酵母蔗糖酶的提取及其性质研究
酵母蔗糖酶的提取实验报告
酵母蔗糖酶的提取实验报告一、实验目的本实验旨在学习酵母蔗糖酶的提取方法，并掌握其酶活力的测定方法。
二、实验原理酵母蔗糖酶是一种重要的生物催化剂，广泛应用于食品工业、医药工业等领域。
其提取方法主要包括细胞破碎法和超声波法。
细胞破碎法是将酵母细胞经过离心、洗涤后，在低温下使用高压均质机或超声波仪器进行破碎，使得蛋白质与其他杂质分离。
而超声波法则是将细胞悬液经过超声波处理，使得细胞壁裂开，释放出内部的蛋白质。
三、实验步骤1. 酵母菌体培养：将活性酵母菌体接种到含有10%蔗糖和0.5%酵母粉的液体培养基中，在30℃下静置48小时。
2. 细胞破碎：将培养好的菌体通过离心后洗涤两次，然后在低温下使用高压均质机进行破碎，使得蛋白质与其他杂质分离。
3. 超声波处理：将菌体悬液经过超声波处理，使得细胞壁裂开，释放出内部的蛋白质。
4. 酶活力测定：取一定量的提取液，加入含有蔗糖的缓冲液，在37℃下反应30分钟后用硫酸铜试剂测定还原糖的含量。
四、实验结果通过细胞破碎和超声波法两种方法提取酵母蔗糖酶，测得其酶活力分别为10.5 U/g和12.8 U/g。
五、实验分析1. 细胞破碎法和超声波法都可以用于酵母蔗糖酶的提取，但是超声波法更加快速、高效。
2. 酵母菌体培养条件对于酵母蔗糖酶的产生有较大影响，应该注意培养基成分和温度等因素。
3. 酵母蔗糖酶的测定方法可以采用硫酸铜法，但是也可以采用其他方法，如比色法和光度法等。
六、实验结论本实验通过细胞破碎和超声波法两种方法提取酵母蔗糖酶，并测定了其酶活力。
结果表明，超声波法更加高效。
同时，酵母菌体培养条件对于酵母蔗糖酶的产生有较大影响，应该注意调整培养条件。
最后，硫酸铜法可以用于测定酵母蔗糖酶的活力。
蔗糖酶的提取分离
蔗糖酶的发酵生产及酶学性质研究摘要：本实验酵母中蔗糖酶进行分离纯化并对酶学性质进行了初步的研究。
结果表明:酵母蔗糖酶的最适pH为5.0, 最适温度为45℃。
关键词：蔗糖酶、酶学性质1前言蔗糖酶(Sucrase, EC3.2.1.26) 又称转化酶(Invertase)。
可作用于β-1,2糖苷键,将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。
由于果糖甜度高,可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。
本实验对酶的动力学性质分析, 是酶学研究的重要方面。
本研究通过一系列实验对酵母蔗糖酶的动力学性质如最适温度、最适pH、酶的固定化等进行了初步研究，更好的了解了没得性质。
2材料与方法2.1 材料与设备2.1.1 实验材料酵母、活性干酵母、壳聚糖2.1.2 试剂及配制方法葡萄糖、蔗糖、豆芽汁浸汁、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、NaOH、Na2CO3、盐酸、氨水、琼脂、酒精均为国产分析纯。
95%乙醇溶液、DEAE-Sepharose Fast Flow、1 mol/L醋酸溶液、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(内含0.5 mol/L NaCl溶液，pH值7.3)葡萄糖标准液配制（1mg/ml）：预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。
准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500ml容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。
1% 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。
冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。
10%蔗糖溶液：10g蔗糖溶解于蒸馏水中，定容至100ml0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液1%戊二醛溶液：将4 mL 25%戊二醛溶液用上述Tris-HCl缓冲液稀释至100mL 0.2 mol/L pH 4.5醋酸缓冲液：称取16.4g无水乙酸钠，溶解于800ml蒸馏水，用冰乙酸调节其ph至4.5，然后定溶至1000mL。
酵母蔗糖酶的提取实验报告
酵母蔗糖酶的提取实验报告酵母蔗糖酶的提取实验报告1. 引言酵母蔗糖酶是一种重要的酶，在许多生物过程中起着关键作用。
通过提取酵母蔗糖酶，我们可以深入了解其结构和功能，以及其在实际应用中的潜力。
本实验旨在通过一系列步骤，从酵母细胞中提取酵母蔗糖酶，并评估其活性和效果。
2. 方法和材料2.1 材料- 新鲜酵母菌浆液- 蒸馏水- 磷酸缓冲液- 蔗糖溶液- 高速冷离心机- 低速冷离心机- 离心管- 离心管架- 塑料吸管- 双室温度计- 分光光度计- 试管2.2 实验步骤步骤1：制备酵母酶提取液a) 将10ml新鲜酵母菌浆液倒入离心管中，并以1500rpm的速度在低温下离心10分钟。
b) 将上清液转移至另一个离心管中，再次进行高速离心，以去除细胞碎片。
步骤2：沉淀酵母蔗糖酶a) 将上一步中得到的上清液倒入一个含有7ml蔗糖溶液的试管中。
b) 在室温下孵育搅拌2小时，让酵母蔗糖酶与蔗糖结合形成沉淀。
c) 用低速离心将沉淀分离。
收集上清液备用。
步骤3：测定酵母蔗糖酶活性a) 在分光光度计中设置波长为540nm。
b) 取1ml上清液和1ml磷酸缓冲液混合，作为空白对照。
c) 另取1ml上清液和1ml含20%蔗糖溶液的试管中，作为实验组。
d) 在不同时间点（例如0、1、2、3、4分钟）测定两个试管的吸光度，并记录数据。
e) 计算酵母蔗糖酶的活性。
3. 结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功地提取了酵母蔗糖酶，并可以测定其活性。
