问题。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项实验方法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸 2 ml；ddH2O118 ml。
蛋白免疫印迹实验注意事项
蛋白免疫印迹实验注意事项
1.标记探针：应选择适当的标记方式，例如荧光标记或酶标记，以确保检测结果的准确性和可靠性。
2.样品制备：应根据实验目的和特点制备样品，取样时遵循标准化程序，例如选择适当的组织，确定样品的种类和数量等。
3.准备蛋白样品：可使用常规离心和浮渣等方法来纯化蛋白质样品。
同时，应使用合适的分离条件，例如SDS-PAGE分离等方法。
4.电泳条件：在进行SDS-PAGE分离时应注意电泳条件、电泳时间和电极的电位等参数。
这些参数应经过适当的优化，以确保蛋白质分离的完整性和稳定性。
5.膜修饰：在进行印迹前，应对PVDF或NC膜进行预处理，以提高其亲水性和蛋白吸附性能，例如使用甲醇或乙醇水溶液进行湿润处理。
6.印迹条件：印迹条件应根据探针和样品的特性进行优化，例如印迹的温度、时间和探针浓度等。
在印迹后，应及时清洗膜以去除多余的标记物。
7.数据分析：印迹结果应准确地获取并进行合理的解释和分析，注意4°C或-20°C保存条件。
8.良好的实验室卫生：应保证实验室的卫生和环境良好，以避免外源性影响实验结果。
同时，应加强实验室安全意识，严格按照实验安全规范进行操作。
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转膜后的封闭
脱脂奶粉
BSA
Western Blot 膜封闭液
（生物试剂公司提供）
把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤 膜面积以0.1ml/cm2的量加入封闭剂，摇床上平缓摇动，于室 温温育1-2小时。倒掉缓冲液，立即加入一抗溶液与滤膜温育。
一抗、二抗孵育
一抗用量也根据0.1ml/cm2来计算，室温1-2小时。 倒掉一抗溶液，用250ml PBS漂洗液滤膜3次，每次 10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，室温温育 1-2小时。
HRP-DAB底物显色试剂 盒免疫组化中的应用
Pro-light HRP 灵敏度检测试验
Pro－Light HRP 化学发光
试剂盒检测结果
TIANGEN BIOTECH（BEIJING）CO., LTD.
Toll-free: 800-810-2177
Western blot常见问题—蛋白转膜效率低
1. 2. 3. 4.
蛋白分子量< 10KD 蛋白的等电点=8 SDS浓度不合适 凝胶太厚
1. 蛋白分子量<10KD时，减 少转膜时间；使用小孔径 的膜 2. 更换高pH值Buffer 3. 在阴极buffer中加入 0.005 - 0.01% SDS 可提 高转膜效率 4. 延长转膜时间
4. 温度合适，受热不均匀导致胶
聚合不均匀 5. 两块玻璃板底部要对齐
Western blot常见问题—SDS-PAGE电泳
1. 条带比正常的窄？ 2. “微笑”或“倒微 笑”条带？
1. 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量 混合均匀，动作轻缓 2. 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小 心，以免把上样带扭曲 3. 样品盐浓度过高会挤压其他条带 导致宽窄不一，纯化样品，调整 盐浓度 4. 胶板底部有气泡会影响电泳效果， 应赶走气泡。同时注意电泳槽装 置是否合适
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度 （％）
线性分离范围 （KD)
15 10 7.5
5.0
12-43 16-68 36-94
57-212
转膜
价格便宜 硝酸纤 维素膜
简单快速封闭非特异性抗体结合
膜的选择
封闭非特异性抗体结合麻烦
尼龙膜
价格昂贵
需要更高的蛋白结合率
（尼龙膜： 480µ g/cm2 ；硝酸纤维素膜：80µ g/cm2 ）
内容概要 Western Blot原理简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析
Western blot常见问题—SDS-PAGE电泳
1. 胶板洗刷干净 2. 加入AP和TEMED的量要合适 1. 胶不平？ 2. 凝胶漏液？ 3. 加入试剂后摇匀，使其充分混 合，防止部分胶块聚合不均匀
1. 制备单克隆抗体或者重新选 取合成抗原多肽的位点 2. 设立不加一抗，只加二抗的 平行对照来检测二抗是否有 非特异结合
参照体系
分子量Marker：确定蛋白条带的分子量 已知量标准产物的正对照 空白载体对照：如果是表达蛋白需要做表达前的 内参：看家基因编码表达的蛋白
TIANGEN产品结构—底物显色液
免疫印迹技术的基础-免疫反应
免疫测定(immunoassay) 利用抗原抗体
反应来测定标本中抗原或抗体的方法 检测对象：具体免疫活性的物质 反应特性：高度的特异性和敏感性
内容概要 Western Blot原理简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析
Western blot常见问题—显色背景高
1. 2. 3. 4.
