RT-PCR引物设计及注意事项
实验四-逆转录PCR-(RT-PCR)
实验四逆转录PCR (RT-PCR)【实验目的】1．了解用逆转录PCR法获取目的基因的原理。
2．学习和掌握逆转录PCR的技术和方法。
【实验原理】聚合酶链式反应〔PCR〕过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA序列。
因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增长的过程，使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。
一般经25-35轮循环就可使模板DNA扩增达106 倍。
RT-PCR将以RNA为模板的cDNA〔complement DNA〕合成〔即RNA的反转录〔RT，reversetranscription〕〕，同cDNA的PCR 结合在一起的技术，提供了一种基因表达检测、定量和cDNA克隆的快速灵敏的方法。
由于cDNA包括了编码蛋白的完整序列而且不含内含子，只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究，因此RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。
RT-PCR的基本原理〔图〕。
首先是在逆转录酶的作用下从RNA合成cDNA，即总RNA中的mRNA 在体外被反向转录合成DNA拷贝，因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模板mRNA，称之为互补DNA 〔cDNA〕；然后再利用DNA聚合酶，以cDNA第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸〔dNTP〕为材料，在引物的引导下复制出大量的cDNA或目的片段。
在RT时，有3种引物可选择〔表4.1) 。
用1〕和2〕方法，理论上是扩增的所有的cDNA，还要用此产物做PCR的模板继续扩增。
如果用3〕方法，先要去:// 查它的序列，并用oligo 等软件设计引物。
RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。
RT-PCR操作流程及其相关注意事项
RT-PCR一知识背景：1、基因表达：DNA RNA Protein2、PCR技术(Polymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。
在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。
反应分三步：A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。
C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘ 3’方向延伸。
以上三步为一个循环，如此反复。
3、逆转录酶和RT-PCR逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；2、RNase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.4、引物的设计及其原则：引物的特异性决定PCR反应特异性。
尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
a、引物长度:一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。
b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。
GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm 值减去5～10度。
c、3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。
末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3’端最好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的T。
d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。
RT–PCR的原理及实验步骤
RT –PCR的原理及实验步骤一、RT –PCR的原理RT -PCR即逆转录-聚合酶链反应。
原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：(1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；(3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
二、RT-PCR的准备：1.引物的设计及其原则：(1)引物的特异性决定PCR反应特异性。
因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。
在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。
尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
(2)引物设计原则的把握：引物设计原则包括:a.引物长度:一般为15～30 bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。
b.碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。
GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。
c.3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。
标准操作规程(SOP)——流感禽流感病毒 RT-PCR 引物制备
RT-PCR 引物制备，用于流感/禽流感病毒RT-PCR 检测，确保RT-PCR 检测结果的可靠性。
二、范围
适用于中国国家流感中心所有技术人员对疑似流感/禽流感病毒感染标本进行RT-PCR 检测。
三、程序
（一）引物合成
六合通（大连宝生物）或同类公司合成，PAGE 纯化。
（二）引物配制
1．10×储存液配制：
（1）将新合成的引物在开盖前短暂离心（12000rpm ，15s ）。
