果实蛋白质组学研究的实验方法
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mmol.L-1 Tris -HCl (pH 7.5), 1.05 mo .l L-1 s ucros e, 10 mmol.L-1 E GTA, 1 mmo .l L-1 P MS F, 1 mmo .l L-1 DTT
以及 1% Triton X-100)继续研磨。匀浆液以 20 000×g 离心 30 分钟。上清液中加入等体积的 pH 为 7. 8 的 Tris饱和酚, 充分摇荡, 混匀, 10 000×g, 4°C 下离心 30 分 钟, 上层为酚相, 中间白色物质为杂质, 下层为水相。回
1970)。因此, 建立蛋白质提取的有效方法和标准化技 术体系对于果实蛋白质组学研究十分必要。
本文在借鉴模式植物蛋白质提取方法的基础上, 建 立了一整套适用于多种果实, 如甜樱桃( P r u n u s a v i v u m ) 、桃( P r u n u s p e r s i c a ) 、苹果( Ma l u s domest ic a)、芒果(Mangifera indica)和冬枣(Ziz iphus jujub a)的蛋白质组学研究方法, 包括蛋白质的抽提 、 蛋 白 质 裂 解 液 的 优 化、 双 向 凝 胶 电 泳 以 及 凝 胶 染 色 方法等。
加入上槽电极缓冲液(20 mmol.L-1 NaOH)及下槽电极缓 . 冲液(20 mmol L-1 H3PO4), 依照 200 V × 30 分钟, 400
V × 16 小时, 800 V × 1 小时的程序进行等电聚焦。聚 焦完毕后, 从凝胶管中取出胶条, 放入平衡缓冲液 I (62.5
mmol.L-1 Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% (w/v) SDS, 10% (v/ v)
匀浆法(Homo)参照 Chan 等(2007)的方法。称取 4 g 果肉, 用液氮在研钵中研磨成粉。加入 4 mL 的匀浆
缓冲液(匀浆液中含有 20 mmo .l L-1 Tris -HCl (pH 7. 5), 250 mmol.L-1 s uc ros e, 10 mmol.L-1 E GTA, 1 mmol. L-1 P MS F, 1 mmol.L-1 DTT, 以及 1% Triton X-100)继
续研磨。匀浆液以 20 000×g 离心 30 分钟。将上清液 转移到新的离心管中, 加入终浓度为 10% 的 TCA 溶液, 4°C 下放置 2 小时。20 000×g 离心 40 分钟, 收集沉淀。 用冷丙酮冲洗 3 次, 4°C 下干燥后溶于 250 µL 裂解缓冲 液中(表 1), 保存于 wk.baidu.com80°C 备用。
mo .l L-1 urea, 75 mmol.L-1 Tris-HCl, pH 8.8, 29. 3% (v/
v) glycerol, 2% (w/ v) S DS , 0.002% (w/ v) bromophenol blue)中各平衡 20 分钟, 然后再转移至分离胶浓度为 15%, 浓缩胶浓度为5%的SDS-PAGE胶上端进行第二向 垂直电泳。除特别注明外, 等电聚焦均使用 1PG 胶条。
1.2 蛋白质提取
以下所有步骤均在 4 °C 条件下进行。 TCA 法(TCA)参照 S arry 等(2004)的方法并稍加改
进。用取样器从 10 个果实中分别取 4 g 果肉, 用液氮 在研钵中将其研磨成粉。然后加入 4 倍体积冰冷的10% TCA (含 0. 07% β- 巯基乙醇), 匀浆液于 －20°C 下过夜培 养, 纱布过滤。滤液以 20 000×g 离心 30 分钟, 收集沉 淀。沉淀用冷丙酮冲洗 3 次, 并在 4°C 下干燥, 之后溶 于裂解缓冲液中(表 1), 保存于 － 80°C 备用。
收酚相, 加入5倍体积含0. 1 mo .l L-1 乙酸铵的预冷甲醇,
充分混匀, － 20°C 下过夜培养, 沉淀蛋白。沉淀分别用
预冷的含 0. 1 mol.L-1 乙酸铵的甲醇和丙酮冲洗 2 次,
4°C 下干燥后溶于 250 µL 裂解缓冲液中(表 1), － 80°C 保存备用。
