光学显微镜的使用及保养方法

光学显微镜的使用及保养方法

显微镜是研究微生物学的重要工具之一，根据不同的研究目的和要求，可以分别选用普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等，在食品微生物检测中，以普通光学显

微镜(简称显微镜)最为常用。

光学显微镜是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器。光学显微镜就是利用表面为曲面的光学透镜使物体放大成像这一原理，把微小物体放大到人眼足以观察的尺寸。

光学显微镜通常采用两级放大，分别由物镜和目镜完成。被观察物体位于物镜的前方，被物镜做第一级放大后成，倒立的实像，然后此实像再被目镜做第二级放大成虚像，人眼看到的就是一虚像，而显微镜的总放大倍率就是物镜放大倍率和目镜放大倍率的乘积。

放大倍率是指直线尺寸的放大比，而不是面积比。显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率，显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距。分辨率和放大倍率是两个不同的但又相互有关联的概念。

当选用的物镜分辨率不够高(数值孔径不够大)时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只是一个轮廓大但细节不清晰的图像，称为无效放大倍率。反之如果分辨率已经满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。

一、显微镜的构造

(一)光学部分

1.物镜

该镜头下端接近被检物体，为显微镜上的主要光学装置。由多块透镜组成。一般显微镜具有3个-4个物镜，分成干燥系和油镜两组，干燥系又按放大倍数分为低倍镜和高倍镜。各物镜放大率由其外形辨认，镜头长度越大，镜片口径越小，放大倍数愈大；反之，放大倍数小。油镜头的下缘，一般刻有一圈黑线。此外，各物镜上都刻有放大倍数、孔径数等标志

2.目镜

目镜重要的光学部分之一，和镜检者的眼睛接近。目镜由两块透镜组成，其上刻有倍数。为便于指出物象，常在镜中装黑色细丝一条，作为指针。

3.聚光器

聚光器位于载物台下方的次台上，由数个透镜组成。能上下移动，调节并集聚由光源提供的光线，使集中于载物玻片上。

4.光源

光源提供观察所需光线，装在显微镜的最下方。

(二)机械部分

1.镜臂

镜臂在镜筒后面，便于显微镜搬移，并作为将镜筒倾斜时的握持部。

2.底座

显微镜的底座用以支持全镜，呈马蹄形。

3.载物台

在物镜下方，呈方形或圆形，用以载放被检物体。中央有孔，可以透光。台上装有一弹簧夹，镜检时可以固定标本片。有的载物台上装有载物台调解旋钮，捻转旋钮，能使标本前后左右移动。

4.光圈

在聚光器下方，可以任意开闭，用以调节射入集光线的多寡。

5.电源和亮度调节旋钮

用于开启光源和调节光源的亮度。

6.粗准焦螺旋和细准焦螺旋

粗准焦螺旋可使载物台较大距离地升降。细准焦螺旋可以精确地调节距离。

二、显微镜的光路

目镜是显微镜顶部一个非常复杂的部件，它由两个或两个以上的内部透镜组成，通常拥有10倍的放大倍数。虽然图2的显微镜示意图给出的是双目显微镜，但是也有单筒目镜的显微镜。另一个重要的部件是物镜，通常显微镜都有可以旋转的镜梁，有利于物镜对玻片的观察。大部分实验室的显微镜物镜的放大倍数通常为:10倍、45倍和100倍，镜头上长标记的英文：low power（低倍），hi gh-dry（高倍）和oil immersion (油镜).有的显微镜可能会有四个镜头，但是最小的放大倍数只有4倍。

显微镜的第三个重要部件为聚光器，它位于载物台下方，收集由灯(光源)发出的光，射到载玻片。聚光器可以由载物台下方的一个旋钮调节升降。聚光器中有一个光圈可以调节透过光的剂量。如果显

微镜缺乏电压来调节光源就主要依靠光圈来调节光源的强度。图1所示的Olympus显微镜的光圈是通过调节一个凸边的圆圈来调节光的强度的。图2显示了显微镜的光路情况。

三、分辨率

显微镜透镜系统的分辨率取决于光圈的数值孔径、光的波长和聚光器的设计。最好的显微镜的油镜的分辨率一般在0.2 um.这就意味着两个相距0.2 um的物体用显微镜观察就感觉是两个独立的个体。但是如果相距小于0.2 um,那么两个小物体就被认为是一个物体。想要使显微镜的分辨率得到最大的发挥，以下因素是必须考虑的：

(1)在光源的上方添加蓝的滤光片，因为短的蓝光波长可以提供更大的分辨率。

(2)聚光器需要放在最高的位置上，这样可以使光最大限度的到达目标处。

(3)光圈不能停在靠下的位置。尽管光圈靠下可以提高对比度，但是它会使光圈的数值孔径变小。

(4)油镜需要在载玻片和100倍的目标之间使用。

必须注意的是放大率增大，分辨率必须增大。但是单纯的增加放大率，比如使用20倍目镜是不能增加分辨率的。

四、显微镜的使用方法

（一)对光

(1)镜检时身体要正对实验台，采取端正的姿态，调整两个目镜之间的距离与观测者瞳距相符，两眼自然睁开，同时左手调节焦距，使物像清晰并移动标本视野，右手记录、绘图。将低倍物镜转至镜筒下方与镜筒成一直线。镜检时载物台不可倾斜，因为当载物台倾斜时，液体或油易流出，既损坏了标本，又污染载物台，也影响检查结果。

(2)利用自然光源镜检时，最好用朝北的光源，不宜采用直射阳光；利用人工光源时，用日光灯的光源。转动底部光源或拨动反光镜，

调节视野亮度。反光镜有平、凹两面，光源强时用平面，较暗时用凹面，需要强光时，将聚光器提高，光圈放大；需要弱光时，将聚光器降低，或光圈适当缩小。

(3)将待观察的标本置载物台上，载物台上有固定的装置固定标本(见图3)。通过载物台调节旋钮将标本移至镜筒下方。转动粗准焦螺旋使镜筒下降至物镜镜接近标本。于转动粗准焦螺旋的同时，需俯身在镜旁仔细观察物镜与标本之间的距离。

(4)调节目镜之间距离，双眼分别于左、右目镜中观察，待双眼视野重合，同时左手转动粗准焦螺旋，使镜筒徐徐上升以调节焦距，使视野内的物像看到时即停，再调细准焦螺旋，至标本清晰为止。

(二)物镜的使用

显微镜一般具有三个物镜，即低倍、高倍及油镜，固定于物镜转换盘孔中。观察标本时，使用低倍物镜，此时，视野较大，标本较易查出，但放大倍数较小(一般放大100倍),较小的物体不易观察其结构。高倍物镜放大的倍数较大(一般放大400倍),能观察微小的物体或结构。油镜放大倍数可达1000倍，用来观察细菌。

(三)低倍、高倍、油镜头的识别

(1)标明放大倍数10×、40 ×、100 x，或10/0.25、40/0.65、100/1.30。

(2)低倍镜最短，高倍镜较长，油镜最长。

(3)镜头前面的镜孔低倍镜最大，高倍镜较大，油镜最小。

(4)油镜头上常刻有黑色环圈，或“Oil"或“油”字

(四)低倍镜换高倍镜的使用方法

(1)光线对好后，捻转载物台调节旋钮寻找需要观察的标本。

(2)如标本的体积较小，不能清楚查看其构造因而不能确认时，则将标本移至视野中央，再旋转高倍物镜于镜筒下方。

(3)旋转细准焦螺旋至物象清晰为止。

(4)调节聚光器及光圈，使视野内的物象达到最清晰的程度。