细胞复苏与冻存
实验十一、细胞的冻存与复苏
实验十一、细胞的冻存与复苏细胞的冻存与复苏是一种有效的保存和传播生物样品的方法。
该方法可以通过冷冻和贮存，将生物样品保存到未来任意时候使用。
本实验将介绍细胞的冻存和复苏实验步骤及注意事项。
实验步骤：1. 细胞的收集和分装首先，需要使用无菌采集工具收集待冻存细胞，如细胞培养板上的细胞。
然后，将细胞分装到无菌冷冻管中。
注意，每个冷冻管中应该放入适量的细胞，并确保其密封性。
2. 冷冻将装有细胞的冷冻管放入无菌水浴中，降温至-80℃或更低温度。
然后，将冷冻管转移到液氮罐中，进行长期保存。
3. 冻存的解除和复苏在复苏前，需要进行以下步骤：① 快速去除细胞上的冷冻剂：将冷冻管直接转移到37℃预热好的培养基中，震荡或轻轻地摇晃，使其中的冷冻剂快速融化。
② 细胞生长：将冻存细胞转移到新的培养板中，并添加适量的培养基。
然后将培养板放入培养箱中，进行细胞的生长。
注意事项：1. 冷冻剂的熟练使用DMSO是一种常用的冷冻剂，其作用是帮助细胞避免冷冻伤害。
然而，DMSO也具有一定的毒性。
因此，在使用过程中，需要注意浓度的控制以及操作时的保护措施。
2. 细胞处理的无菌性细胞的无菌性是决定细胞冻存和复苏成功的关键。
在操作期间，需要保持实验环境的无菌性，并避免细胞样品受到污染。
3. 冷冻剂和液氮的注意事项冷冻剂和液氮是极冷的物质，具有很强的腐蚀性和危险性。
在操作过程中，需要戴上手套和护目镜等防护器具，避免皮肤接触。
同时，要注意放置位置，避免冷冻剂和液氮的泄漏。
总结：细胞的冻存和复苏是一种非常有用并且实践的实验方法。
如果正确操作和保护，可以保证样品的保存和传播，并且为后续的实验提供便利。
细胞冻存和复苏的概念
细胞冻存和复苏的概念嘿，朋友们！今天咱来聊聊细胞冻存和复苏这个神奇的事儿。
你说细胞冻存啊，就好像是给细胞们安排了一场冬眠！想象一下，冬天到了，好多小动物都找个暖和地方睡大觉去了，等春天来了再出来活动。
细胞冻存也差不多是这个道理呀！我们把细胞小心翼翼地保存起来，让它们在低温的环境里安静地待着，等到需要的时候再把它们唤醒。
那怎么冻存呢？这可不是随随便便把细胞扔到冰箱里就行的哦！这可是个技术活儿。
得先给细胞准备好合适的“小窝”，也就是冻存液，这就像是给它们盖了一层厚厚的棉被，保护它们不受伤害。
然后呢，慢慢地把温度降下来，让细胞舒舒服服地进入“睡眠”状态。
等过了一段时间，需要这些细胞发挥作用了，那就得让它们复苏啦！这就像是春天来了，小动物们揉揉眼睛，伸伸懒腰，开始新的生活。
复苏也不简单呢，得掌握好温度和时间，不能太着急，也不能太慢了。
要是不小心出了差错，那细胞可能就醒不过来了，或者醒来也没精神啦！细胞冻存和复苏的好处可多啦！比如说，有些珍贵的细胞，我们可以把它们好好保存起来，以后随时都能用。
就像你有个宝贝，放在一个安全的地方，啥时候想用了就拿出来。
再比如说，在医学研究里，我们可以把一些细胞保存起来，以后用来做实验，这样就能不断地探索新的发现啦！你想想，要是没有细胞冻存和复苏技术，那得有多少宝贵的细胞资源被浪费呀！这就好比你有一堆好吃的，要是不放进冰箱里，那不就都坏了嘛！所以说呀，这个技术可太重要啦！咱平时生活中可能不太能直接用到这个技术，但它在很多领域都发挥着巨大的作用呢！像医学、生物学，都离不开它。
它就像是一个幕后英雄，默默地为科学进步做贡献。
总之呢，细胞冻存和复苏是个很神奇又很有用的技术。
它让我们能更好地利用细胞资源，为人类的健康和科学研究提供了有力的支持。
咱可得好好感谢那些研究出这个技术的科学家们，是他们让我们的生活变得更美好呀！大家说是不是呀！。
细胞的冻存和复苏实验原理
细胞的冻存和复苏实验原理细胞的冻存和复苏实验主要是为了在需要时能够保存活性细胞，以便以后使用。
此过程主要涉及到细胞的冷冻、保存和复苏等环节。
细胞的冻存过程主要包括细胞培养、准备细胞冻存液、细胞冷冻和冷冻保存。
首先，培养细胞是实验的第一步。
细胞可以来自动物组织、细胞系、细胞株等，根据不同的细胞类型和需要，选取合适的培养基和条件进行细胞培养。
培养基中一般含有营养物质、生长因子、激素等，提供细胞生长所需的基础条件。
接下来，要准备细胞冻存液。
细胞冻存液是用于维持细胞的生命状态和保护细胞免受冻融损伤的溶液。
常用的细胞冻存液成分包括冻存液基础培养基、血清、DMSO(二甲基亚砜)等。
其中，冻存液基础培养基可以提供细胞生长所需的营养物质和生长因子，血清则包含有细胞生长因子、蛋白质、维生素等，可以提供细胞所需的生长因子；DMSO作为一种保护剂，可以降低细胞因冻融过程中的机械损伤。
然后进行细胞的冷冻。
将细胞培养物中的细胞用生长基础培养液洗涤去除残存的细胞培养液和旧的培养基，然后加入适量的细胞冻存液，混匀后分装于冷冻管中，最后将细胞冷冻管放入低温冰箱或液氮罐中。
低温环境下，细胞的代谢活动明显减慢，可以有效降低细胞死亡率。
细胞的冷冻保存是将细胞保存在低温条件下，通常为-80或更低的温度。
在低温下，细胞的代谢活动几乎停止，能够大大延缓细胞的老化和死亡，从而实现长期保存。
冷冻保存期间，细胞内部的水分被DMSO等冻存液成分替代，以防止细胞因冻结而受到损伤。
细胞的复苏是将被冷冻保存的细胞通过逐渐升温，使其从低温环境中恢复到生理温度并重新开始生长的过程。
复苏过程中需要进行一系列的操作，其中最关键的是将细胞从冷冻状态逐渐恢复到室温。
一般情况下，将冷冻管放入37水浴中，然后缓慢将温度逐渐升高。
此外，为了减小细胞受到冻融损伤，可以将细胞冻存液缓慢滴入含有细胞培养基的离心管中，将细胞悬浮液转移到细胞培养器皿中进行培养。
总之，细胞的冻存和复苏实验的主要原理是通过低温环境延缓细胞的代谢活动，同时使用合适的冻存液来保护细胞免受损伤，从而实现细胞的长期保存和生存能力的恢复。
细胞冻存与复苏的基本原则
细胞冻存与复苏的基本原则1. 引言细胞冻存与复苏是一种重要的生物技术，它可以将活体细胞保存在极低温度下，并在需要时重新激活这些细胞。
这项技术在医学、科学研究和生物工程等领域具有广泛的应用前景。
本文将介绍细胞冻存与复苏的基本原则，包括冷冻过程、保护剂的选择、解冻过程以及相关实验技术。
2. 冷冻过程细胞冷冻是将活体细胞从正常生长温度（通常为37摄氏度）迅速降温到极低温度（通常为-196摄氏度）的过程。
这个过程需要严格控制，以避免对细胞造成伤害。
2.1 温度控制在开始冷冻之前，必须确保液氮罐内的温度稳定在-196摄氏度。
为了达到这个目标，可以使用液氮罐内置的温度计进行监测，并通过添加适量的液氮来保持温度稳定。
2.2 冷冻容器的选择为了保护细胞免受冷冻过程中的机械损伤，需要选择合适的冷冻容器。