根据测定结果，我们观察到酵母蔗糖酶在一定时间范围内对蔗糖的降解表现出线性增加的趋势。
这表明酵母蔗糖酶在一定程度上具有稳定的催化作用。
通过本实验，我们还可以根据酵母蔗糖酶的活性表征其在不同条件下的稳定性、催化效率和适应性。
我们可以改变温度和pH值，观察对酵母蔗糖酶活性的影响，从而了解其最适宜的操作条件。
通过进一步的研究，我们还可以探索酵母蔗糖酶在生物制药、食品加工和能源生产等领域的应用潜力。
总结回顾：通过酵母蔗糖酶的提取实验，我们深入了解了酵母蔗糖酶的结构、功能和应用前景。
实验5-酵母蔗糖酶的粗提及其比活力测定
六．实验方法
（一）粗提取酵母蔗糖酶 （1） 量取5g的面包酵母，分几次研磨（加入少 量石英砂）至粉状（注意：一定要研磨成匀浆状）， 再加入10-12mL的0.01mol/LPBS（pH 6.0），搅拌混合。 置于小烧杯中。 （2） 置于－20℃冰箱中，反复冻融1-2次。 注意：讲课前提前处理好材料，做好1 注意：讲课前提前处理好材料，做好1、2步骤的实验
实验六
酵母蔗糖酶的粗提及其比活力测定
目的： 一、目的：
1 学习和掌握从酵母中提取蔗糖酶的实验方法 2 学习和掌握测定蔗糖酶活性、比活力等实验 方法和技术。 3 学习和掌握测定蛋白浓度的实验方法和技术。
原理： 二、原理：
蔗糖酶活性及比活性测定原理 蔗糖酶在酵母细胞中存在着两种形式， 一种存在细胞膜外细胞壁中的高度糖基化的胞外 蔗糖酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，含有50 ％糖成分。该酶是蔗糖酶的主要形式。而另一种 是存在于细胞膜内侧细胞质中的低糖基化的胞内 蔗糖酶。蔗糖酶催化底物蔗糖分解成葡萄糖和果 糖。葡萄糖和果糖具有还原性，可与3，5 - 二 硝基水扬酸共热后被还原成棕红色物质，在一定 范围内，葡萄糖的含量和反应液的颜色强度成正 比例关系。 1
2 蔗糖酶蛋白含量的测定原理（略）
三．实验材料
酵母
四．仪器设备
（1）离心机4000~1000rpm 3-5台； （2） 752分光光度计（玻璃比色杯）5-6台； （3） 水浴锅2台； （4）冰箱1台； （5）电子天平3台，台式天平（离心平衡用）4台； （6）剪刀2把； （7）碾钵（1个/组）； （8）电炉 2-3个； （9）锅2-3个； （10）试管架等 准备冰块，恒温水浴锅，电炉。
40℃恒温水浴准确保温10min
100℃沸水浴准确加热5min，立即冷却 摇匀，以对照管作空白
酵母蔗糖酶的提取方法
酵母蔗糖酶的提取方法酵母蔗糖酶是重要的糖分解酶，它可以被用来制造蔗糖、糖精、酒精、淀粉、葡萄糖以及蔗糖衍生物。
因此，它在化工、食品、制药行业中有着重要的应用价值。
本文介绍了从发酵酵母或发酵液中提取酵母蔗糖酶的方法。
一、原料准备首先，准备发酵酵母或发酵液。
发酵酵母可以使用乳酸乳杆菌培养基发酵培养，得到的酵母菌可以悬浮在一定的温度和 pH 下曝气发酵，以获得最大的效果。
发酵液可以采用蔗糖和氨基酸等制备，并需要调节合适的 pH温度，可以提高酶的活性。
二、提取酵母蔗糖酶1.发酵酵母或发酵液放入滤器，用中压过滤来滤出悬浮体；2.过滤得到的酵母蔗糖酶悬浮液中加入NaCl，来降低活性；3.溶液中的毛细管类蛋白分离出来，加入45%的乙醇萃取分离；4.溶液冷冻至冰点，冻干抽滤以获得纯化的蔗糖酶；5. 从冻干抽滤物中继续利用膜精制器以及离子交换柱等方式，将蔗糖酶高纯度分离出来；6.高纯度蔗糖酶经过适当稀释处理，可获得最终产品。
三、性能测试为了判定提取的酵母蔗糖酶的性能，需要进行一系列的性能测试，这些测试可以用来检测酶的活性、热稳定性、抗菌性以及稳定性等。
通过这些测试，可以确定提取的酵母蔗糖酶的性能，从而确保它能够满足采用的要求。
四、应用实践酵母蔗糖酶的提取方法在实际应用中几乎是必不可少的，它可以用来生产糖浆、糖精、酒精、淀粉、葡萄糖以及蔗糖衍生物等，常用于食品加工、精细化工、制药行业等。
此外，这种提取方法还可以应用于糖类合成、氨基酸修饰等方面，发挥着重要的作用。
综上所述，酵母蔗糖酶是一种重要的糖分解酶，用于生产糖类衍生物，它的提取方法包括发酵酵母或发酵液的原料准备、提取、性能测试以及应用实践等，是一项重要的工作。
只有抓住机会，把提取的酵母蔗糖酶用好，才能实现糖分解酶的高效利用。
酵母蔗糖酶实验报告
一、实验目的1. 学习酵母蔗糖酶的提取方法。
2. 掌握酶活力测定的原理和方法。
3. 了解酶的专一性及其影响因素。
二、实验原理酵母蔗糖酶是一种能够催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。
本实验通过提取酵母细胞中的蔗糖酶，并在一定条件下测定其活力，以了解其催化活性。
三、实验材料与仪器材料：1. 酵母粉2. 蔗糖3. 缓冲液4. 斐林试剂5. 旋光仪仪器：1. 电子天平2. 研钵3. 移液器4. 恒温水浴锅5. 烧杯6. 试管7. 离心机四、实验步骤1. 酵母蔗糖酶的提取- 称取适量酵母粉，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆。
- 将匀浆转移至离心管中，离心分离，收集上清液即为酵母蔗糖酶提取液。
2. 酶活力测定- 取适量提取液，加入含有蔗糖的缓冲液，置于恒温水浴锅中保温。
- 定时取样，用斐林试剂检测反应液中的还原糖含量。
- 根据还原糖含量计算酶活力。
3. 酶的专一性实验- 将提取液分别与蔗糖、淀粉等底物反应，观察酶的催化活性。
- 对比实验结果，分析酶的专一性。
4. 影响酶活力的因素实验- 分别在酸性、中性、碱性条件下进行酶活力测定，观察pH对酶活力的影响。
- 分别在不同温度下进行酶活力测定，观察温度对酶活力的影响。
五、实验结果与分析1. 酶活力测定- 酵母蔗糖酶提取液在37℃、pH 6.8条件下，酶活力最高，约为0.5单位/毫升。
2. 酶的专一性实验- 酵母蔗糖酶对蔗糖具有特异性催化作用，而对淀粉无催化活性。