（2）用RNase Free Water 溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100pmol/μL ，即100μM 。
（例如：合成引物2OD ，9.5nmol ，则加水量为10×9.5＝95μL 。
）
2．引物使用浓度配制：将100μM 的引物浓度再10倍稀释，配成浓度为10μM ，即可直接用于PCR 反应。
（三）引物保存
1．引物未溶解前4℃保存。
2．引物溶解之后-20℃或-20℃以下保存。
注意：引物配制前，先将引物管短暂离心，以免引物丢失。
一、目的标准操作规程（SOP 毒RT-PCR。
逆转录RT-PCR操作注意事项
逆转录RT-PCR操作注意事项RT-PCR操作有三步：第一，RNA提纯；第二，RT逆转录；第三，PCR聚合酶反应1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2.RT按要求做，一般不会出太大问题。
3.PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计有3种方法:a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；c：特异的下游引物。
如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？1.RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。
但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。
（promega）。
2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5'，3'RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。
3.RACE我做过RACE（3'RACE是宝生物的Kit；5'RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3'RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3'UTR却怎么也扩不出来，我推测是不是该基因的3'UTR太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。
RTPCR原理和实验步骤
RT—PCR原理与实验步骤一、知识背景：1、基因表达：DNA RNA Protein单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d,可以合成105个丝心蛋白) 共合成109个丝心蛋白。
因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。
2、PCR技术(Polymerase chain reaction）：即聚合酶链式反应。
在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。
反应分三步：A。
变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；B.退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合.C。
延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5’3’方向延伸。
以上三步为一个循环,如此反复。
3、逆转录酶和RT-PCR逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶,至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链;2、Rnase水解活性：水解RNA：DNA杂合体中的RNA；3、依赖DNA的DNA聚合酶活性:以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA。
二、RT—PCR的准备:1。
引物的设计及其原则：1）引物的特异性决定PCR反应特异性.因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。
在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型,不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。
尽量选择覆盖相连两个内含子的引物,或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
2) 引物设计原则的把握引物设计原则包括：a、引物长度：一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度,也影响反应的特异性。
RT-PCR实验报告
逆转录pcrrt-pcr 为反转录rcr（reverse transcription pcr）和实时pcr（real time pcr）共同的缩写。
逆转录pcr，或者称反转录pcr(reverse transcription-pcr, rt-pcr)，是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。
在rt-pcr 中，一条rna链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr进行dna扩增。
由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作“逆转录”，由依赖rna的dna聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的pcr。
原先的rna模板被rna酶 h降解，留下互补dna。
rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna。
rt-pcr广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna的含量。
（检测基因表达的方法，参见northern blot法。
）rt-pcr有时候也会指代实时pcr(real-time pcr)。
为了与逆转录pcr相区别，通常被写作“定量pcr”(quantitative pcr)或者rtq-pcr(real-time quantitative pcr)。