1.3 蛋白质的溶解和上样
(10% (v/v) NP-40, 30% (w/v) acry lamide, 9.5 mol.L-1
urea, 10% ammonium persulfat e, 1% (v/ v) ampholine (pH 5－8), 1%(v/v) ampholine (pH 3. 5－10)), 灌胶。待 胶条聚合后, 除去 P arafilm 膜。然后加入 600 µg 蛋白 样品, 并于其上覆盖 30 µL 的 50% 裂解缓冲液。最后
蛋白质组学技术包括蛋白质的高分辨率电泳分离、 胶内酶解、质谱鉴定以及数据库搜索等。如今, 蛋白 质组学技术已经被广泛地应用于动物和微生物领域的研 究(A nt elmann et al., 1997; Qin et al., 2007), 在植物 生物学方面也有广泛的应用(Dominguez -P uigjaner et al., 1992; Chang et al., 2000)。植物细胞中包含许多 次生代谢物质, 可能会干扰蛋白的提取、分离及纯化 (Granier, 1988; Meyer et al. , 1988)。而从果实组织 中提取蛋白质更加困难, 可能是由于果实中蛋白质含量 相对较低, 并且含有大量干扰性物质, 如色素、淀粉、 多酚 、多聚糖、单宁和有机酸类等( C l e m e n t s ,
表 1 裂解缓冲液的配方
Table 1 Lysis buff er rec ipes f or selected steps in 2D elec-
tr ophores is
Re c ip es 1
Ch emi c a ls Ur ea
Co nc e ntra tio ns
. 8 mol L-1
NP- 40
摘要 双向电泳技术是蛋白质组学研究的基本方法之一。果实由于富含糖 、多酚、单宁和有机酸等物质，蛋白质的提取比 其它植物组织更加困难 。本文主要介绍不同果实蛋白质的提取、等电聚焦系统和凝胶染色技术，并建立了一套适用于桃、樱 桃、苹果、 芒果和冬枣等多种果实蛋白质组学的研究方法 。结果表明，采用匀浆法和酚抽提法提取果实的蛋白质 ，裂解缓冲 液2溶解蛋白质， 并用固相pH梯度进行等电聚焦， 可以获得背景清晰和分辨率高的凝胶图谱，具有较好的重复性，可用于果 实蛋白质组学的研究。 我们的研究结果显示， 固相干胶条与IEF管胶相比 ，具有更加明显的优势。而不同的染色方法，对结 果影响不大。
CA (pH 3.5－10)
1% (v/v)
CA (pH 5－8)
1% (v/v)
NP- 40
0.2% (v/v)
酚提取法(P he)根据 Saravanan 和 Rose(2004)的方 法并加以改进。称取 4 g 果肉, 用液氮在研钵中研磨成 粉。然后加入 4 mL 的匀浆缓冲液( 匀浆液中含有 2 0
向蛋白干粉中加入 225 µL 裂解缓冲液 1 或 2(表 1), 振荡 30 分钟, 溶解后用超声波破碎仪处理 。23 755×g 离心 30 分钟, 取上清。采用 B radford(1976)的方法进行定 量, 每个处理上样为 600 µg 蛋白。
1.4 双向电泳
载体两性电解质梯度双向电泳(CA -IE F): 第一向等电聚 焦在长 13 c m、直径 3 c m 的玻璃管中进行(Komats u et al. , 1999)。用 P arafilm 封口膜封好干净的玻璃管 (Daiichi pure Chemic als, Tok yo, Japan)底部, 在13 cm 处做好标记, 垂直放置于置胶器上。用注射器吸取胶液
1.5 凝胶染色方法
本文所用的凝胶染色方法见表 2, 包括: (1)考马斯亮蓝 R-250(CBB R-250) (S hen et al., 2003); (2)胶体考马斯 亮蓝染色(B lue silver)(Candiano et al., 2004); (3)银染 (S ilver st aining)(Blum et al., 1987)。
植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (1): 107−116, w w w .chinbullbotany.com
.技术方法.