3. 影响酶活力的因素实验- 酶活力受pH和温度的影响较大。
在pH 6.8、37℃条件下，酶活力最高；在酸性或碱性条件下，酶活力明显降低；在低温条件下，酶活力较低。
六、实验结论1. 成功提取了酵母蔗糖酶，并测定了其活力。
2. 酵母蔗糖酶具有特异性催化作用，对蔗糖具有高效催化活性。
3. 酶活力受pH和温度的影响较大，适宜的pH和温度有利于提高酶活力。
七、实验讨论1. 本实验中，酶活力的测定方法较为简单，但结果准确可靠。
实验十四酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定课件
乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加 入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮 于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。
实验十四酵母蔗糖酶的提取纯化及活力
测定
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酶活力检测：
取试管若干支编号，各加入0.5mL 5%蔗糖 （pH4.6），每隔一管取100uL收集液，按先后顺 序分别加入上述含0.5mL 5%的蔗糖的试管中混匀， 置50℃水浴10min。再加入0.5mL 3,5-二硝基水杨 酸，于沸水浴中煮沸5min，用自来水冷却，直接 目测。即可确定酶活力高峰范围。
实验十四酵母蔗糖酶的提取纯化及活力
测定
13
装柱(层析柱规格1×20cm)： 装柱前先将柱下端的出水口关闭，加进5ml（约1/3柱床体 积） 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液，然后将处理 好的DEAE—Sepharose FF轻轻搅匀（注意不能太稀，也 不能太稠，刚好呈流质状态）沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续 加进柱内。注意不能带进气泡，待凝胶沉积约1-2cm后松 开层析柱出口，控制流速0.5ml/min；待柱内DEAE— Sepharose FF自然沉降至所需高度并分出水层后，吸去水 层，用玻棒将沉降界面搅匀，再加进处理好的DEAE— Sephadex至距层析柱上端4cm处为止（这时须保持 DEAE—Sepharose FF柱面平整）。用 50ml 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液装进洗脱杯，连通层析柱，进 行柱平衡，直到流出液与缓冲液的pH一致。
实验十四酵母蔗糖酶的提取纯化及活力
浙江大学生物化学实验甲 酵母蔗糖酶的制备及其动力学性质分析
酵母蔗糖酶的制备及其动力学性质分析一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于植物和微生物体内，专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。
酵母蔗糖酶分子量约270000D，pI约5．0，最适pH4．6，耐酸和热，50℃保温30min 仍具有相当的活力，最适温度37℃。
耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。
二、酵母蔗糖酶的分离纯化本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：甲苯抽提。
加热纯化。
乙醇分级沉淀。
纤维素柱层析分离纯化。
㈠、前三步分离纯化的原理如下：甲苯石英砂离心上层（甲苯层）：脂溶性物质酵母细胞破细胞中层（水层）：蔗糖酶，可溶性糖等研磨下层（沉淀）：细胞碎片、变性蛋白等取中层50水浴中使热不稳定蛋白变性上清：蔗糖酶、可溶性糖等（水层）保温30分钟沉淀：变性蛋白取上清加乙醇使蔗糖酶沉淀上清：杂蛋白及可溶性糖等冰浴中20分钟沉淀：蔗糖酶、杂蛋白等㈡、纤维素柱层析分离纯化的原理1、离子交换柱层析分离混合物的基本原理离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种根据待分离物质的阳或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附而将溶液中各组分分开的一种技术。
离子交换层析是一种液-固相层析技术。
其中，液相称洗脱液，固相的惰性支持介质称离子交换剂。
在离子交换剂上具有带电基团，不同的交换剂所具有的带电基团的电荷性质不同，如交换剂上的带电基团带正电荷，则可结合溶液（液相）中的阴离子，这样的交换剂称为阴离子交换剂，如DEAE纤维素、强碱型的离子交换树脂等。
反之，如交换剂上的带电基团带负电荷，则可结合溶液中的阳离子，这样的交换剂称为阳离子交换剂，如CM-纤维素、强酸性的离子交换树脂等。
离子与交换剂的静电结合作用具如下特点：选择性：离子所带的电荷越多，离子半径越小，越易结合。
遵循质量作用定理：对某一特定离子，随离子浓度的增大，则遵循质量作用定理向与交换剂结合方向进行可逆性：在一定条件下，结合在交换剂上的离子可被其它）离子取代而离开交换剂并随洗脱液流出层析柱。
蔗糖酶提取实验报告
1. 掌握从酵母中提取蔗糖酶的基本方法。
2. 了解酶的提取、纯化及活力测定的原理和操作。
3. 掌握酶活性测定的方法。
二、实验原理蔗糖酶（Invertase）是一种能够催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。
本实验采用酵母作为原料，通过破碎细胞、离心、沉淀、透析等步骤提取蔗糖酶，并对其进行活力测定。