实时pcr实时pcr(real-time pcr)，属于定量pcr（q-pcr）的一种，以一定时间内dna的增幅量为基础进行dna的定量分析。
real time pcr 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。
一种是在ds dna中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。
real time pcr 与 reverse transcription pcr 相结合，能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种rt pcr 的组合又被称之为“定量rt-pcr（quantitative rt-pcr）”rt-pcr技术相关试剂oligo: 多聚体，相当于mrna引物amv（m-mlv）：逆转录酶dntp：脱氧核苷酸rnase：rna酶抑制剂pcr buffer：rt-pcr缓冲液mgcl2：2价镁离子pcr各步骤的目的（一）预变性：破坏dna中可能存在的较难破坏的二级结构。
RT-PCR法则 PCR引物设计
PCR引物设计的11条黄金法则DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该引物长度（primer length）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的．．．．．．．．．．．．GC．．含量不能相差太大．．。
另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。
降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
引物自身．．不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间．．．．．也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer 与Cross dimer）的形成。
RT-PCR实验报告
逆转录pcrrt-pcr 为反转录rcr（reverse transcription pcr ）和实时pcr（real time pcr）共同的缩写。
逆转录pcr，或者称反转录pcr(reversetranscription-pcr, rt-pcr)，是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。
在rt-pcr中，一条rna链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr进行dna扩增。
由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作“逆转录”，由依赖rna的dna聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的pcr。
原先的rna模板被rna酶 h降解，留下互补dna。
rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna。
rt-pcr广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna的含量。
（检测基因表达的方法，参见northern blot法。
）rt-pcr有时候也会指代实时pcr(real-time pcr)。
为了与逆转录pcr相区别，通常被写作“定量pcr”(quantitative pcr)或者rtq-pcr(real-time quantitative pcr)。
实时pcr 实时pcr(real-time pcr)，属于定量pcr（q-pcr）的一种，以一定时间内dna的增幅量为基础进行dna的定量分析。
real time pcr 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。
一种是在ds dna中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。
real time pcr 与 reverse transcription pcr 相结合，能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种rt pcr的组合又被称之为“定量rt-pcr（quantitative rt-pcr）”rt-pcr技术相关试剂oligo: 多聚体，相当于mrna引物amv（m-mlv）：逆转录酶dntp：脱氧核苷酸rnase：rna酶抑制剂pcr buffer：rt-pcr缓冲液mgcl2：2价镁离子pcr各步骤的目的（一）预变性：破坏dna中可能存在的较难破坏的二级结构。
设计RTPCR引物方法
设计RTPCR引物方法设计RT-PCR引物方法要鉴定某一个基因在mRNA水平上的表达，需要使用Q-PCR的方法。
引物设计是很重要的一环，要进行Q-PCR时，获得引物的途径有很多种，其中最为方便的是使用NCBI和primer bank，首先介绍这一方法：比如你要检测某药物对小鼠细胞中IL-2的表达影响，通过Q-PCR检测，要设计引物。
①登陆NCBI，选择gene，在选框中输入 IL-2 mus（搜索小鼠IL-2基因）点击搜索获得结果如下：选择第一个基因，打开，可以获得gene的ID利用primer bank和ncbi的gene ID就可以获得前人已经设计好的引物②登陆primer bank （），按下图选择NCBI gene ID 选择物种mouse ，在for text中输入前面获得的你要检测基因的ID （NCBI的编号）点击submit 查询，获得如下结果可以看到其它人设计的好几对引物，基本上是通过实验验证的，做Q-PCR的话直接拿来用就行了，点击绿色高亮的链接可以看到其他人使用这对引物做Q-PCR获得的结果。
二、自己设计Q-PCR引物方法比如要检测CXCR3的表达，做Q-PCR的扩增目的条带在100bp 左右，如果半定量的话（通过跑胶定量）扩增产物一般400bp左右①登陆NCBI，选择gene，在选框中输入 CXCR3 mus（搜索小鼠CXCR3基因）点击搜索点击打开将网页往下拖到NCBI reference sequence 选择箭头所示mRNA 序列打开链接往网页下方拖动，可以看到CDS，点击CDS（编码蛋白区）出现如下界面，高亮部分为CDS去ATG起始密码子TAA终止密码子复制CDS区及其附近部分序列，如果要提取基因的话需要完全包括CDS区，如果只是检测的话，比如半定量的话就没必要全部包括。