果实蛋白质组学研究的实验方法
王清 1, 2 , 产祝龙 1 , 秦国政 1 , 田世平 1*
1 中国科学院植物研究所, 光合作用与环境分子生理学重点实验室, 北京 100093; 2 中国科学院研究生院, 北京 100039
2% (v/v)
CA (pH 3.5－10)
1% (v/v)
CA (pH 5－8)
1% (v/v)
2- mer captoethanol
5% (v/v)
PV P
5% (w /v)
2
Ur ea
Thiour ea
. 7 mol L-1 . 2 mol L-1
CHA PS
4% (w /v)
DTT
1% (w /v)
王清等: 果实蛋白质组学研究的实验方法 109
glyc erol, 5% (v/ v) 2-merc aptoethanol)中, 振荡平衡 2 次, 每次 15 分钟, 然后转移胶条至分离胶浓度为 15% , 浓缩胶浓度为 5% 的 S DS-PAGE 胶上端进行第二向垂 直 电 泳。
固相 pH 梯度双向电泳(IPG-IEF): 等电聚焦用预制 的 13 c m 固相(pH 4－7)梯度胶条(GE Healt hc are)进
关键词 果实, 凝胶染色, 等电聚焦, 裂解缓冲液, 蛋白质提取 王清, 产祝龙, 秦国政, 田世平 ( 2009). 果实蛋白质组学研究的实验方法. 植物学报 44, 107−116.
果实生长发育阶段的生理代谢变化, 以及采后处理 对果实品质的影响一直受到人们的关注。在过去的研 究中, 我们发现生物和非生物因子处理果实可以激发抗 氧化酶类和防御基因的表达(Chan and Tian, 2006; Tian et al. , 2007)。为了进一步研究果实应答生物因子和非 生物因子过程中参与表达的蛋白及其功能, 利用蛋白质 组学的研究方法来揭示果实抗性应答的机理是十分重要 的 手 段。
收稿日期: 2008-04- 22; 接受日期: 2008- 05- 10 基金项目: 国家自然科学基金(No. 30671473, U0631004) * 通讯作者。E-mail: tsp@ibcas.ac .c n
108 植物学报 44(1) 2009
州市。果实采摘后直接运回实验室, 剔除伤果和病果, 挑选出大小均一的果实, 用 1% 的次氯酸钠溶液消毒, 清 洗 后 晾 干。
1 材料与方法
1.1 实验材料
桃(Prunus persica L. B at sc h)采于北京市平谷的试验 果园, 甜樱桃(Prunus avivum L. ‘Hongdeng’) 采于中国 科学院植物研究所的试验果园, 苹果(Malus domes tica Bork h ‘Fuji’) 采于中国农业科学院林果所果园, 芒果 (Mangif era indic a L. ‘Zill’)和冬枣(Ziz iphus jujub a Mill. ‘Dongz ao’)分别采自四川省攀枝花市和山东省滨
行。分别取蛋白质样品 60 0 µg 及水化液(7 m ol . L-1 urea, 2 mol.L-1 t hiourea, 2% (w/v) CHAPS , 0. 5% IPG
buffer 4－7, 0.002% (w/v) bromophenol blue) 混合后过 夜以水化上样, 上样总体积为 250 µL。然后进行等电 聚焦电泳, 升压程序依次为 5 0 0 V 快速升压 1 小时, 1 000 V 线性升压 1 小时, 8 000 V 线性升压 2.3 小时, 8 000 V 快速升压 2 小时。等电聚焦结束后将第一向胶 条分别置于含 1% DTT 和 2. 5% 碘乙酰胺的平衡液 II (6
以及 1% Triton X-100)继续研磨。匀浆液以 20 000×g 离心 30 分钟。上清液中加入等体积的 pH 为 7. 8 的 Tris饱和酚, 充分摇荡, 混匀, 10 000×g, 4°C 下离心 30 分 钟, 上层为酚相, 中间白色物质为杂质, 下层为水相。回