三、实验材料与仪器材料：1. 酵母（安琪酵母粉）2. 蔗糖3. 葡萄糖4. 果糖5. 磷酸盐缓冲液（pH6.0）6. 3，5-二硝基水杨酸（DNS）仪器：1. 电子天平2. 离心机3. 恒温水浴锅4. 分光光度计5. 试管6. 烧杯7. 移液器1. 酵母细胞的制备：- 称取1g酵母粉，加入10ml磷酸盐缓冲液（pH 6.0），搅拌均匀，置于37℃恒温水浴锅中保温30分钟。
- 将保温后的酵母悬液以3000r/min离心10分钟，收集上清液。
2. 酶液的提取：- 向上清液中加入等体积的50%饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀，置于4℃冰箱中过夜。
- 将沉淀物以3000r/min离心10分钟，收集上清液即为粗酶液。
3. 酶液的透析：- 将粗酶液置于透析袋中，置于磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中透析过夜，以去除硫酸铵等小分子杂质。
4. 酶液的活力测定：- 取1ml蔗糖溶液（2%蔗糖溶液），加入1ml透析后的酶液，置于37℃恒温水浴锅中保温30分钟。
- 取0.5ml反应液，加入2ml DNS试剂，沸水浴5分钟。
- 取出后，加入4ml蒸馏水，在540nm波长下测定吸光度。
五、实验结果与分析1. 酶液活力测定结果：- 通过DNS试剂显色，根据吸光度计算出酶的活力。
2. 结果分析：- 通过对比不同处理条件下的酶活力，分析提取、纯化过程中酶活力的影响因素。
六、实验结论1. 通过本实验，成功从酵母中提取了蔗糖酶。
2. 酶的提取、纯化过程中，酶活力受到pH、温度、离子强度等因素的影响。
3. 透析法是一种有效的酶纯化方法，可以去除小分子杂质，提高酶的纯度。
生化综合实验-酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究
酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究一、蔗糖酶的制备1、提取称取14.997g干酵母粉于250ml小烧杯中，少量多次地加入50ml蒸馏水，搅拌均匀。
成糊状后加入1.499g乙酸钠、25ml乙酸乙酯，搅匀。
再于35℃恒温水浴中搅拌30min，然后补加30ml蒸馏水，搅匀，盖好，于35℃恒温过夜。
之后，1000r/min离心10min，抽取酯层后再次离心，得到无细胞提取液。
用1M HCl将其PH调至5.0，即可得到级分Ⅰ。
（取出3ml于冰箱中保存）2、热处理（1）盛有粗级分Ⅰ的离心管放入50℃水浴中保温30min，在保温过程中不断轻摇离心管。
（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，1000r/min离心10min。
（3）上清液即为热级分Ⅱ。
（取出3ml于冰箱中保存）3、乙醇沉淀将热级分Ⅱ转入小烧杯中，放入冰浴，逐滴加入等体积预冷的95%乙醇，同时轻轻搅拌（此过程共需30 min）。
然后在冰浴中静置10 min，以沉淀完全。
然后4℃，1000r/min离心10min。
倾去上清，并滴干。
将沉淀保存于离心管中，冷冻保存，此即级分Ⅲ。
二、蔗糖酶的纯化将3ml级分Ⅲ加入洗脱柱中进行梯度洗脱。
及洗脱峰图如下：三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定（一）还原糖含量测定1、各级分稀释倍数的确定级分Ⅰ：取50μl稀释至1.5ml（30倍）级分Ⅱ：取50μl稀释至1.5ml（30倍）级分Ⅲ：取50μl稀释至15ml（300倍）取20μl稀释至2ml（100倍）释100倍。
在上述表格中，Glu含量是由标准曲线求得的，E'=Glu含量*稀释倍数/（10 min*0.6 ml）Units=0.6 ml/Glu平均含量/2/10min/稀释倍数由洗脱峰可知，第二个和第三个峰最有可能是目标蛋白（第一个峰一般情况下是杂蛋备注：由测定数据可知，第二个峰不是目标蛋白，第三个峰为目标蛋白。
（二）蛋白质含量测定1、各级分稀释倍数的确定由以上数据可知，级分Ⅰ和级分Ⅱ不需稀释，级分Ⅲ需稀释5倍。
浙江大学生物化学实验甲 复件 酵母蔗糖酶的提取原理
酵母蔗糖酶的制备原理
一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介
蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于酵母中，如啤酒酵母、面包酵母，也存在于曲霉、青霉和毛霉等霉菌和细菌及植物中，可专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。
酵母蔗糖酶的分子量约270000D（因来源不同，分子量有差异），pI约5.6，最适pH4.6，耐酸和热，最适温度50℃。
耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。
二、酵母蔗糖酶的分离纯化
本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：甲苯抽提，加热纯化，乙醇分级沉淀，离子交换柱层析分离纯化。
前三步分离纯化的原理如下：
甲苯石英砂离心上层（甲苯层）：脂溶性物质
酵母细胞破细胞中层（水层）：蔗糖酶，可溶性糖等
研磨下层（沉淀）：细胞碎片、变性蛋白等
取中层50℃水浴中上清：蔗糖酶、可溶性糖等
（水层）保温30分钟沉淀：变性蛋白
取上清加乙醇使蔗糖酶沉淀上清：杂蛋白及可溶性糖等
冰浴中20分钟沉淀：蔗糖酶、杂蛋白等
三、蔗糖酶活力的测定原理
蔗糖酶
蔗糖葡萄糖+ 果糖(G和F都具半缩醛羟基，该半缩醛羟基可被pH4.5~5.5 氧化为羧基，这样的糖称还原糖)
OH -
还原糖+ 3，5-二硝基水杨酸糖酸+ 3-氨基-5-硝基水杨酸
△（棕红色，540nm处具特征光吸收，OD值与
还原糖含量成正比，可据此进行比色测定）蔗糖酶活力单位定义：一定条件下（50℃，pH4.6），一分钟内能产生1mg 还原糖的酶量。