5.
膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交 叉反应 抗体浓度过高
1. 转膜前用100%甲醇将膜 完全浸湿 2. 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 3. 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 4. 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
Western Blot 原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一 种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western Blot 的应用
目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析
内容概要 Western Blot原理简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析
二抗与底物反应显色
•辣根过氧化物酶法
•碱性磷酸酶法
•化学发光显色法
Anti－His
应用举例：用Western blot检测患者 血清中的HIV病毒抗体
Step1：经电泳将HIV混合抗原按分子量大小分离 Step2：印迹转移已分离的抗原至硝酸纤维膜上，封闭 Step3：加入待检病人血清，漂洗 Step4：加入合适的、标记的二抗（HRP或AP），漂洗 Step5：加入显色底物（或放射自显影），显色检测
Western Blot 流程
转膜 封闭
蛋白样品的制备
一抗杂交
二抗杂交 底物显色
•SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
蛋白样品的制备
通过水溶法或有机溶剂制备总蛋白
水溶液提取法
针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统水 溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶
剂 。系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时， 不再受蛋白质电荷与形状的影响， 而只取决于蛋白质分子量的大小。
凝胶成分
N,N’-亚甲双丙烯酰胺和丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液
TEMED
过硫酸铵
Tris-甘氨酸电泳缓冲液
Western blot常见问题—转膜及抗体检测
1. 凝胶肿胀或卷曲？ 2. 条带歪斜或漂移？ 3. 单个或多个白点？
4. 转膜缓冲液过热？
1. 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓 冲液中浸泡5-10min 2. 电转仪长期使用导致海绵变薄， “三明治”结构不紧凑导致。可 在两块海绵之间垫上少许普通的 纸片 3. 确保膜和胶块之间没有气泡 4. 缓冲液中离子浓度太低，电流或 电压太高。转膜过程注意降温
HRP底物显色液 HRP-DAB底物显色试剂盒 增强型HRP-DAB底物显色试剂盒 沉淀型单组分TMB底物溶液 AP底物显色试剂 BCIP/NBT底物显色试剂盒
可溶型单组分TMB底物溶液
Pro-light HRP 化学发光检测试剂
HRP-DAB底物显色试剂盒应用
HRP-DAB底物显色试剂 盒Western blot中的应用
Western blot常见问题—杂交信号弱
1. 抗体保存不当 2. 抗原不充足 3. 膜的漂洗过度
1. 抗体长期保存应在－70℃， 使用前做效价检测 2. 增加蛋白上样量，做已知标 准量蛋白的对照 3. 减少漂洗的时间和次数
Western blot常见问题—显现非特异性条带
1. 一抗不是唯一特异的 2. 二抗出现非特异结合
特殊要求下的选择 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱
需要更大的机械强度
转膜方法
湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在 转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。
半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓 冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。
转膜后检测
丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。
有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括 乙醇、丙酮和丁醇等。
通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
蛋白样品的定量
Bradford法
考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓
度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结 合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值， 化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。 TIANGEN产品 Bradford蛋白质定量试剂盒