药品杂质谱控制关键技术平台的建立

青霉素类抗生素质谱裂解的一 般规律
抗生素室
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鉴定未知同系物结构的策略－ 1 鉴定未知同系物结构的策略－1
对于具有相同母核的化合物： 紫外光谱图可以得到有关母核结构的信息； 一级质谱得到分子量信息； 二级质谱得到碎片峰信息,可以推测出有关各 取代基的情况； 利用色谱保留行为来验证推测结果是否正确 。 利用色谱保留行为来验证推测结果是否正确。
H 2 H 2 H 2
16
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甲磺酸帕珠沙星中未知有机挥发物的结构确定
甲磺酸帕珠沙星样品的GCMS总离子流色谱图
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原Βιβλιοθήκη Baidu法
新方法 新方法
分析方法的有效性（氨苄西林钠/舒巴坦钠）
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不同检测器在抗生素中的应用
罗红霉素混合溶液HPLC-UV-ELSD图 1：溶剂峰 2：RU39001杂质峰 3：RU39342杂质峰 4：罗红霉素主峰
6
5
4
2 0
2.409 2.780
5
10
10.361
8.175
15
20
20.271
6.711
9.455
3
19.292
25
min
头孢吡肟HPLC旋光检测器分析图谱
雷帕霉素HPLC-荧光检测分析图谱
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-HPLC 所有的杂质在所选择的RP RP-HPLC 系统中被有效的检出了吗？
– 是否有杂质吸附到色谱柱上未被洗脱？ – 是否有杂质在色谱柱上未被保留？ – 是否所检测到的色谱峰存在共出峰？
CH3 NH N F O OH N COOH
NH N F O CH3 OCH3 N COOH
H2N
H N F
OCH 3 N COO O
CH3 H3C N N F O OCH 3 N COOH
5#杂质 （8-羟基加替沙星 ）
加替沙星
2#杂质 7#杂质 （2-甲基乙二胺加替沙星 ） （加替沙星N-甲基化物 ）
5 5＃杂质 ＃杂质 ≥ ≥ 加替沙星 加替沙星 ≥ ≥2 2＃杂质 ＃杂质 ≥ ≥7 7＃杂质 ＃杂质
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WT 5#杂质
5#杂质 WT
CH 3
5#杂质
NH N F
OH N COOH O
Normal
5#杂质（8-羟基加替沙星 ）0.1 mg/ml (注射浓度)；4-dpf.
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S H 2N N O COOH OAc
S N
N N
CH
O
N
3
O
CFZD
CFZL
Figure 1 The synthetic route of cefazolin sodium and cefazedone sodium.
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120 100 80 60 40 20 0 WT 1 5 10 100 300 500 10 100 300 500 10 50 100 300 500 10 100 300 500 10 50 100 300 500 MMTD 7-ACA DPA TzAA TDA Teratogenic rate Mortality rate
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在两个不同的色谱系统中如何实 现色谱峰的彼此识别？
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利用 色谱相关光谱 利用色谱相关光谱 技术 ，解决了对不 技术，解决了对不 同色谱系统中杂质 峰的追踪 问题。 峰的追踪问题。
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基本原理
获取HPLC的三维色谱图 将一张色谱图的每一保留时间点的光
谱与另一张色谱图的每一保留时间点 的光谱进行一次比较，可以找出两色 谱图中 光谱相似的流出物，从而对色 谱图中光谱相似的流出物，从而对色 谱峰进行归属。
残留溶剂测定 知识库
定性 知识库
方法优化 知识库
定量 知识库
初筛 知识库
确证 知识库
色谱柱选择 知识库
计算机 辅助条件 优化知识库
非极性 色谱系统
极性 色谱系统
质谱库
气态红外 光谱库
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溶剂化参数模型
log SP = c + r ⋅ R2 + s ⋅ π + a ⋅ ∑α + b ⋅ ∑ β + l ⋅ log L
庆大霉素供试品 庆大霉素供试品HPTLC HPTLC色谱图 色谱图 及对应的 及对应的UV UV扫描图谱 扫描图谱
1.UK1 C1a 6.UK5 1.UK1 2.UK2 2.UK2 3.UK3 3.UK3 4.UK4 4.UK4 5. 5.C1a 6.UK5 7. C2a+C2 8. C1 9.UK6 7.C2a+C2 8.C1 9.UK6 10.UK7 10.UK7
HS N S N CH
3
MM TD
7 -A C A
S H 2N N O COOH
Cl O Cl N CH
2 COOH
S S N N
CH
3
T DA
N
CH N N N
2 COOH
DP C
Cl O Cl N CH
2 CONH
T zA A
S N
COOH S N
S N
CH
N
3
CH
2 CONH
S N
COOH S N
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杂质谱控制的基本要求
1. 2. 3. 4.