有不舒服记得找医生，千万不要小不舒服酿成大问题。
酵母蔗糖酶的提取及性质测定
酵母蔗糖酶的提取及性质测定引论及原理酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究中有重要意义。
本实验属综合性实验，接近研究性实验，包括八个连续的实验内容，通过对蔗糖酶的提纯和性质测定，了解酶的基本研究过程；同时掌握各种生化技术的实验原理、基本操作方法。
本实验技术多样化，并且多个知识点互相联系，实验内容逐步加深，构成了一个综合性整体，为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。
蔗糖酶（invertase ）（β—D —呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
每水解1mol 蔗糖，就生成2mol 还原糖。
还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson 比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。
在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。
酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。
常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。
酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。
啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。
本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。
一、蔗糖酶的提取与部分纯化（一）实验目的学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。
（二）实验原理（略） （三）实验仪器、材料及试剂 仪器1. 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱2. 电子天平、研钵（＞200ml ）、制冰机、50ml 烧杯3. 离心管（2ml ，10ml ，30ml 或50ml ）、移液器（1000ul ）或滴管、量筒 材料及试剂1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存）＋ H 2O 蔗糖酶O HH O2.石英砂（海沙）、甲苯（使用前预冷到0℃以下）3.95%乙醇（预冷－20℃）、去离子水（使用前冷至4℃左右）4.Tris-HCl（pH7.3）缓冲液（四）操作步骤1. 提取（1）将市售鲜啤酒酵母2000 rpm，离心10 min，除去大量水分。
实验十四___酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定
2.热处理 将上步所得上清液转入50 ml离心管，迅 2.热处理 将上步所得上清液转入50 ml离心管，迅 速放入50℃恒温水浴中，保持30分钟，并用玻璃 速放入50℃恒温水浴中，保持30分钟，并用玻璃 棒温和搅动抽提液，迅速用冰浴冷却，10000rpm 棒温和搅动抽提液，迅速用冰浴冷却，10000rpm 离心10分钟，弃去沉淀，测量上清液体积，留 离心10分钟，弃去沉淀，测量上清液体积，留 1.0ml (Ⅱ样品)测定此酶活力和蛋白浓度。 (Ⅱ样品) 3.酒精沉淀 将热处理后的上清液，加入相同体积 3.酒精沉淀 的-20℃95％乙醇，冰浴中温和搅动，（注意边搅 20℃95％乙醇，冰浴中温和搅动，（注意边搅 慢加，滴加乙醇时滴与滴之间不能连成线！！！） 放置30min，然后10000rpm离心10min，弃去上清 放置30min，然后10000rpm离心10min，弃去上清 液，试管中沉淀放置冰箱保存或将酒精处理后的 沉淀溶于7ml 沉淀溶于7ml 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3 buff(Ⅲ样 Tris-HCl、 buff(Ⅲ 品，留1.0 ml样液测活)，上样前用7ml离心管 品，留1.0 ml样液测活)，上样前用7ml离心管 5000rpm离心10min，待上样。 5000rpm离心10min，待上样。
甲液：溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10％NaOH溶液中，并用水稀释至 甲液：溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10％NaOH溶液中，并用水稀释至 69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。 69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。 乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加 乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加 入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮 1%3,5-二硝基水杨酸溶液. 乙二溶液相混合即得黄色试剂, 于棕色瓶中备用,在室温放置7 10天以后使用。 于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。
实验十四---酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定
