蛋白质免疫印迹技术及常见问题
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有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括 乙醇、丙酮和丁醇等。
通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
蛋白样品的定量
Bradford法
考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓
度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结 合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值， 化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。 TIANGEN产品 Bradford蛋白质定量试剂盒
HRP底物显色液 HRP-DAB底物显色试剂盒 增强型HRP-DAB底物显色试剂盒 沉淀型单组分TMB底物溶液 AP底物显色试剂 BCIP/NBT底物显色试剂盒
可溶型单组分TMB底物溶液
Pro-light HRP 化学发光检测试剂
HRP-DAB底物显色试剂盒应用
HRP-DAB底物显色试剂 盒Western blot中的应用
Western blot常见问题—蛋白转膜效率低
1. 2. 3. 4.
蛋白分子量< 10KD 蛋白的等电点=8 SDS浓度不合适 凝胶太厚
1. 蛋白分子量<10KD时，减 少转膜时间；使用小孔径 的膜 2. 更换高pH值Buffer 3. 在阴极buffer中加入 0.005 - 0.01% SDS 可提 高转膜效率 4. 延长转膜时间
Western Blot 原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一 种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western Blot 的应用
目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析
内容概要 Western Blot原理简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析
1. 制备单克隆抗体或者重新选 取合成抗原多肽的位点 2. 设立不加一抗，只加二抗的 平行对照来检测二抗是否有 非特异结合
参照体系
分子量Marker：确定蛋白条带的分子量 已知量标准产物的正对照 空白载体对照：如果是表达蛋白需要做表达前的 内参：看家基因编码表达的蛋白
TIANGEN产品结构—底物显色液
转膜后的封闭
脱脂奶粉
BSA
Western Blot 膜封闭液
（生物试剂公司提供）
把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤 膜面积以0.1ml/cm2的量加入封闭剂，摇床上平缓摇动，于室 温温育1-2小时。倒掉缓冲液，立即加入一抗溶液与滤膜温育。
一抗、二抗孵育
一抗用量也根据0.1ml/cm2来计算，室温1-2小时。 倒掉一抗溶液，用250ml PBS漂洗液滤膜3次，每次 10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，室温温育 1-2小时。
内容概要 Western Blot原理简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析
Western blot常见问题—SDS-PAGE电泳
1. 胶板洗刷干净 2. 加入AP和TEMED的量要合适 1. 胶不平？ 2. 凝胶漏液？ 3. 加入试剂后摇匀，使其充分混 合，防止部分胶块聚合不均匀
二抗与底物反应显色
•辣根过氧化物酶法
•碱性磷酸酶法
•化学发光显色法
Anti－His
应用举例：用Western blot检测患者 血清中的HIV病毒抗体
Step1：经电泳将HIV混合抗原按分子量大小分离 Step2：印迹转移已分离的抗原至硝酸纤维膜上，封闭 Step3：加入待检病人血清，漂洗 Step4：加入合适的、标记的二抗（HRP或AP），漂洗 Step5：加入显色底物（或放射自显影），显色检测
Western Blot 流程
转膜 封闭
蛋白样品的制备
一抗杂交
二抗杂交 底物显色
•SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
蛋白样品的制备
通过水溶法或有机溶剂制备总蛋白
水溶液提取法
针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统水 溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶
剂 。
Western blot常见问题—杂交信号弱
1. 抗体保存不当 2. 抗原不充足 3. 膜的漂洗过度
1. 抗体长期保存应在－70℃， 使用前做效价检测 2. 增加蛋白上样量，做已知标 准量蛋白的对照 3. 减少漂洗的时间和次数
Western blot常见问题—显现非特异性条带
1. 一抗不是唯一特异的 2. 二抗出现非特异结合
Western blot常见问题—转膜及抗体检测
1. 凝胶肿胀或卷曲？ 2. 条带歪斜或漂移？ 3. 单个或多个白点？
4. 转膜缓冲液过热？
1. 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓 冲液中浸泡5-10min 2. 电转仪长期使用导致海绵变薄， “三明治”结构不紧凑导致。可 在两块海绵之间垫上少许普通的 纸片 3. 确保膜和胶块之间没有气泡 4. 缓冲液中离子浓度太低，电流或 电压太高。转膜过程注意降温
特殊要求下的选择 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱
需要更大的机械强度
转膜方法
湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在 转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。
半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓 冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。
转膜后检测
丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。
4. 温度合适，受热不均匀导致胶
聚合不均匀 5. 两块玻璃板底部要对齐
Western blot常见问题—SDS-PAGE电泳
1. 条带比正常的窄？ 2. “微笑”或“倒微 笑”条带？
1. 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量 混合均匀，动作轻缓 2. 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小 心，以免把上样带扭曲 3. 样品盐浓度过高会挤压其他条带 导致宽窄不一，纯化样品，调整 盐浓度 4. 胶板底部有气泡会影响电泳效果， 应赶走气泡。同时注意电泳槽装 置是否合适
HRP-DAB底物显色试剂 盒免疫组化中的应用
Pro-light HRP 灵敏度检测试验
Pro－Light HRP 化学发光
试剂盒检测结果
TIANGEN BIOTECH（BEIJING）CO., LTD.