1970)。因此, 建立蛋白质提取的有效方法和标准化技 术体系对于果实蛋白质组学研究十分必要。
本文在借鉴模式植物蛋白质提取方法的基础上, 建 立了一整套适用于多种果实, 如甜樱桃( P r u n u s a v i v u m ) 、桃( P r u n u s p e r s i c a ) 、苹果( Ma l u s domest ic a)、芒果(Mangifera indica)和冬枣(Ziz iphus jujub a)的蛋白质组学研究方法, 包括蛋白质的抽提 、 蛋 白 质 裂 解 液 的 优 化、 双 向 凝 胶 电 泳 以 及 凝 胶 染 色 方法等。
加入上槽电极缓冲液(20 mmol.L-1 NaOH)及下槽电极缓 . 冲液(20 mmol L-1 H3PO4), 依照 200 V × 30 分钟, 400
V × 16 小时, 800 V × 1 小时的程序进行等电聚焦。聚 焦完毕后, 从凝胶管中取出胶条, 放入平衡缓冲液 I (62.5
mmol.L-1 Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% (w/v) SDS, 10% (v/ v)
匀浆法(Homo)参照 Chan 等(2007)的方法。称取 4 g 果肉, 用液氮在研钵中研磨成粉。加入 4 mL 的匀浆
缓冲液(匀浆液中含有 20 mmo .l L-1 Tris -HCl (pH 7. 5), 250 mmol.L-1 s uc ros e, 10 mmol.L-1 E GTA, 1 mmol. L-1 P MS F, 1 mmol.L-1 DTT, 以及 1% Triton X-100)继
续研磨。匀浆液以 20 000×g 离心 30 分钟。将上清液 转移到新的离心管中, 加入终浓度为 10% 的 TCA 溶液, 4°C 下放置 2 小时。20 000×g 离心 40 分钟, 收集沉淀。 用冷丙酮冲洗 3 次, 4°C 下干燥后溶于 250 µL 裂解缓冲 液中(表 1), 保存于 wk.baidu.com80°C 备用。
mo .l L-1 urea, 75 mmol.L-1 Tris-HCl, pH 8.8, 29. 3% (v/
v) glycerol, 2% (w/ v) S DS , 0.002% (w/ v) bromophenol blue)中各平衡 20 分钟, 然后再转移至分离胶浓度为 15%, 浓缩胶浓度为5%的SDS-PAGE胶上端进行第二向 垂直电泳。除特别注明外, 等电聚焦均使用 1PG 胶条。
1.2 蛋白质提取
以下所有步骤均在 4 °C 条件下进行。 TCA 法(TCA)参照 S arry 等(2004)的方法并稍加改
进。用取样器从 10 个果实中分别取 4 g 果肉, 用液氮 在研钵中将其研磨成粉。然后加入 4 倍体积冰冷的10% TCA (含 0. 07% β- 巯基乙醇), 匀浆液于 －20°C 下过夜培 养, 纱布过滤。滤液以 20 000×g 离心 30 分钟, 收集沉 淀。沉淀用冷丙酮冲洗 3 次, 并在 4°C 下干燥, 之后溶 于裂解缓冲液中(表 1), 保存于 － 80°C 备用。
收酚相, 加入5倍体积含0. 1 mo .l L-1 乙酸铵的预冷甲醇,
充分混匀, － 20°C 下过夜培养, 沉淀蛋白。沉淀分别用
预冷的含 0. 1 mol.L-1 乙酸铵的甲醇和丙酮冲洗 2 次,
4°C 下干燥后溶于 250 µL 裂解缓冲液中(表 1), － 80°C 保存备用。
1.3 蛋白质的溶解和上样
(10% (v/v) NP-40, 30% (w/v) acry lamide, 9.5 mol.L-1