甲液：溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10％NaOH溶液中，并用水稀释至 69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。
乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加 入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮 于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。
2021/4/9
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DEAE-Sepharose F F柱预先用20mmol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 平衡(约30ml流出液即可)，以流出液pH 与 buff 一致为准。上样后，用20 m mol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 进行NaCl梯度洗脱(NaCl 为0.5mol/L),层 析柱连上梯度混合器，混合器中分别为50ml、 20mmol/L Tris-HCl, pH7.3缓冲液和50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓冲液，其中含0.5mol/L NaCl。
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七、实验关键步骤：（以下各步骤除热处
理一步外，尽可能低温）
第一部分 样品的制备：
1.称取10.0克干酵母粉于研钵内，加3.0克石英砂， 10ml buff（先量取总体积buff30 ml），在研钵内研 磨成糊状，约30分钟，再分次加buff 10ml并研磨 10分钟，, 研磨时间大约60分钟。转入50mL离心管， 12000r/min离心10分钟，取上清液，并量取体积， 留1.0ml 上清液(定为第一步骤的样品Ⅰ)，用于测 定酶活力和蛋白浓度。
实验三十八 (9)酵母蔗糖酶的提取
思考题
举例说明在细胞破碎和粗分级操作中还有哪些常
用方法，分析各方法的优缺点。
3．乙醇分级沉淀初分离
• 粗级分I 和II分别通过乙醇分级沉淀进行粗分离。 （1）32%乙醇浓度沉淀除杂
• 用4mol/L稀醋酸调粗级分pH至4.5，测量体积V后转入烧杯， X 按V X 0.32 计算所需乙醇体积X1，在磁力搅拌器上用分液漏 斗往烧杯中滴加冰乙醇，使乙醇浓度为32%。加完后继续搅 拌5 min。转移至离心管中8000 r/min离心10min。(V为扣除留
实验步骤（本实验分4组进行）
1、自溶法提取蔗糖酶(1组、2组)
称取10 g酵母粉于烧杯中，加入30ml 0.5mol/L氨水与之 混合，再加入3.5 ml甲苯，混合均匀，然后用磁力搅拌 器在室温下搅拌16-20 h完成自溶。测量自溶液体的体积 ，然后加入1.5倍体积的水，用4 mol/L醋酸调pH至5.8， 倒入离心管中于8000 r/min离心15 min，所得上清液称为 “粗级分II”，测量其总体积V2，并留下5 ml用于蔗糖酶 活力测定。 由于自溶时间需16-20 h，该步骤由上个班的同学完成， 可以直接从测量体积步骤开始，实验结束需为下个班的 同学准备自溶样品。
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样的5 m后的体积)
（2）47.5%乙醇浓度沉淀蔗糖酶 • 取出上清液转入烧杯，按 计算使乙醇浓度达到47.5% 所需乙醇体积X2，按X2-X1算出需补加无水乙醇的体积。在 磁力搅拌器上用分液漏斗往烧杯中缓慢滴加冰乙醇使其浓度 达到47.5%。转入离心管中，8000r/min离心10min。弃去上清 液，粗级分I 和II在此步产生的沉淀分别用10ml和20ml pH5.8 的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，得到“粗级分Ⅲ”和“粗级分Ⅳ”， 分别测量其总体积V3和V4，并进行蔗糖酶活力测定。
实验十四___酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定
五、实验的主要仪器
1．冷冻离心机 2．研钵 3．恒温水浴箱 4．-20℃冰箱 5．梯度混合器 6．层析柱 (1×20cm)
六、实验操作流程
干酵母粉→加缓冲液研磨→离心→热处理→酒 精沉淀→离心→上清夜→上DEAE—Sepharose FF 柱→层析→活力检测
七、实验关键步骤：（以下各步骤除热处
Hale Waihona Puke 离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子 交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离 子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以 离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团 对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过 程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质 所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就 有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提 高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂 的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一 被洗脱下来，达到分离的目的。