常见的冷冻容器有液氮罐、干燥冰和低温保存管等。
其中，低温保存管是最常用的容器，因为它可以提供良好的细胞保护效果，并且方便存储和操作。
2.3 冷却速率控制快速降温是细胞冷冻过程中至关重要的一步。
过快或过慢的降温速率都会对细胞造成损伤。
通常情况下，推荐使用缓慢降温法，即将细胞置于预先调整好的液氮罐中，并逐渐将其浸入液氮中。
3. 保护剂的选择在细胞冷冻过程中，添加适量的保护剂可以减少细胞受到的损伤，并提高其存活率。
常用的保护剂包括甘露醇、甘油和DMSO等。
3.1 甘露醇甘露醇是一种具有良好保护细胞功能的保护剂。
它可以通过降低细胞内外渗透压的差异，减少细胞脱水和冰晶形成，从而保护细胞免受冷冻损伤。
3.2 甘油甘油是另一种常用的保护剂，与甘露醇类似，它也可以减少细胞脱水和冰晶形成。
此外，甘油还具有良好的渗透性，可以迅速进入细胞内部，并提供额外的保护作用。
3.3 DMSO二甲基亚砜（DMSO）是一种强效的保护剂。
它可以通过改变细胞膜的流动性和稳定性来保护细胞，并防止冷冻过程中产生的机械损伤。
4. 解冻过程解冻是将经过冷冻保存的细胞重新恢复到正常生长状态的过程。
细胞的冻存及复苏PPT课件
冷冻保存方法
1．非玻璃化冷冻 非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降
温至-70 ℃ ～-80 ℃ ，然后直接投入液氮进行保 存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用 液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至1000C以下，再直接投入液氮保存的方法 该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形 成
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细胞冻存与复苏的关键因素
复苏速率
复苏速率：在细胞复苏时温度升高的速度。复温 速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说， 复温速度越快越好，速度过慢，细胞内往往重新 形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细 胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。
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细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻保护剂
冷冻保护剂：可以保护细胞免受冷冻损伤的物质 分为渗透性和非渗透性两类。 不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。目前一般 多联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。
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细胞冻存与复苏的关键因素
保存温度
冷冻保存温度：能长期保存细胞的超低温度，在 此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但 经过长期保存，在复苏后仍能保持正常的结构和 功能。 液氮温度（-196℃）是 目前最佳的冷冻保存温度。
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冷冻速率：慢冻 复苏速率：快融 冷冻保护剂：渗透性和非渗透性 冷冻保存温度：－196 ℃（液氮）
细胞冻存与复苏
1
细胞的冻存和复苏
1.细胞冻存
细胞冻存与细胞传代保存相比优势在于：一，可以减少 人力、经费投入，减少污染，减少细胞生物学特性变化； 二，有利于保存那些不立即使用的细胞系或者将细胞系 转给其他使用者。
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细胞的冻存和复苏 1.细胞冻存
目前，动物细胞一般保存于液氮（-196℃）。
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细胞冻存和复苏的原则
细胞冻存和复苏的原则细胞冻存和复苏是一种先进的技术，可以将细胞保存在极低温下，并在需要时重新复苏。
它在医学和科学研究领域有着广泛的应用，包括细胞治疗、尸体保存和生物研究等。
然而，细胞冻存和复苏并不是一件简单的事情，它涉及到许多原则和技术。
本文将介绍细胞冻存和复苏的原则和一些常见的方法。
细胞冻存的原则主要包括细胞处理、冷冻保护剂和冷冻过程等。
1.细胞处理：在冻存细胞之前，需要进行适当的处理。
首先，需要确保细胞的纯度和活力。
通常使用细胞培养的方法，将细胞培养至富有生长活力的阶段，然后进行冷冻。
同时，还需要对细胞进行适当的处理，如细胞除膜、固定细胞骨架等，以增加细胞的抵抗力。
2.冷冻保护剂：冷冻保护剂是一种在冷冻过程中起到保护细胞的作用的物质。
常见的冷冻保护剂包括甘油、DMSO（二甲基亚砜）和微生物发酵的液体。
这些保护剂可以减少细胞在冷冻过程中的损伤，防止冰晶的形成，从而保证细胞的完整性和功能。
在添加保护剂时，通常需要控制浓度和时间，以避免对细胞的毒性。
3.冷冻过程：冷冻过程是细胞冻存的核心环节。
一般来说，冷冻过程需要经历冷冻速率的调控、冷冻温度的选择和冷冻存储条件的维护等步骤。
细胞的冷冻速率是决定细胞成活率的一个重要因素，过快或过慢的冷冻速率都会导致细胞死亡。
冷冻温度的选择也非常重要，通常选择深度冷冻，即将细胞冰冻至极低温下，以防止细胞的新陈代谢和生物活动。
冷冻存储条件的维护是确保细胞冷冻的安全和稳定性的关键，包括低温保存、无菌保存和无氧保存等。
细胞复苏的原则主要包括解冻过程和恢复过程等。
1.解冻过程：解冻过程是将冷冻细胞重新回温至正常温度的过程。
在解冻过程中，需要控制解冻速率和解冻温度，以避免细胞的损伤。
解冻速率过快或温度过高都会导致冰晶的形成和细胞的破坏。
因此，解冻过程需要缓慢而温和，可以通过温水浴、离心和悬液稀释等方法进行。
2.恢复过程：细胞在解冻后需要进行恢复过程，以恢复其正常的生理和生化功能。
细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤
细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存方法，用于长期保存细胞并保持其生理活性。
下面将详细介绍细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤。
技术原理：细胞冻存是通过将细胞在低温下快速冷冻，并加入保护剂以减少冷冻引起的细胞损伤，从而降低细胞的新陈代谢活动，保持细胞的生命特性。
具体原理如下：1.冷冻缓慢升温原理：冷冻过程中细胞内水分形成冰晶，容易损伤细胞结构。
为了降低损伤，冷冻时的降温速率应尽量缓慢。
而复苏时，也需要采取缓慢升温的方法，以避免溶解冰晶时造成的细胞破坏。
2.保护剂的添加：在冷冻过程中，加入一定浓度的保护剂能够防止细胞水分快速冻结而形成冰晶，从而减少冷冻引起的细胞膜和细胞器损伤。
一般常用的保护剂有甘露醇、二甘醇和甘油等。
操作步骤：下面将介绍细胞冻存与复苏的具体操作步骤：1.细胞选择与培养：选择要冻存的细胞，并保证细胞处于健康和活跃状态。
采用无菌操作，将细胞培养在适当的培养基中，并严格控制培养条件。
2.细胞冻存液的配制：将适当的冻存液配制好。
一般的冻存液组成包括培养基、胎牛血清/胎儿犊牛血清、20%-50%的甘油或其他保护剂。
保护剂的浓度取决于细胞的类型和耐受性。
3.细胞冻存：将培养好的细胞用冻存液冷冻保存。
首先，用培养基洗涤细胞，去除残留的培养基。
然后，添加冻存液，将细胞悬浮均匀。
最后，将细胞悬液装入标记好的冻存管中，并缓慢冷冻至-80℃或液氮中。
4.细胞复苏：将冷冻的细胞迅速取出，用温暖的手掌加热，迅速溶化冰晶。
将细胞悬液转移到离心管中，并加入预先配制好的培养基。
然后，用离心机离心，除去冻存液或保护剂。
最后，加入适当的培养基，将细胞继续培养。
5.细胞复苏后培养条件的控制：在细胞复苏后的培养过程中，需要严格控制培养条件，包括温度、CO2浓度、培养基成分和营养物质的供给等，以确保细胞能够正常生长和繁殖。
总结：细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存技术，可以长期保存细胞并保持其生理活性。
动物细胞冻存和复苏的原则
动物细胞冻存和复苏的原则动物细胞的冻存和复苏是细胞生物学研究中的重要技术之一。
下面将详细介绍动物细胞冻存和复苏的原则，主要包括以下几个方面：1.冻存前细胞状态在进行细胞冻存之前，首先要确保细胞处于最佳的生长状态。
一般来说，应该选择生长旺盛、形态正常的细胞进行冻存。
此外，为了获得更好的冻存效果，应该尽可能减少细胞的数量，避免细胞之间的相互影响。
2.冻存方法常用的动物细胞冻存方法有慢速冷冻和快速冷冻两种。
其中，慢速冷冻指的是将细胞悬液以较低的降温速率（约1℃/min）缓慢降温至-10℃左右，然后再快速降温至-196℃。
而快速冷冻则是将细胞悬液直接放入-196℃的液氮中。
两种方法均可有效地保存细胞，具体选择应根据实际情况和需要而定。
3.冻存温度动物细胞的冻存温度范围一般在-80℃至-196℃之间。
在这个温度范围内，细胞内的水分和酶活性被有效地抑制，从而避免了细胞的过度代谢和损伤。
常用的冻存容器有液氮罐、杜瓦瓶、干冰等。
4.复苏步骤细胞复苏是冻存细胞的逆过程，主要包括以下步骤：将冻存管从冻存设备中取出，迅速放入37℃水浴中融解；轻轻摇动冻存管，确保细胞完全融解；将融解的细胞悬液洗涤1-2次，以去除其中的DMSO等保护剂；加入新鲜的培养基，将细胞悬液转移至培养瓶中培养基加入；将培养瓶置于培养箱中进行培养，观察细胞生长状态。
5.细胞状态监测在细胞复苏后，应该及时对细胞的生长状态进行监测。
一般来说，可以通过观察细胞的形态、生长速率、细胞活性等方面来评估细胞的状态。
此外，还可以采用流式细胞术、免疫荧光等技术对细胞的特性进行检测和分析。
6.及时传代为了保持细胞的生长状态和稳定性，应该及时对复苏后的细胞进行传代。
传代过程中，应该选择适当的胰酶或EDTA等消化剂对细胞进行消化，控制消化时间，避免对细胞造成过度的损伤。
此外，传代过程中还应注意无菌操作，避免污染。
7.记录管理在进行细胞冻存和复苏过程中，应该建立完整的记录管理体系。
细胞冻存和复苏的基本原则
细胞冻存和复苏的基本原则在科学的世界里，细胞就像我们的好朋友一样，既珍贵又脆弱。
想象一下，如果能把这些小家伙冷冻起来，等到需要的时候再把它们复苏，这简直是个梦吧！不过，冻存和复苏可不是随便一冻一热就能搞定的，今天咱们就来聊聊这背后的基本原则，让你轻松掌握这些小窍门。
1. 冻存的基本原则1.1 冻存前的准备首先，冻存之前可得好好准备。
这就像是出去旅行之前得收拾行李一样。
要确保细胞的健康状态，最好先让它们在适合的环境中“养精蓄锐”，这样才能确保它们的“战斗力”。
对了，培养基可别忘了换，培养环境也要保持稳定，不然细胞可受不了这种折腾，估计连个“自我保护”的机会都没有。
1.2 冻存剂的选择接下来，我们得选好冻存剂。
市面上有各种各样的冻存剂，最常用的就是二甲基亚砜（DMSO）和甘油。
这些东西就像是细胞的“保暖内衣”，能帮助它们抵御严寒。
用冻存剂的时候，记得浓度别太高，太浓了反而对细胞不好。
你想啊，就像喝酒一样，太烈了，谁受得了？所以，适量最重要。
1.3 冻存过程现在，到了最关键的环节，冻存过程。
这个时候，细胞需要缓慢降温，让它们适应冷冻的环境。
通常，咱们会用一个叫“程序化冷冻”的设备，把温度控制得稳稳的，像个温柔的妈妈，慢慢带着宝宝入睡。
记得，细胞在80°C或者液氮环境下存放，一年又一年，它们依然保持着“青春永驻”。
2. 复苏的基本原则2.1 复苏前的准备好了，冻存结束，接下来是复苏。
复苏可得快点，细胞在冰箱里待久了，可是受不了冷的，像是被冻住的小龙虾，急需解救！在复苏前，我们需要准备好复苏的培养基，确保它是温暖的，就像是冬天里的一杯热可可，温暖又舒心。
2.2 复苏过程复苏的时候，要小心翼翼，把冻存的细胞迅速放入37°C的水浴中，快速解冻。
这就像是在冰天雪地里给小家伙们来一场“温泉浴”，让它们感受到春天的气息。
解冻的时间可得掌握好，太长了会让细胞崩溃，太短了又不够，所以就像是调味料，恰到好处才是王道。
细胞冻存及复苏步骤
细胞的复苏步骤1.实验前准备（1）将水浴锅预热至37℃。
（2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
（3）在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2.取出冻存管（1）根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