药品中的所有杂质被有效的分离； 知道每一个杂质的来源与结构； 对每一个杂质的生理活性有所了解； 质控分析方法有良好的粗放性。
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所涉及的科学问题
1.
复杂体系样品的分离分析
• • • 是否分离完全？ 如何定性、定量？ 如何建立稳健的色谱方法？
2. 3.
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如何确定微量杂质的结构？
根据杂质来源，产生条件，结合母核
的质谱裂解规律推断杂质的可能结构
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R3 O R1 O R1 C HN S R4 A1 H A2 B
'
O
R3
R3
'
'
O N
C
O
R1
R2
'
O
C N H N H A1 H A2 B S
O CH3 CH3
R3
X
O R1 C
头孢菌素类抗生素质谱裂解的一 般规律
抗生素室
鉴定未知降解杂质结构的策略－ 2 鉴定未知降解杂质结构的策略－2
对于反应机理已知的降解杂质 ： 对于反应机理已知的降解杂质： 根据反应原理设计加速实验； 一级质谱得到分子量信息； 二级质谱得到碎片峰信息, 进一步推测降解 物的结构； 利用 UV特征和色谱保留行为来验证推测结果 利用UV特征和色谱保留行为来验证推测结果 是否正确 。 是否正确。
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抗生素室
确定未知杂质的策略－ 3 确定未知杂质的策略－3
推测杂质的可能结构 反合成推测的可能杂质 LC/MS通过质谱裂解规律和色谱保留时间
确定所推测杂质结构的准确性
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通过反合成得到的杂质

喹诺酮类 喹诺酮类
– – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – 氧氟沙星杂质 氧氟沙星杂质A( A(二氟吡啶羧酸 二氟吡啶羧酸 )) 氧氟沙星杂质 氧氟沙星杂质B( B(脱羧氧氟沙星 脱羧氧氟沙星 )) 氧氟沙星杂质 氧氟沙星杂质E( E(脱甲基氧氟沙星 脱甲基氧氟沙星)) 环丙沙星杂质 环丙沙星杂质A( A(氟喹啉酸 氟喹啉酸)) 环丙沙星杂质 环丙沙星杂质B B 乙二胺环丙沙星 乙二胺环丙沙星((杂质 杂质C) C) 脱羧环丙沙星 脱羧环丙沙星((杂质 杂质E) E) 6 6－氯环丙沙星杂质 －氯环丙沙星杂质C C 二甲胺环丙沙星 二甲胺环丙沙星 诺氟沙星杂质 诺氟沙星杂质A A 诺氟沙星杂质 诺氟沙星杂质B B 8 8－羟基莫西沙星 －羟基莫西沙星 8 8－氟莫西沙星 －氟莫西沙星 8 8－乙氧基莫西沙星 －乙氧基莫西沙星 7 7－乙氧基加替沙星 －乙氧基加替沙星 N N甲基加替沙星 甲基加替沙星
抗生素室
杂质谱控制与杂质控制的区别？
头孢泊肟酯有关物质分析的HPLC色谱图 1=头孢泊肟，2=去甲氧基头孢泊肟酯异构体A，3=头孢泊肟酯异构体A， 4=去甲氧基头孢泊肟酯异构体B+△3异构体，5=头孢泊肟酯异构体B+反式头孢 泊肟酯A，6=反式头孢泊肟酯B，7=N-甲酰基头孢泊肟酯异构体A，8=NACCPOD-PRX异构体A，9=N-甲酰基头孢泊肟酯异构体B，10=N-乙酰基头孢泊肟 酯异构体B，11=头孢泊肟酯开环二聚体A，12=头孢泊肟酯开环二聚体B
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HPCE作为杂质谱控制方法必须解
决的问题
– 最佳分离模式的选择 » 分离出更多的杂质 » 样品在电泳分离过程中稳定 – 方法的重现性问题
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HPCE分析β-内酰胺抗生素杂质谱 最佳分离模式的选择
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抗生素室
HPLC与HPTLC分析庆大霉素的比较

HPTLC中的9号和10 号斑点在HPLC中被 检出了吗？
LU 1.932 2.032
阿奇霉素混合溶液HPLC-UV-ELSD图 1：溶剂峰 2: N-氧基-阿奇霉素 3: Desosaminy-阿奇霉素 4: 阿奇霉A 5: 氧基-红霉素 6：阿奇霉素