Toll-free: 800-810-2177
Western blot常见问题—显色背景高
1. 2. 3. 4.
5.
膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交 叉反应 抗体浓度过高
1. 转膜前用100%甲醇将膜 完全浸湿 2. 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 3. 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 4. 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
不连续的电泳缓冲体系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时， 不再受蛋白质电荷与形状的影响， 而只取决于蛋白质分子量的大小。
百度文库
凝胶成分
N,N’-亚甲双丙烯酰胺和丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液
TEMED
过硫酸铵
Tris-甘氨酸电泳缓冲液
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度 （％）
线性分离范围 （KD)
15 10 7.5
5.0
12-43 16-68 36-94
57-212
转膜
价格便宜 硝酸纤 维素膜
简单快速封闭非特异性抗体结合
膜的选择
封闭非特异性抗体结合麻烦
尼龙膜
价格昂贵
需要更高的蛋白结合率
（尼龙膜： 480µ g/cm2 ；硝酸纤维素膜：80µ g/cm2 ）
免疫印迹技术的基础-免疫反应
免疫测定(immunoassay) 利用抗原抗体
反应来测定标本中抗原或抗体的方法 检测对象：具体免疫活性的物质 反应特性：高度的特异性和敏感性
内容概要 Western Blot原理简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析
通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
蛋白样品的定量
Bradford法
考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓
度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结 合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值， 化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。 TIANGEN产品 Bradford蛋白质定量试剂盒
HRP底物显色液 HRP-DAB底物显色试剂盒 增强型HRP-DAB底物显色试剂盒 沉淀型单组分TMB底物溶液 AP底物显色试剂 BCIP/NBT底物显色试剂盒
可溶型单组分TMB底物溶液
Pro-light HRP 化学发光检测试剂
HRP-DAB底物显色试剂盒应用
HRP-DAB底物显色试剂 盒Western blot中的应用
Western blot常见问题—蛋白转膜效率低
1. 2. 3. 4.
蛋白分子量< 10KD 蛋白的等电点=8 SDS浓度不合适 凝胶太厚
1. 蛋白分子量<10KD时，减 少转膜时间；使用小孔径 的膜 2. 更换高pH值Buffer 3. 在阴极buffer中加入 0.005 - 0.01% SDS 可提 高转膜效率 4. 延长转膜时间
Western Blot 原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一 种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western Blot 的应用
目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析
内容概要 Western Blot原理简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析
1. 制备单克隆抗体或者重新选 取合成抗原多肽的位点 2. 设立不加一抗，只加二抗的 平行对照来检测二抗是否有 非特异结合
参照体系
分子量Marker：确定蛋白条带的分子量 已知量标准产物的正对照 空白载体对照：如果是表达蛋白需要做表达前的 内参：看家基因编码表达的蛋白
TIANGEN产品结构—底物显色液
转膜后的封闭
脱脂奶粉
BSA
Western Blot 膜封闭液
（生物试剂公司提供）
把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤 膜面积以0.1ml/cm2的量加入封闭剂，摇床上平缓摇动，于室 温温育1-2小时。倒掉缓冲液，立即加入一抗溶液与滤膜温育。
一抗、二抗孵育
一抗用量也根据0.1ml/cm2来计算，室温1-2小时。 倒掉一抗溶液，用250ml PBS漂洗液滤膜3次，每次 10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，室温温育 1-2小时。
内容概要 Western Blot原理简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析
Western blot常见问题—SDS-PAGE电泳
1. 胶板洗刷干净 2. 加入AP和TEMED的量要合适 1. 胶不平？ 2. 凝胶漏液？ 3. 加入试剂后摇匀，使其充分混 合，防止部分胶块聚合不均匀
二抗与底物反应显色
•辣根过氧化物酶法
•碱性磷酸酶法
•化学发光显色法