（2）从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
3.（1）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
（2）约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
4.离心：放入离心机中1000r/min离心4min。
（一般800即可，对于较小细胞可适当增加转速，一般不超过1000r）5.制备细胞悬液（1）吸弃上清液。
（2）向离心管内加入12ml培养液，吹打制成细胞悬液。
6.细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
（依照细胞类型而定）7. 培养贴壁细胞的冻存的步骤准备：从冰箱取出各药品在室温下放置，紫外照射超净台30min，配置5%DMSO的冻存液1.收集各管中培养液与一个大的离心管中，吸取1ml培养液加入已标记的EP管中用于支原体的检测，其余用于终止酶解反应。
2.加入5mlPBS洗卡氏瓶除去血清，防止酶解反应受影响。
注意：要在卡氏瓶的反面加液，防止把细胞冲掉。
加入2ml胰酶，使细胞从瓶壁上脱落下来。
3.酶解完全后迅速加入含血清的培养基终止酶解反应。
4.收集各瓶中的细胞悬液，并计算其体积，取出一部分于EP管中用于计数，计算冻存支数。
5.离心800r每分钟，4min。
在超净台中取出冻存管并做好标记（名称株号冻存人日期）6.去除上清，并用适量（依冻存支数而定，每支1ml）的冻存液使其悬浮，加入冻存管中，每管1ml7.放入冻存盒（标注放入日期有使用次数限制），在-80冰箱中过夜后放入液氮罐并作好记录。
细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项
细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项细胞冻存是指将活体细胞暂时停止其代谢活动，并在低温下保存，以便今后可以复苏和继续进行研究。
这项技术对于维持细胞的长期保存和保护遗传材料非常重要。
步骤：1.细胞培养和准备：选择合适的细胞培养基和培养条件，使细胞处于最佳状态。
2.冻存液制备：制备一种含有细胞生长因子、保护剂（例如DMSO或甘油）以及缓冲剂（例如BSA或EDTA）的冻存液。
3.细胞收集和离心：将培养好的细胞通过离心来收集细胞沉淀。
4.细胞冻存和保存：将收集到的细胞与冻存液混合，将混合液分装到冷冻管中，并在极低温下保存（通常为-80°C或液氮温度）。
复苏：1.细胞溶解和补充：将冷藏的细胞迅速解冻，并将其加入到预先准备好的培养基中。
2.培养和观察：将复苏后的细胞转移到培养皿中，并在适当的条件下培养。
观察细胞的生长和形态变化。
原理：细胞冻存的原理是通过降低细胞内温度来减缓或暂时停止细胞代谢活动。
冷冻液中的保护剂可减少细胞冷冻过程中的冻伤，防止细胞膜的破裂和细胞器的破坏。
细胞冷冻过程中，细胞内的水会形成冰晶，但保护剂的存在可以防止冰晶对细胞结构的破坏。
当细胞需要复苏时，通过迅速解冻并将细胞转移到适当的培养基中，细胞可以恢复其生理功能并继续生长和分裂。
注意事项：1.使用无菌的实验室条件和器具来避免细胞冻存和复苏过程中的污染。
2.选择适当的冻存液和培养基，以确保细胞的最佳保护和生长条件。
3.控制冷冻和解冻速率，过快或过慢的速率都可能对细胞造成伤害。
通常使用准备好的细胞冷冻容器或慢速冷却设备来控制速率。
4.正确选择适合冷冻保存的细胞类型。
不同细胞可能对冷冻敏感性有所差异。
5.注明冷冻细胞的信息，例如细胞类型、冷冻日期、冻存液配方等，以便于后续的管理和查询。
细胞复苏、传代、冻存过程
细胞复苏、传代、冻存过程引言细胞复苏、传代和冻存是细胞实验中常见的操作流程。
细胞复苏指的是从冻存状态下恢复细胞的生长和功能，传代是将细胞进行繁殖，冻存则是将细胞保存在极低温下，以便长期保存和后续使用。
下面将详细讨论这些过程。
细胞复苏 Process of Cell Revival材料和设备•冻存管：包含冻存细胞的管子•暖水槽：设置在37°C的恒温水槽内•柱塞：用于搅动和混合细胞悬液•无菌培养皿•无菌培养基步骤1.将冻存管取出放在暖水槽中，快速融化冰冻细胞。
2.将融化的细胞悬液转移到无菌培养皿中。
3.加入预热的培养基，使细胞悬液与培养基充分混合。
4.将细胞培养皿放入培养箱中，维持37°C的恒温和5% CO2的含氧条件。
5.定期观察细胞的生长情况。
细胞传代 Process of Cell Passage材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•无菌培养基•显微镜•无菌移液器•15ml离心管•离心机步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。
2.用无菌移液器将培养基吹洗细胞，移除老化细胞和细胞碎片。
3.将细胞用预热的无菌培养基均匀混合。
4.用无菌移液器将细胞和培养基移入新的细胞培养皿中。
5.定期检查和记录细胞的生长情况和数量。
冻存细胞 Process of Cell Cryopreservation材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•冻存液：包含细胞冻存所需的成分•冻存管•冷冻容器：用于储存冻存管的液体氮罐•标签：用于标记冻存管步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。
2.用无菌移液器吹洗细胞，并移除老化细胞和细胞碎片。
3.用预热的无菌培养基将细胞均匀混合。
4.将混合的细胞和冻存液按照特定比例混合。
5.将混合液转移至冻存管中，并封闭管盖。
6.标记冻存管上的信息，包括细胞类型、传代数和日期。
7.将冻存管放入冷冻容器中，迅速冷冻至-80°C或更低温度。
细胞的冻存及复苏ppt课件
细胞的冻存和复苏
1.细胞冻存
细胞冻存与细胞传代保存相比优势在于：一，可以减少 人力、经费投入，减少污染，减少细胞生物学特性变化； 二，有利于保存那些不立即使用的细胞系或者将细胞系 转给其他使用者。
要获得好的冻存与复苏效果，必须了解如下几 个问题：冷冻速率、复苏速率、冷冻保护剂，冷 冻保存温度。
在日常生活中，随处都可以看到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻速率