FLD1 A, Ex=278, Em=340 (D:\DATA-1\RAPA\RAPA0010.D)
7 17.451 1.693 7.205 8.660 11.610 12.334 12.931
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色谱相关光谱法
——分析原理 相关系数计算公式
R S ,T =
∑ (x
k =1 n
n
k
− x )( y k − y )
n 1/ 2
⎧⎡ 2 ⎤⎡ 2 ⎤⎫ − ( x x ) ( y y ) − ⎨ ⎢∑ k ⎥ ⎢∑ k ⎥⎬ 1 1 k = k = ⎣ ⎦ ⎣ ⎦⎭ ⎩
将两张色谱图中的每一保留时间点的光谱进行相关系数计 算，以两色谱图保留时间分别作为x轴和y轴、相关系数 为z轴，作三维相关图，设定相关系数阈值对三维图进行 横切，得到的等高图即为二维色谱—相关光谱图，由此等 高图可以看出两色谱图中哪些色谱峰光谱相关
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有关物质控制理念的变迁
BP80
提出有关物质 (Related substance) 的 提出有关物质(Related substance)的
概念 是控制药物杂质的一个重要“分水岭” BP98 BP98是控制药物杂质的一个重要“分水岭” ：该版药典不仅在附录中首次收载了有关物 质及残留溶剂检查通则，增加了杂质研究指 导原则。且在各论项下对 已知杂质分别制订 导原则。且在各论项下对已知杂质分别制订 了限度，并提供了所有已知杂质的名称、分 子式和结构式。
微量组分的结构确证 微量组分的毒性评价
• • 微量组分的毒性评价方法 结构与活性的关系研究
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杂质谱分析的基本策略
杂质 挥发性杂质 残留溶剂 HS-GC 其它 RP-HPLC GC- MS 有机杂质 互补方法 无机杂质 ICP-MS HPCE HPTLC 离子色谱
不同检测器
梯度洗脱
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残留溶剂测定知识库
抗生素室
毒性快速评价平台
毒性快速评价平台，利用显微注射的 斑马鱼 斑马鱼毒性快速评价平台，利用显微注射的 方法，对杂质的胚胎毒性、神经毒性，心脏 毒性等进行评价。
优点： – 仅需微量（μg级）纯品 即可用于实验 – 无需知道杂质结构 – 实验周期短 （3－4天一个周期）
抗生素室
沙星类及其杂质的斑马鱼胚胎毒性评价
药品杂质谱控制 关键技术平台的建立
2010，3
抗生素室
杂质质控理念的变迁
纯度控制 杂质控制
第二次飞跃 第一次飞跃
杂质谱 控制
杂质谱）: A description of the Impurity Profile （ （杂质谱）
identified and unidentified impurities present in a drug substance. 对存在于药品中所有已知杂质和 未知杂质的总的描述。
抗生素室
二维色谱相关光谱法测定有关物质
——二维色谱相关光谱的应用
比阿培南色谱图中杂质峰的识别
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二维色谱相关光谱法测定有关物质
——二维色谱相关光谱的应用
比阿培南色谱图中杂质峰的识别
抗生素室
色谱相关光谱技术追踪比阿培南杂质的来源
氧化降解途径色谱图中杂质峰的识别
4 4号杂质为氧化降解产物； 号杂质为氧化降解产物； 6 6号杂质与氧化降解无关。 号杂质与氧化降解无关。
抗生素室
ACA ACA， ，535 535： ：89-99, 89-99, 2005 2005
分析化学， -99， 分析化学，34 34（ （1 1）： ）：95 95-99 ，2006 2006
药学学报， -480， 药学学报，41 41（ （5 5）： ）：475 475-480 ，2006 2006

其它 其它
– – – – – – – – – – – – – – – – – – – – 大观霉素杂质 大观霉素杂质A A 大观霉素杂质 大观霉素杂质B B 大观霉素杂质 大观霉素杂质E E D -红霉糖胺阿奇霉素 D红霉糖胺阿奇霉素 反式头孢吡肟 反式头孢吡肟 反式头孢噻肟 反式头孢噻肟 反式头孢曲松 反式头孢曲松 利福昔明杂质 利福昔明杂质A A 利福昔明杂质 利福昔明杂质B B 克林霉素 克林霉素B B