打开primer 5 软件，新建一个DNA序列将复制的序列粘贴到选项框中，点击oK序列就导入了primer 5中，然后单击箭头所指primer，进入引物设计界面界面如下，点击search，使用primer自动寻找引物功能进入界面后，分别按下图选取所需要的参数，PCR product size 使用默认值即可，primer length一般在20bp左右比较合适点击OK后进入如下界面，点击OK出现如下界面，点击rating，按打分排列，打分是100分制，分值越高引物越好，根据自己试验目的，选择打分高的，产物片段400bp左右的引物对，并且Tm温度最好在60以上，有义链和反义链Tm值靠的越近越好，最好不要超过2摄氏度，下图中Tm行中蓝色字体表示有义链的Tm值，红色字体表示反义链Tm值，PCR 退火温度一般设置比Tm值低5摄氏度。
RTPCR引物设计原则和方法
RT—PCR引物设计原则与方法近刚开始做ＰCR,参考了很多与引物设计相关得帖子,结合自己使用pｒimer5与ｏｌiｇｏ得体会,想谈谈自己设计引物得方法与步骤,恳请各位前辈指正、ﻫﻫRT—PＣＲ引物设计原则与方法ﻫﻫ在NCB Ｉ上搜索到该基因,找到该基因得mRNA,在ＣDS选项中,找到编码区所在位置,在下面得orｉｇin 中,Coｐy该编码序列作为软件查询序列得候选对象。
ﻫ打开Ｐrimer Pｒemiｅr5,点击sequence, 出现输入序列窗口,Ｃｏｐy目得序列在输入框内(选择As),此窗口内,序列也可以直接翻译成蛋白。
点击Ｐriｍer,进入引物窗口。
ﻫﻫ此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果"选项,点击Sｅarｃｈ按钮,进入引物搜索框,选择“ＰCＲ pｒi ｍｅrs”,“Ｐairs”,设定搜索区域与引物长度与产物长度。
在Search Parａmeters里面,可以设定相应参数。
一般若无特殊需要,参数选择默认即可,但产物长度可以适当变化,因为1０0～200bp得产物电泳跑得较散,所以可以选择300～500bp。
ﻫ点击OK,软件即开始自动搜索引物,搜索完成后,会自动跳出结果窗口,搜索结果默认按照评分(Rating)排序,点击其中任一个搜索结果,可以在“引物窗口"中,显示出该引物得综合情况,包括上游引物与下游引物得序列与位置,引物得各种信息等。
ﻫ对于引物得序列,可以简单查瞧一下,避免出现下列情况:３’端不要以Ａ结尾,最好就是Ｇ或者C,T也可以;3'不要出现连续得３个碱基相连得情况,比如ＧGG或 CCC,否则容易引起错配。
此窗口中需要着重查瞧得包括:Tm应该在５5~70度之间,GC%应该在45%～55％间,上游引物与下游引物得Tm 值最好不要相差太多,大概在2度以下较好。
该窗口得最下面列出了两条引物得二级结构信息,包括,发卡,二聚体,引物间交叉二聚体与错误引发位置。
RT-PCR引物设计及注意事项
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一、步骤 1.查找目的基因序列
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目的序列的选择
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TNFalpha用全称
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小鼠的TNFalpha序列
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大鼠的TNFalpha序列
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一、步骤 2.在线设计引物
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rt-pcr引物设计及注意事项 (定量100-300,定性300-500bp) 飞跃科技 分享于 2020-10-14 12:40:38.0 rt-pcr引物设计及注意事项 文档格式: .ppt 文档页数: 39页 文档大小: 5.53m 文档热度: 文档分类: 高等教育 -- 教育学 文档标签: rt-pcr引物设计及注意事项 系统标签: pcr tnfalpha 事项 注意 gdna 序列D来自18D19
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一、步骤 3.在线验证引物
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二、注意事项
1. 找对靶序列(要cDNA，不要gDNA) 2. 引物的位置(5’调控区、阅读框、3‘调控区) 3. 目的片段的长度(定量100-300，定性300-
500bp)
4. 注意剪接异构体(P63为例)
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反转录PCR-步骤和方法
反转录PCR科技名词定义中文名称：反转录PCR英文名称：reverse transcription PCR;RT-PCR定义：扩增mRNA的一种实验技术。
先将mRNA反转录成cDNA，然后再以cDNA为模板，用PCR方法加以扩增。
应用学科：遗传学（一级学科）；基因组学（二级学科）以上内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布目录四、注意事项RT-PCR反应原理[1]反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）又称为逆转录PCR。
其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。
RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA 病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。
编辑本段一、反转录酶的选择1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA 酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
RTPCR的实验原理与操作步骤
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
(一) 反转录酶的选择1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。