冷冻速率：降温的速度，直接关系到冷冻效果， 对一种细胞进行冷冻保存之前，首先需要测定其 最适冷冻速率，以保证获得最高的冷冻存活率。
在日常生活中，随处都可以看到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
谢谢！
在日常生活中，随处都可以看到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
冷冻速率：慢冻 复苏速率：快融 冷冻保护剂：渗透性和非渗透性 冷冻保存温度：－196 ℃（液氮）
在日常生活中，随处都可以看到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
在日常生活中，随处都可以看到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
细胞冻存与复苏的关键因素 复苏速率
复苏速率：在细胞复苏时温度升高的速度。复温 速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说， 复温速度越快越好，速度过慢，细胞内往往重新 形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细 胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。
细胞复苏、传代、冻存
细胞复苏操作说明（针对冻存细胞）实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，水浴锅 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需复苏的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 从液氮罐中取出冻存管 ，直接浸入 37℃温水中 ，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从 37℃水浴中取出冻存管 ，打开盖子 ，移液枪吸出细胞悬液 ，加到离心管并滴加 5 倍以上完全培养 基并混匀 。
3. 操作离心 ， 调至1000 转/分 ，时长 10 分钟4. 弃去上清液 ，重悬离心管底部细胞沉淀 ，在 T25 培养瓶中加入 5-6ml 完全培养基 ，计数 ，调整细胞 密度，接种培养瓶 ，37℃培养箱静置培养。
5. 次日更换一次培养液，继续培养。
6. 注意：冻存细胞建议三管一起复苏到一个 T25 培养瓶。
细胞传代操作说明（贴壁细胞）实验仪器 ：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，0.25%胰酶 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 细胞于培养箱中 ，愈合度达到 80% ，可进行传代。
2. 按 T25 培养瓶计 ，吸出完全培养基 ，并 PBS 缓冲液轻冲 3 遍 ，添加 0.25%含 EDTA 胰酶 2ml ， 消 化 2min（具体时间视细胞而定） ，后用完全培养基将细胞冲洗下来。
1000r/min 离心 10 min ，弃上清 收集细胞，铺至 2 个 T25 培养瓶中培养，各添加 7ml 完全培养基。
3. 注意： 消化时间不易过长，消化前血清成分务必去除干净，终止消化请用新鲜完全培养基，原瓶培养基不可继续使用（终止消化或传代） 。
细胞传代操作说明（悬浮细胞）实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 细胞于培养箱中，密度达到悬浮细胞传代标准（沉降后可铺满底面），可进行传代。
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤细胞冻存是将细胞保存在极低的温度下，以延缓其新陈代谢过程，从而达到长期保藏的目的。
细胞复苏则是将冻存的细胞重新恢复到正常生活状态的过程。
下面将详细介绍细胞冻存和细胞复苏的方法步骤。
细胞冻存的方法步骤：1.细胞培养：首先，需要获得足够数量和质量的细胞进行冻存。
通过细胞培养技术，将细胞培养在含有适当营养物质的培养基中，使其生长繁殖。
2.细胞分离和检测：将细胞从培养基中分离出来，并进行质量检测，确保细胞的纯度和活力。
3.冻存液的制备：制备适当的冻存液，通常是含有细胞保护剂的冻存液，可以起到保护细胞免受低温伤害的作用。
4.冻存管的准备：准备干净的冻存管，并确保管内没有污染物。
5.细胞冻存：将细胞悬浮液和冻存液混合，将混合液加入冻存管中。
随后，将管子放入冷冻器中，逐渐降低温度，使其达到细胞存活所需的最低温度，通常为液氮温度（-196℃）。
6.冻存管理：冻存后的细胞需要进行管理，包括记录存储位置、维护存档和监测保存条件等。
细胞复苏的方法步骤：1.细胞解冻：将冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的温水中，并轻轻摇晃，以加快冻存液的溶解。
待细胞解冻完成后，立即将细胞转移到含有培养基的离心管中。
2.细胞复苏培养：将细胞悬浮液转移到培养基中，然后放入培养箱中进行培养。
培养基的组成与之前的培养条件相似，以帮助细胞适应新的环境。
3.细胞复苏检测：在细胞复苏后的一段时间内，需要对细胞进行监测和检测，包括细胞存活率、生长状况、形态特征等。
4.细胞复苏管理：对细胞进行管理和维护，包括定期更换培养基、检测细胞的多项指标、记录细胞的生长状态等，以确保细胞的健康状态和长期保存。
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤需要严格控制和执行，以保证细胞的活性和质量。
冻存和复苏过程中的温度、冻存液的配方、时间等因素都会对细胞的生存和恢复产生影响，因此，在实施这些方法时需要权衡各种参数，并根据具体情况进行调整和优化。
同时，冻存和复苏过程中的操作要保持无菌、无污染，以保证细胞的无菌状态和纯度。
细胞冻存与复苏步骤
细胞冻存与复苏步骤一、细胞冻存步骤1.细胞准备：选择需要保存的细胞，如细菌、真核细胞或植物细胞等。
确保细胞在保存前是健康和活跃的。
2.细胞培养：将细胞培养在适当的培养基中，提供足够的营养物质供细胞生长和增殖。
3.预冷处理：在冰箱中对细胞进行预冷处理，以适应环境的改变，减少冷冻过程中对细胞的伤害。
4.冷冻介质配制：配制适合冷冻细胞的冷冻介质。
常见的冷冻介质包括甘油、DMSO（二甲基亚砜）等。