urea, 10% ammonium persulfat e, 1% (v/ v) ampholine (pH 5－8), 1%(v/v) ampholine (pH 3. 5－10)), 灌胶。待 胶条聚合后, 除去 P arafilm 膜。然后加入 600 µg 蛋白 样品, 并于其上覆盖 30 µL 的 50% 裂解缓冲液。最后
蛋白质组学技术包括蛋白质的高分辨率电泳分离、 胶内酶解、质谱鉴定以及数据库搜索等。如今, 蛋白 质组学技术已经被广泛地应用于动物和微生物领域的研 究(A nt elmann et al., 1997; Qin et al., 2007), 在植物 生物学方面也有广泛的应用(Dominguez -P uigjaner et al., 1992; Chang et al., 2000)。植物细胞中包含许多 次生代谢物质, 可能会干扰蛋白的提取、分离及纯化 (Granier, 1988; Meyer et al. , 1988)。而从果实组织 中提取蛋白质更加困难, 可能是由于果实中蛋白质含量 相对较低, 并且含有大量干扰性物质, 如色素、淀粉、 多酚 、多聚糖、单宁和有机酸类等( C l e m e n t s ,
表 1 裂解缓冲液的配方
Table 1 Lysis buff er rec ipes f or selected steps in 2D elec-
tr ophores is
Re c ip es 1
Ch emi c a ls Ur ea
Co nc e ntra tio ns
. 8 mol L-1
NP- 40
摘要 双向电泳技术是蛋白质组学研究的基本方法之一。果实由于富含糖 、多酚、单宁和有机酸等物质，蛋白质的提取比 其它植物组织更加困难 。本文主要介绍不同果实蛋白质的提取、等电聚焦系统和凝胶染色技术，并建立了一套适用于桃、樱 桃、苹果、 芒果和冬枣等多种果实蛋白质组学的研究方法 。结果表明，采用匀浆法和酚抽提法提取果实的蛋白质 ，裂解缓冲 液2溶解蛋白质， 并用固相pH梯度进行等电聚焦， 可以获得背景清晰和分辨率高的凝胶图谱，具有较好的重复性，可用于果 实蛋白质组学的研究。 我们的研究结果显示， 固相干胶条与IEF管胶相比 ，具有更加明显的优势。而不同的染色方法，对结 果影响不大。
CA (pH 3.5－10)
1% (v/v)
CA (pH 5－8)
1% (v/v)
NP- 40
0.2% (v/v)
酚提取法(P he)根据 Saravanan 和 Rose(2004)的方 法并加以改进。称取 4 g 果肉, 用液氮在研钵中研磨成 粉。然后加入 4 mL 的匀浆缓冲液( 匀浆液中含有 2 0
向蛋白干粉中加入 225 µL 裂解缓冲液 1 或 2(表 1), 振荡 30 分钟, 溶解后用超声波破碎仪处理 。23 755×g 离心 30 分钟, 取上清。采用 B radford(1976)的方法进行定 量, 每个处理上样为 600 µg 蛋白。
1.4 双向电泳
载体两性电解质梯度双向电泳(CA -IE F): 第一向等电聚 焦在长 13 c m、直径 3 c m 的玻璃管中进行(Komats u et al. , 1999)。用 P arafilm 封口膜封好干净的玻璃管 (Daiichi pure Chemic als, Tok yo, Japan)底部, 在13 cm 处做好标记, 垂直放置于置胶器上。用注射器吸取胶液
1.5 凝胶染色方法
本文所用的凝胶染色方法见表 2, 包括: (1)考马斯亮蓝 R-250(CBB R-250) (S hen et al., 2003); (2)胶体考马斯 亮蓝染色(B lue silver)(Candiano et al., 2004); (3)银染 (S ilver st aining)(Blum et al., 1987)。
植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (1): 107−116, w w w .chinbullbotany.com
.技术方法.