Anti－His
应用举例：用Western blot检测患者 血清中的HIV病毒抗体
Step1：经电泳将HIV混合抗原按分子量大小分离 Step2：印迹转移已分离的抗原至硝酸纤维膜上，封闭 Step3：加入待检病人血清，漂洗 Step4：加入合适的、标记的二抗（HRP或AP），漂洗 Step5：加入显色底物（或放射自显影），显色检测
Western Blot 流程
转膜 封闭
蛋白样品的制备
一抗杂交
二抗杂交 底物显色
•SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
蛋白样品的制备
通过水溶法或有机溶剂制备总蛋白
水溶液提取法
针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统水 溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶
剂 。
Western blot常见问题—杂交信号弱
1. 抗体保存不当 2. 抗原不充足 3. 膜的漂洗过度
1. 抗体长期保存应在－70℃， 使用前做效价检测 2. 增加蛋白上样量，做已知标 准量蛋白的对照 3. 减少漂洗的时间和次数
Western blot常见问题—显现非特异性条带
1. 一抗不是唯一特异的 2. 二抗出现非特异结合
Western blot常见问题—转膜及抗体检测
1. 凝胶肿胀或卷曲？ 2. 条带歪斜或漂移？ 3. 单个或多个白点？
4. 转膜缓冲液过热？
1. 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓 冲液中浸泡5-10min 2. 电转仪长期使用导致海绵变薄， “三明治”结构不紧凑导致。可 在两块海绵之间垫上少许普通的 纸片 3. 确保膜和胶块之间没有气泡 4. 缓冲液中离子浓度太低，电流或 电压太高。转膜过程注意降温
特殊要求下的选择 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱
需要更大的机械强度
转膜方法
湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在 转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。
半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓 冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。
转膜后检测
丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。
4. 温度合适，受热不均匀导致胶
聚合不均匀 5. 两块玻璃板底部要对齐
Western blot常见问题—SDS-PAGE电泳
1. 条带比正常的窄？ 2. “微笑”或“倒微 笑”条带？
1. 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量 混合均匀，动作轻缓 2. 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小 心，以免把上样带扭曲 3. 样品盐浓度过高会挤压其他条带 导致宽窄不一，纯化样品，调整 盐浓度 4. 胶板底部有气泡会影响电泳效果， 应赶走气泡。同时注意电泳槽装 置是否合适
HRP-DAB底物显色试剂 盒免疫组化中的应用
Pro-light HRP 灵敏度检测试验
Pro－Light HRP 化学发光
试剂盒检测结果
TIANGEN BIOTECH（BEIJING）CO., LTD.
Toll-free: 800-810-2177
Western blot常见问题—显色背景高
1. 2. 3. 4.
5.
膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交 叉反应 抗体浓度过高
1. 转膜前用100%甲醇将膜 完全浸湿 2. 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 3. 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 4. 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
不连续的电泳缓冲体系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时， 不再受蛋白质电荷与形状的影响， 而只取决于蛋白质分子量的大小。
百度文库
凝胶成分
N,N’-亚甲双丙烯酰胺和丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液
TEMED
过硫酸铵
Tris-甘氨酸电泳缓冲液
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度 （％）
线性分离范围 （KD)
15 10 7.5
5.0
12-43 16-68 36-94
57-212
转膜
价格便宜 硝酸纤 维素膜
简单快速封闭非特异性抗体结合
膜的选择
封闭非特异性抗体结合麻烦
尼龙膜
价格昂贵
需要更高的蛋白结合率
（尼龙膜： 480µ g/cm2 ；硝酸纤维素膜：80µ g/cm2 ）
免疫印迹技术的基础-免疫反应
免疫测定(immunoassay) 利用抗原抗体
反应来测定标本中抗原或抗体的方法 检测对象：具体免疫活性的物质 反应特性：高度的特异性和敏感性
内容概要 Western Blot原理简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析