5.细胞冷冻：将培养好的细胞与冷冻介质混合均匀，并分装到冷冻管或冻存袋中，然后将其放入液氮罐中进行冷冻。
6.冷冻保存：将冷冻好的细胞保存在液氮罐中，温度通常保持在-196℃以下。
二、细胞复苏步骤1.预备工作：首先需要准备好细胞复苏所需的培养基和试剂。
培养基通常包括适当浓度的多糖、氨基酸和生长因子等。
2.细胞解冻：将冷冻的细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃的水浴中解冻，避免长时间暴露在室温。
3.细胞离心：解冻后将细胞离心，以去除残留的冷冻介质和杂质。
4.细胞重悬：将离心得到的细胞重悬于预先准备的培养基中。
5.细胞培养：将细胞转移至培养皿中，放入恒温培养箱中，通常为37℃，5%CO2的条件下继续培养。
6.细胞观察：观察培养皿中细胞的生长情况，通过显微镜观察细胞形态和数量的变化。
1.选择适当的冷冻介质：不同细胞类型对冷冻介质的耐受性不同，需要选择能够保护细胞完整性和生物活性的冷冻介质。
2.控制冷冻速率：过快或过慢的冷冻速率都可能导致细胞冻存失败。
通常使用控制冷冻速率的设备，如液氮罐或冷冻机。
3.防止细胞冻伤：冻存过程中细胞易受到冻伤的伤害，应尽量减少或避免冻伤的发生。
例如，在细胞冷冻前使用细胞保护剂可以提高细胞的存活率。
4.保存条件控制：细胞冷冻保存时，需要精确控制温度，确保保存温度稳定，以防止细胞失活或变异。
液氮罐中的细胞保存时间通常可以达到数年以上。
细胞冻存与复苏技术的发展为细胞研究和应用提供了更多的可能性，同时也为人类疾病的治疗和预防带来了希望。
细胞冻存和复苏
细胞冻存和复苏
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一、细胞冻存
细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。
细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。
细胞冻存原则是慢冻快融。
当细胞冷到0℃以下，会造成细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。
复苏过程应快融，目的是防止小冰品形成大冰品，即冰晶的重结晶。
在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。
常用的低温保护剂是DMSO，它是种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。
常用配方为2×冻存液(40％血清培养基+40％血清+20％DMSO)。
目前已经有商业化无DMSO无血清细胞冻存液，它是一种化学成分确定、不含动物源成分，也不含DMSO的冻存液。
可直接使用，无需梯度降温。
二、细胞复苏
细胞复苏是将冻存在液氮中的细胞解冻后重新培养。
细胞复苏过程升温要快，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。
具体步骤：从液氮中取出冷冻管，迅速投入37℃水浴中，使其融化(1分钟左右)。
5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上，800rpm低速离心10分钟，去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
细胞冻存与复苏
细胞冻存与复苏细胞冻存与复苏细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
细胞的冻存【用品】（1） 5%胰蛋白酶（2）含10%~20%血清培养液（3） DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（15磅蒸汽高压消毒）（4）吸管、离心管、冻存管【步骤】（1）从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。
在冻存前一天最好换一次培养液。
（2）用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。
依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心。
（3）去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配制好的冻存培养液（含10%DMSO或甘油），冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml。
用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中。
（4）装完细胞后的冻存管即可直接冻存。
以本教研室对L929的冻存程序作为大家进行细胞冻存的参考：将冻存管放入4℃冰箱 2hr；-20℃冰箱2hr；液氮表面过夜。
以后取出冻存管移入液氮容器内。
在放入液氮时，要带手套操作以免冻伤。
细胞在液氮中储存时间理论上是无限的，但为妥善起见，特别是很多为被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次观察细胞对冻存的适应性。
已建系的细胞最好也每年取一支复苏一次后，再继续冻存。
细胞的复苏【用品】培养液，吸管，离心管，培养瓶，37℃温水【步骤】（1）从保存冻存管的支架中取出冻存管应直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
如果冻存管密封不严，在保存过程中液氮进入冻存管中，从液氮罐中取出时由于温度升高导致液氮急速气化而爆炸，可能会危及面部等。
因此，存取冻存管时都要佩戴眼镜和手套。
（2）从37℃水浴中取出冻存管，用酒精消毒后，拧开冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心，除去上清液，在重复用培养液洗一次。
细胞冻存和复苏的原则
细胞冻存和复苏的原则
1.保护细胞膜：细胞膜是细胞内部和外部环境之间的重要屏障，保护
细胞膜是冻存和复苏的关键。
冻存前，必须将细胞放入适当的保护剂中，
例如甘油、DMSO等，保护细胞膜免受冷冻过程中的损伤。
在复苏过程中，使用适当的解冻缓冲液缓慢地回温，避免细胞膜急剧收缩或破裂。
2. 控制冷冻速度：细胞冷冻的速度必须缓慢，以避免冻结引起的细
胞破坏。
最佳的冷冻速度取决于细胞类型和冷冻条件，通常应在-
1°C/min以下。