果实蛋白质组学研究的实验方法
王清 1, 2 , 产祝龙 1 , 秦国政 1 , 田世平 1*
1 中国科学院植物研究所, 光合作用与环境分子生理学重点实验室, 北京 100093; 2 中国科学院研究生院, 北京 100039
2% (v/v)
CA (pH 3.5－10)
1% (v/v)
CA (pH 5－8)
1% (v/v)
2- mer captoethanol
5% (v/v)
PV P
5% (w /v)
2
Ur ea
Thiour ea
. 7 mol L-1 . 2 mol L-1
CHA PS
4% (w /v)
DTT
1% (w /v)
王清等: 果实蛋白质组学研究的实验方法 109
glyc erol, 5% (v/ v) 2-merc aptoethanol)中, 振荡平衡 2 次, 每次 15 分钟, 然后转移胶条至分离胶浓度为 15% , 浓缩胶浓度为 5% 的 S DS-PAGE 胶上端进行第二向垂 直 电 泳。
固相 pH 梯度双向电泳(IPG-IEF): 等电聚焦用预制 的 13 c m 固相(pH 4－7)梯度胶条(GE Healt hc are)进
关键词 果实, 凝胶染色, 等电聚焦, 裂解缓冲液, 蛋白质提取 王清, 产祝龙, 秦国政, 田世平 ( 2009). 果实蛋白质组学研究的实验方法. 植物学报 44, 107−116.
果实生长发育阶段的生理代谢变化, 以及采后处理 对果实品质的影响一直受到人们的关注。在过去的研 究中, 我们发现生物和非生物因子处理果实可以激发抗 氧化酶类和防御基因的表达(Chan and Tian, 2006; Tian et al. , 2007)。为了进一步研究果实应答生物因子和非 生物因子过程中参与表达的蛋白及其功能, 利用蛋白质 组学的研究方法来揭示果实抗性应答的机理是十分重要 的 手 段。
收稿日期: 2008-04- 22; 接受日期: 2008- 05- 10 基金项目: 国家自然科学基金(No. 30671473, U0631004) * 通讯作者。E-mail: tsp@ibcas.ac .c n
108 植物学报 44(1) 2009
州市。果实采摘后直接运回实验室, 剔除伤果和病果, 挑选出大小均一的果实, 用 1% 的次氯酸钠溶液消毒, 清 洗 后 晾 干。
1 材料与方法
1.1 实验材料
桃(Prunus persica L. B at sc h)采于北京市平谷的试验 果园, 甜樱桃(Prunus avivum L. ‘Hongdeng’) 采于中国 科学院植物研究所的试验果园, 苹果(Malus domes tica Bork h ‘Fuji’) 采于中国农业科学院林果所果园, 芒果 (Mangif era indic a L. ‘Zill’)和冬枣(Ziz iphus jujub a Mill. ‘Dongz ao’)分别采自四川省攀枝花市和山东省滨
行。分别取蛋白质样品 60 0 µg 及水化液(7 m ol . L-1 urea, 2 mol.L-1 t hiourea, 2% (w/v) CHAPS , 0. 5% IPG
buffer 4－7, 0.002% (w/v) bromophenol blue) 混合后过 夜以水化上样, 上样总体积为 250 µL。然后进行等电 聚焦电泳, 升压程序依次为 5 0 0 V 快速升压 1 小时, 1 000 V 线性升压 1 小时, 8 000 V 线性升压 2.3 小时, 8 000 V 快速升压 2 小时。等电聚焦结束后将第一向胶 条分别置于含 1% DTT 和 2. 5% 碘乙酰胺的平衡液 II (6