荧光免疫技术

过量结合荧光素的抗体。
肝粉吸收法
用于去除交叉反应抗体或非期
望抗体等非特异反应抗体。
三、荧光抗体的鉴定 1. 抗体效价
抗体效价可用琼脂双扩法进 行滴定，效价大于1:16较为理想。
2.荧光素与蛋白质的结合比率（F/P）
将制备的荧光抗体稀释至A280≈ 1.0，
分别测读A280（蛋白质特异性吸收峰） 和标记荧光素的特异吸收峰，按公式 计算。
荧光免疫技术
彭晓东
概 念
荧光免疫技术（fluoroimmunoassay）
将免疫学反应的特异性与荧光技术
的敏感性结合起来的一种方法。 荧光抗体技术（fluorescent antibody technique）
来自百度文库
以荧光物质标记抗体进行抗原定位的技术。
特 点
直观
定位性
快速、敏感
传统荧光抗体技术的基本原理
荧光显微镜观察
一、标本的制作
常见临床标本：组织、细胞、细菌 制作成的标本：切片、涂片、印片
要求：
保持抗原的完整性； 保持抗原的定位性；
标本切片尽量薄，以利于抗原抗体
充分接触以及镜检； 尽量除去影响抗原抗体反应的物质。
标本的固定
目的
（ 1 ）防止细胞或切片从玻片上脱落； （2）除去组织中妨碍抗原抗体结合 的类脂质； （3）易于保存。
二、标记抗体的纯化
目的 去除未结合的游离荧光素
去除过度标记的蛋白 去除非特异反应抗体
方法
透析法 将标记物置于透析袋中透析；适 用于蛋白含量低的标记物 凝胶过滤法
常用Sephadex G50凝胶，洗脱第 一峰为结合蛋白峰，第二峰为荧光素 峰。
离子交换层析法 依次洗脱下来的成分是未结合荧 光素的抗体、荧光标记合适的抗体、
蛋白质 荧光素缓冲液
荧光素标记蛋白质 PBS
适用于标记量少，蛋白含量低的抗体溶液。
特点: 标记较均匀，非特异性染色也较低。
影响荧光素与抗体结合的因素
1 PH值：常用PH7.4 ～8磷酸缓冲液及
PH9 ～9.5碳酸盐缓冲液。
2 温 度：常用20℃～25℃，大于25℃有
猝灭作用。
3 荧光素与蛋白的浓度比例： 最适为1:100～1:150 4 猝灭剂的影响
（FITC）F/P=
（RB200）F/P =
2.87×A495 A280-0.35×A495
A515 A280
F/P值越高，说明抗体分子上结合的
荧光素越多，反之越少。一般用于固定标 本的荧光抗体以F/P=1.5为宜，用于活细 胞染色的以F/P=2.4为宜。
免疫荧光显微技术
基本原理：
荧光抗体 - 抗原（组织或细胞）
试剂
95% 乙醇、甲醇、丙酮、 10% 福 尔马林等。
二、荧光抗体染色
目的： 使荧光抗体与待观察的抗原
结合，达到示踪效果。
步骤：于已固定的标本上滴加经适
当稀释的荧光抗体，25~37℃湿盒 反应30分钟，用PBS洗涤，缓冲甘 油封片。
直接法
荧光标记抗体 抗原
间接法
荧光标记抗体 特异抗体 抗原
三、荧光显微镜检查
物稳定，易于保存。
5 标记方法简单、安全无毒。
抗体标记荧光素常用方法
1. 搅拌法 待标记蛋白
缓慢滴加荧光素
室温持续搅拌4~6小时
离心
上清即为标记物
该法适用于标记体积较大，蛋白
含量较高的抗体溶液。
优点： 标记时间短，荧光素用量少。 缺点：本法的影响因素多，若操作不
当会引起较强的非特异性荧光染色。
2.透析法
作为标记的荧光素应符合以下要求
1 具有能与蛋白质分子形成共价键的
化学基团，与蛋白质结合后不易解
离，而未结合的色素及其降解产物
易于清除。
2 荧光效率高，与蛋白质结合后，仍
能保持高的荧光效率。
3 荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。 4 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的 生化与免疫学性质，与蛋白质的结合
光源
荧光素-Ab+Ag
荧光素-Ab-Ag 荧光显微镜观察
主 要 内 容
荧光的基础知识 荧光抗体的制备
免疫荧光显微技术 在医学检验中的应用
荧光的基础知识
荧光
某些物质受到一定波长光激发后，在极 短时间内发射出波长大于激发光波长的光。
荧光产生机制
一些化学物质 基态
吸收并储存能量
激发态
发光
发射光谱
指固定激发光波长，在不同波长 下所记录到的样品发射荧光的强度。
透光范围410~650nm，有OG
(橙黄色)和GG(淡绿黄色)两种。
荧光抗体的制备
荧光抗体 荧光素与特异性
抗体以化学共价键的方式结合而成。
荧光抗体的制备
一、抗体与荧光素的结合
二、标记抗体的纯化 三、荧光抗体的鉴定
一、抗体与荧光素的结合
对抗体的要求：
1 2 3 用于标记的抗体，是高特异性和高 亲和力的； 所用抗血清中不应含有针对标本中 正常组织的抗体； 一般需经纯化提取IgG后再作标记。
亮黄绿色 最广泛
桔红色 橙红色 常用于双重标记或 对比染色 衬染或单独染色, 荧光猝灭速度慢 与FITC一起用于 双色免疫荧光染色, 共用488nm波长
藻红色
其他荧光物质
镧系螯合物 如 Eu3+ 等
酶作用后产生荧光的物质
如: 4甲基伞酮-β-D半乳糖苷
β-半乳糖苷酶 4甲基伞酮
荧光免疫分析常用的仪器和设备
荧光显微镜 荧光分光光度计
流式细胞仪
荧光显微镜
光 源 高压汞灯、氙灯或卤素灯 激发光类型
紫外光（UV系统，UG） 兰紫光（BV系统，BG） 透射光 落射光
光路
滤 板
隔热滤板：能阻断红外线的透过而隔热。
激发滤板：提供合适的激发光谱。BG只
允许325~ 500nm波段通过，
最大透光度在410nm。
吸收滤板：滤除激发光而只允许荧光通过。
荧光偏振
P=
FH-FL FH+FL
P=0说明完全不偏振，-1<P<1为部分偏振
荧光物质
最大吸收 最大发射 波长(nm) 波长(nm) 异硫氰酸荧 490~495 520~530 光素(FITC) 570 595~600 四乙基罗丹 明(RB200) 550 620 四甲基异硫 氰酸罗丹明 (TRITC) 藻红蛋白 (R-RE) 565 578 名 称 荧光颜色 应 用
激发光谱
指固定检测波长，用不同波长 的激发光激发样品所记录到的相应 的荧光发射强度。
荧光效率
荧光效率=
发射荧光的光量子数(荧光强度)
吸收光的光量子数(激发光强度)
荧光寿命
指荧光物质被一瞬时光脉冲激发 后产生的荧光随时间而衰减到一定程 度时所用的时间。
荧光的猝灭
指荧光物质的荧光辐射能力在受到激发 光较长时间的照射后会发生减弱的现象。