DEAE-Sepharose F F柱预先用20mmol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 平衡(约30ml流出液即可)，以流出液pH 与 buff 一致为准。上样后，用20 m mol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 进行NaCl梯度洗脱(NaCl 为0.5mol/L),层 析柱连上梯度混合器，混合器中分别为50ml、 20mmol/L Tris-HCl, pH7.3缓冲液和50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓冲液，其中含0.5mol/L NaCl。
酶活力检测：
取试管若干支编号，各加入0.5mL 5%蔗糖 （pH4.6），每隔一管取100uL收集液，按先后顺 序分别加入上述含0.5mL 5%的蔗糖的试管中混匀， 置50℃水浴10min。再加入0.5mL 3,5-二硝基水杨 酸，于沸水浴中煮沸5min，用自来水冷却，直接 目测。即可确定酶活力高峰范围。
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1、学习酶的纯化方法，酶蛋白分离提纯的原理。
2、学习掌握细胞破壁、有机溶剂分级和离子交换柱层 析技术。
本实验可以为大家提供一个较全面的实践机会，学 习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质， 尤其是动力学性质作初步的研究。
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实验原理
自1860年Bertholet从啤酒酵母（Sacchacomyces Cerevisiae）中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗 糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶） （EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的β-呋喃果糖苷键水解， 具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催 化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。
2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上
下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用
于量少和动物脏器组织。
3、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞
内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
4、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破
外酶 27万 50% 双 26mM
150 mM 5.0 4.9 3.0-7.5 60℃
内酶13.5万 ＜3% 双 25mM
150 mM 5.0 4.5 6.0-9.0 60℃
实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗 糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量 定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位 数。
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本实验共有三个分实验：
一、蔗糖酶的提取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定
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（一）蔗糖酶的提取与部分纯化
细胞破壁的几种方法
1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，
将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
称为“粗级分I”。
2. 热处理
（1）预先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥
地放入水浴中，50℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离
心管。
（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，4700rpm，
离心15min。
（3）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力
及蛋白质含量（称为“热级分I医I学p”p）t 。
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本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵
母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶，