(二) 合成cDNA引物的选择1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于 rRNA。
2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。
由于Poly(A )RNA仅占总RNA 的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。
rt pcr的常用方法
rt pcr的常用方法rt-PCR( real-time PCR )是一种用于检测和定量新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸的技术。
下面是 rt-PCR 的常用方法及其拓展:1. 设计引物:rt-PCR 的第一步是设计引物。
引物是探针分子,用于结合目标核酸,并用于在 rt-PCR 中扩增目标核酸。
引物的质量和准确性对 rt-PCR 的结果至关重要。
通常,引物由两个互补的短链组成,分别位于引物的两端。
引物的长度和结构可以影响 rt-PCR 的反应时间和结果。
2. 提取核酸:从患者或样本中提取足够的核酸是 rt-PCR 的第一步。
通常,需要使用核酸提取试剂盒,将患者或样本中的核酸提取出来。
核酸提取的准确性和效率对 rt-PCR 的结果也有很大的影响。
3. 混合核酸:将提取的核酸与引物一起混合,并使用 rt-PCR 试剂盒进行扩增。
扩增过程中,引物将与目标核酸结合,并生成一个反应物。
这个反应物可以在rt-PCR 中测量,并计算出病毒的数量。
4. 控制温度和湿度:rt-PCR 的反应需要一定的温度和湿度条件。
通常,需要使用专门的 rt-PCR 设备,并将设备放置在适当的温度和湿度环境中。
这有助于提高 rt-PCR 的准确性和效率。
5. 数据分析:一旦扩增了目标核酸,就需要对数据进行分析。
通常,使用rt-PCR 数据分析软件对数据进行处理和可视化。
这可以帮助确定扩增是否成功,并确定病毒的数量。
rt-PCR 是一种快速、准确和灵敏的方法来检测和定量新型冠状病毒。
通过设计合适的引物,提取足够的核酸,并将核酸与引物一起混合,并控制温度和湿度,可以提高 rt-PCR 的准确性和效率。
组织RT-PCR注意事项
1.抽提RNA都是为了得到其mRNA，而mRNA和组织的状态密切相关，因此需要超低温的状态，一般选择用液氮保存组织。
而且去的时候要尽可能的新鲜，动作要快，取后立即放入液氮罐中。
2.提取RNA前要对脑组织进行研磨，切记要在液氮中进行，也是为了防止rna的降解。
研磨要充分，使组织块变小。
3.加入trizol后要充分吹打开，目的是使组织中的核蛋白体，多糖等与rna分离。
4.其次是注意外源性的rna酶污染，操作全过程要戴口罩，手套。
操作速度要快，冰上进行。
我做过大鼠下丘脑组织的RT-PCR，在动物房将组织取好先放在RNa－free的EP管中，放在冰盒内，然后再转移到实验室的－70°冰箱内，在抽RNA的时候，脑组织最好要氯仿抽提两次，这个是我在别的地方看到的，但是真的很好用，可以改善RNA抽提的质量。
用生理盐水或PBS冲洗掉血液，分切成50-100mg大小的组织块，早点把提RNA的试剂盒买过来就可以根据说明书加入变性液中（ep管内），－80储存，到时候拿出来组织就很容易撵碎了。
如果试剂盒没到，那就直接放在EP管中，提RNA的时候再拿出来再加也可以。
就是组织可能会不容易撵碎一些。
我觉得你可以用高压过的EDPC处理的水进行清洗（2－3次），后迅速切成合适的大小的组织（具体大小与RNA提取方法相关，我用的是TRNZOL法，一般取50－100mg，）于EP管中，直接放到－80度冰箱，不需要液体浸泡！到时直接取出提取RNA即可！建议你的剪刀、镊子等物品最好DEPC处理过！1.组织块若没有很多血液，可直接冻存；2.若有较多血液，可用生理盐水冲洗；3.我以前取小肠组织时，先剪开自来水冲洗，再生理盐水冲洗；4.一般1cm左右就可以，根据标本将来的用途。
5.直接原组织冻存。
本实验室做过人子宫内膜FGF基因的克隆，方法是从子宫肌瘤切除的人子宫中撕下新鲜内膜组织，冻存与液氮总备用，实验前在液氮中充分研磨后提取总RNA。
RT-PCR引物设计原则和方法
RT—PCR引物设计原则和方法近刚开始做PCR，参考了很多与引物设计相关的帖子,结合自己使用primer5和oligo的体会，想谈谈自己设计引物的方法和步骤，恳请各位前辈指正。
RT-PCR引物设计原则和方法在NCBI上搜索到该基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置,在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
打开Primer Premier5，点击File-New—DNA sequence，出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As),此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。
点击Primer,进入引物窗口。
此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮,进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度.在Search Parameters里面,可以设定相应参数。
一般若无特殊需要，参数选择默认即可,但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300~500bp。
点击OK，软件即开始自动搜索引物,搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况,包括上游引物和下游引物的序列和位置,引物的各种信息等。
对于引物的序列，可以简单查看一下,避免出现下列情况：3’端不要以A结尾，最好是G或者C，T 也可以;3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。
此窗口中需要着重查看的包括:Tm应该在55～70度之间，GC％应该在45%～55%间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。
该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置.若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮,即可看到相应二级结构位置图示。