可以使用特殊的冷冻器进行控制，或通过降低温度梯度
来减缓细胞的冷冻速度。
3.恢复培养环境：在冻存的细胞复苏过程中，必须立即将细胞恢复到
培养环境中。
这包括向培养基中添加适当的营养物，例如葡萄糖、氨基酸、维生素等，在适宜的温度、氧气和二氧化碳条件下培养。
4.检测细胞的活力和质量：冷冻和复苏过程都会对细胞产生损伤，因
此必须定期检测细胞的活力和质量。
这可以通过测量细胞增殖率、形态、
细胞周期及细胞凋亡等生化和形态指标来评估。
总之，一个成功的细胞冻存和复苏过程需要考虑多个因素，包括保护
细胞膜、控制冷冻速度、恢复培养环境和检测细胞活力和质量。
只有通过
精心设计和执行这些步骤，才能最大限度地减小细胞冻存和复苏过程中的
损伤和质量损失。
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细胞冻存与复苏原则：慢冻快融在超低温的液氮中进行冻存（-196度）。
在冻存过程中，随着温度的改变，细胞内部结构讲发生一系列的变化。
细胞快速冻存时，将会受到很大的损伤，甚至导致细胞的死亡。
温度急速下降时细胞脱水少，还会使细胞内结冰。
细胞内冰晶的形成会造成蛋白质和酶的变性，以及细胞器的损伤，并最终导致细胞的死亡。
因此，冰冻细胞时，应使温度缓慢下降，从而使细胞内水分渐渐脱出，使细胞内不结冰。
由于冰冻细胞体中的冰晶体很小，融化时必须快，以防这些微小晶体转化为较大的冰晶体。
因此，细胞的冻存和融化过程要在缓冰速融”下进行。
一般冷冻时，在-30度之前药缓慢降温，速度控制在每分钟下降1度，—30度以下可快速冷冻，使温度降至—196度。
冰冻时还要加入5〜10 %的甘油或二甲基亚砜作为冷冻保护剂。
因为二者分子量小，容易穿透细胞降低细胞内的冰点，并提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冻存，可使细胞内的水分渗出在细胞外形成冰晶，从而避免细胞损伤。
在细胞复苏过程中，必须快速溶解,否则容易造成细胞外溶解的水分进入细胞内重新形成冰晶，造成细胞死亡。
一、细胞复苏如果冻存前细胞状态好，而且冻存时间长，复苏用的培养液没问题的话，复苏细胞出现问题最可能的原因是解冻时间过长和解冻后没有及时稀释接种KEY：1．冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。
2．细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常（例如产生单株抗体或是其它蛋白质）。
Protocal（以贴壁细胞系tsA201 为例）1. •准备材料：37C〜40 C水浴，37 C预热培养液，离心管、血球计数盘与盖玻片2. 细胞实验室进行常规消毒，紫外照射30 min 以上，超净台开启通风10 min。
培养液孵温至于37 °C3. 培养液回温后喷以70 % 酒精并擦拭，移入无菌操作台内。
将7-10 ml 左右新鲜培养基移入离心管中，备用。
4. 带上厚手套用镊子将冻存管从液氮保存罐中取出（操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害），检查盖子是否旋紧（由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉）。
立即放入40 C水浴中，轻摇冷冻管使其在快速全部融化（如果冻存管封闭不严格,在水中出现气泡,那么细胞无法继续使用），以70 % 酒精擦拭冻存管外部，移入无菌操作台内。
5. 将细胞悬液移入已加培养基的离心管中，稍微吹打混匀，低速离心（1000rpm ，4min ）去除上清，加入适量培养液重悬，计数，调整细胞浓度，37C 5%CO2培养。
取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。
6. 24h 后观察细胞，视情况是否换液，继续培养7. 记录复苏日期。
注意事项：安全防护1 ．液氮取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。
2．冻存管爆裂细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。
为防止冻存管在升温时爆裂等，可以在放入水浴前就实现在超净台里把盖子拧松一下然后再拧上。
从液氮罐里拿出来不是说一定要分秒必争地放入水浴。
细胞从液氮的零下1 百多度升到比如负八十这个过程对细胞没有损害。
有足够的时间handle 这些。
只不过一旦细胞化了，就应该争分夺秒地把它放入培养液了，主要是为了稀释DMSO。
常温下高浓度DMSO对细胞的损害比较大。
温度与速度★37〜40 C。
如果复苏温度太低，会造成细胞的损伤，水浴温度40C 应该也没问题，但不能太高了。
★常温下二甲基亚砜（DMSO）对细胞的毒副作用较大，因此，必须在1-2 min 内使冻存液完全融化。
离心与换液与培养★解冻后是否立即去除冷冻保护剂（例如DMSO 或glycerol），依细胞种类而异。
目前主要有两种见解。
一种为标准流程。
将解冻后的细胞悬液先进行离心，以去除冷冻保护液DMSO 对细胞的损伤，所以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。
但是离心也会对刚复苏的状态欠佳的细胞产生损伤。
因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。
此外在操作过程中容易污染。
另一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。
但此种方法这可能使培养基中少量的DMSO 对细胞造成损伤。
★离心前须加入适量培养液。
细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，加入适量量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。
★如果不离心，加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO 的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO 的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO 的浓度在小于0.5% 的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。