其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。
在细胞酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组
成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的
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离子交换层析
利用不同的蛋白质分子在溶液中所帶电荷 不同，因而与离子交换树脂有不同之吸附力
而分离之
改变溶液的pH值和盐离子浓度，结合力最小 的蛋白质先洗脱下来。
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离子交换层析(sephorase DEAE fast flow)
离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚 糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白 质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。
明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。
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（6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的 离心管中，4℃，4700rpm，离心15min。
（7）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力
及蛋白含量。剩余部分转入清洁离心管中。
（8）用广泛pH试纸检查清液pH，用1M乙酸将pH调至5.0，
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3. 乙醇沉淀 将热级分II转入小烧杯中，放入冰浴（没有水的碎冰撒入
少量食盐），逐滴加入等体积预冷至-20℃的95%乙醇，同时 轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰浴中放置10分钟，以沉淀完全。 于4℃，4700rpm，离心15min，量出体积，留出1.5ml （下次实验测定酶活力）后倾去上清，沉淀用2ml 0.02M pH7.3的Tris-HCl缓冲液充分溶解，保存于离心管中，盖上盖 子，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“醇级分Ⅲ”）。
裂，此法多适用于微生物材料。
5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠
（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理
效果更好。
6、有机溶剂沉淀法：即向水溶液中加入一定量的亲水性的有机溶剂可降低
溶质的溶解度使其沉淀被析出。 医学ppt
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操作步骤
（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。 （2）称取2g干啤酒酵母，称10mg蜗牛酶及适量（约4g） 二氧化硅，放入研钵中。二氧化硅要预先研细。 （3）量取预冷的甲苯12ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊 状，约需60分钟。研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细 胞大部分研碎。 （4）缓慢加入预冷的20ml去离子水，每次加2ml左右，边加 边研磨，至少用30分钟。以便将蔗糖酶充分转入水相。 （5）将混合物转入1个离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机 离心，4℃，4700rpm，15min。如果中间白色的脂肪层厚，说
分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内
酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物
专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外
酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要
是外酶。
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两种酶的性质对照表如下：
名称 MW 糖含量 亚基 为蔗糖的Km 为棉子糖的Km pI 最适pH 稳定pH 最适温度
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亲和层析
利用分子与其配 体间特殊的、可逆性 的亲和结合作用而进 行分离的一种层析技 术。可以选用生物化 学、免疫化学或其他 结构上吻合等亲和作 用而设计的各种层析 分离方法。
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凝胶过滤层析
利用一定大小孔隙的具有 网状结构的凝胶作层析介 质（如葡聚糖凝胶、琼脂 糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 等），根据被分离物质的 分子大小、形状不同扩散 到凝胶孔隙内的速度不同， 因而通过层析柱的快慢不 同而分离的一种层析法。