所以如果你的冻存液的浓度是10％DMSO 的话那么加10ml 以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度★ 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml 细胞液要加10ml －15m 培养液，但培养基加多会增加悬浮力，细胞不好贴壁，所以有时培养基越少细胞越容易贴附。
Troubleshoot （以Raji 为例）1. 取错细胞：拿错冻存管。
（快快快，匆忙之中，难免出错，况且－170 多度，冻手！）==> 核查记录册及冻存管上细胞的名称、时间是否一致。
==> 拿细胞时戴手套！2. 水浴时间太长：2min 还没融化。
（冻存管的壁较厚，隔热）==> 适当提高水浴温度（37 度－40 度）==> 要是冬天，就选用保温盒。
3. 冰盒内时间太长：复苏1h 后，还没有加入新的培养液。
（高浓度DMSO防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会，对细胞有毒性）==> 提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间。
4. 失去耐心：复苏三四天后，细胞没有任何动静，认为失败，倒掉所有细胞。
（有些细胞复苏后一星期，才有起色）==> 不要换液，耐心等待，两周后再做决定。
经验与讨论：★ 不必等细胞全化了再从水浴里取出来。
只要冰块浮起来了就差不多了。
我一般最多水浴不超过1.5 分钟。
然后经过喷酒精消毒什么的差不多又半分钟过去了。
每次都还有没化的。
先把已经融解的部分吸到培养瓶里，再从培养瓶里吸些培养液到冻存管里，余下的冰块瞬间就化了，再一起吸到培养瓶里。
★ 恒温水槽的温度最好在40 度左右（个人经验），冻存管内液体融化较快，温度又不至于太高损伤细胞。
★ 解冻一分钟之内完成最好，38 度水浴锅里快速搅动，50 几秒就好了。
★DMS04度以下对细胞毒性小，但4度以上对细胞毒性则显著增强，所以还是建议复苏后离心袪除冻存液，离心转速可以控制1000 左右。
复苏在于快，我一般是将其放入50 度左右水浴中（37 度水浴中冻存管内肯定不到37 度），摇动不到1 分钟，一成液状时就拿出水浴，（此时冻存管内温度还较低，避免DMSO 对细胞毒性），这样复苏细胞活力与冻存前近似。
★刚从实验室同事那里学到的好方法，据说屡试不爽：1 将冻存细胞的冻存管取出，迅速放于100％Ethanol 中，置于室温溶化，约1min （据说比加温好）；2 取1ml 冻存的细胞加入10ml 培养基轻柔混匀；3. 37 度5％二氧化碳孵箱培养；4 3-4 小时左右，视细胞情况换液（大部分细胞贴壁以后）。
不同的细胞可能会有一些不同，需要自己根据实际情况摸索★ 可以提前把需要的体积的培养液放到培养瓶里，拧松瓶盖，放到孵箱里半小时到1 小时，这样温度和ph 值都已经最适合细胞生长了。
★ 复苏后1-2 小时，待细胞贴壁后，缓慢将培养液倒出，加入新鲜培养基，血清（15% ），培养3 天观察★ 有时候,在液氮中冻存了很多种细胞, 复苏的时候可能会将许多细胞取出来, 捡出需要的细胞时,最好用泡沫盒盛上一些液氮,将细胞放在泡沫盒的液氮里, 慢慢找你想要的（对于细胞这玩艺,还是能快就快哈）,这样对细胞的影响最小,你也不会手忙脚乱了。
★ 不一定非要60S 不可，只要在37 度水浴中不断摇动直到大部分冻存液溶解即可拿到培养室内，此后，可低速离心约5 分钟换液或者是将细胞直接稀释到已含有培养基的培养瓶中，待其贴壁过夜后再更换培养液，我两种方法都用过，效果都还行。
但对于第二种方法要视细胞的具体情况而定，我用的是231 细胞和MCF7 细胞，没有问题★ 至于离不离心, 可以作一个对照,复苏的时候一瓶离心,一瓶不离心, 对照一下哪种对细胞的生长状态好一点.这个是没有公认的, 只有自己体会.★ 复苏的时候尽量离心一下，把DMSO 除去，然后可以等细胞贴壁状态好的时候再换液，没必要死板套天数换液。
像U937、Jurkat这种悬浮细胞，养的时候都比较好养，但复苏时就相对比较困难。
我做的经验是：离心去掉大部分冻存液上清加入新鲜1640 培养基，放置一段时间2-3 天甚至再长一段时间，期间不用更换培养基但要每天观察，直到细胞状态好细胞数增多，如Jurkat 细胞出现抱团现象，这时再按常规方法培养就行了。
悬浮细胞刚复苏细胞碎片是比较多，但一旦细胞状态好生长速度也比较快，多传几次就好了。
★ 复苏细胞在去除冻存液时，离心速度要小，小于500 转，速度太大，对细胞也有损伤★ 溶解后应迅速吸出加入已准备好的含有5 倍体积以上的培养液或pbs 的离心管中，吹打均匀，充分稀释冻存液中dmso ，离心后接种。
因为常温下1%DMSO 对培养细胞的毒性就很大，一般冻存液中dmso 浓度为10% ，所以理论上需要10倍稀释后再接种，但实际操作时5 倍稀释问题不大。
而且5ml 的离心管比较常用。
★ 适当高一点的温度，可以加速溶解，减少冰晶破坏细胞的可能性。
通常两分钟内融解即可。
另外无论是冻在-80 还是液氮,取出来后迅速放到37~40 度温水里水浴,摇晃冻存管,让其融化,时间不一定要求在一分钟之内,但尽量快.待留仅有少余冰晶（留冰晶目的是减少DMSO对细胞损伤）即可拿出，加入10倍体积无血清培养液低速离心（一般是1000rpm,5min）, 去上清,加入培养液使细胞重悬,然后移入培养瓶中,在根据情况添加适量培养液.★个人觉得如果复苏时离过心，在换液的时候就不要洗涤细胞了。
★我们实验室解冻时都是用40 度，而且复苏后的细胞成活率很高，基本没有死细胞，状态也很好，然后把血清浓度调高些，培养基不要加多会增加悬浮力，细胞不好贴壁，可以再试着复苏一次二、细胞冷冻保存KEY: —、细胞的生长状态二、冻存液的配制三、是冻存步骤，采取程序降温Protocal(以贴壁细胞系为例)1．冷冻前24-48 小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。
2．准备材料:生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650) 、胰酶37 C回温、无菌塑料冷冻保存管、离心管、0.4 %(w/v ) trypanblue(GibcoBRL15250-061) 、血球计数盘与盖玻片、冻存装置(等速降温机或简易冻存盒或脱脂棉、医用纱布或泡沫盒) 2．细胞实验室进行常规消毒，紫外照射30 min 以上，超净台开启通风10 min。