农杆菌电击感受态的制备_转化及验证

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根癌农杆菌介导的真菌转化

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根癌农杆菌介导的真菌转化(一)农杆菌电击感受态制备及电击转化A感受态的制备1)将农杆菌菌液划线于Yeb平板（50μg/mlkana），28℃，36-48h。

2)挑单菌落至3mlYeb试管（50μg/mlkana）中，28℃，200rpm培养过夜。

3)转1ml至50mlYeb中，28℃，200rpm培养至oD600=0.8。

4)于4℃，5000rpm，10min收集菌体。

5)用50mL10%的甘油（去离子水配置，湿热灭菌）洗沉淀3次（4℃，5000rpm，10min），洗涤时一定要把菌体悬浮均匀。

6)重悬于1ml10%甘油中（约1011个细胞/ml），可立即使用，或分装为每管50μl，液氮速冻后，-80℃保存备用。

b电击转化1)将1μl质粒加入到农杆菌感受态细胞中，混匀，转至无菌预冷的电击杯中。

2)将电击杯放入电转化仪的电极之间，16kv/cm，5ms。

3)取出电击杯，迅速加入200-300μlYeb（不加抗生素），并将混合液转入ep管中。

4)于28℃，220rpm，2-3h。

5)将50-100μl菌液涂布于Yeb平板（50μg/mlcar和50μg/mlkana）上，于28℃培养2-3天后，挑斑鉴定。

(二)农杆菌化学感受态制备及化学法转化petentcells1)Inoculateasinglecolonyto5mlLb2)growat28℃tologphage,shakingat250rp m3)Inoculate2mlofthecultureto50mlLbmediumandgrowtooD600=0.5ca.8h ours4)chillonicefor10minutes5)spindownthecellsbycentrifugationat3000g(8000rpm)for10minutesat4℃6)Resuspendcellsin1mlof20mmcacl27)Aliquotsinto0.1ml,thenfreezeinliquidnitrogen,andstoreat-80℃bplasmid Transformation1)Thawcompetentcellsonice.2)Add1μgplasmid(5μl)tothecompetentcellsandmixwell.3)Freezeinliquidni trogenfor5min.4)heatshockat37℃for5min.5)Add1mlLbandgrowat28℃for3hrwithshakingat150rpm.6)spreadcellsontoLbplatescontaininganappropriateantibioticandincubate atroomtemperaturefor2-3days.(三）农杆菌介导的真菌转化1将已转入目的质粒的农杆菌接种于4mlYeb液体培养基（50μg/mlcar和50μg/mlkana）中，于28℃摇床中220rpm过夜培养（16-20h）。

农杆菌感受态细胞的制备及转化

农杆菌感受态细胞的制备及转化、浸润烟草1）挑取农杆菌单菌落于3 ml Sm（1000倍稀释）抗性的LB液体培养基中，28o C振荡培养过夜；2）取过夜培养菌液500μl加入到50ml的Sm抗性的LB液体培养基中，28o C振荡培养至OD600为0.5；3）5000rpm离心5min，倒掉培养液；4）加入10ml 0.15M NaCl悬浮农杆菌细胞，5000rpm 5min；5）倒掉上清，加入1ml 预冷的20mM CaCl2悬浮细胞，冰浴24h内使用，或者分装成每管200μl，液氮中速冻，保存于-70 o C备用。

取200μl感受态细胞，加入1ug质粒DNA，液氮中速冻1min，37o C水浴5min，加入1ml LB，28o C慢速振荡培养4－6h后，涂布于含有相应抗生素的固体培养基平板上，28o C 培养约48h。

挑取平板上长出的单菌落，接种于LB液体培养基（含有50μg/ml Kan和100μg/ml sm）中，28℃振荡培养过夜，碱裂解法小量提取质粒DNA，进行PCR及酶切鉴定。

用于浸润的菌液制备MMA buffer：10mmol/L MgCl2(95.21)，10mmol/L MES(195.23)，100μmol/L 乙酰丁香酮(196.20)（Acetosyringone）(MgCl2 :2g MES :2g 乙酰丁香酮:50ul)1）取单菌落接种于3ml LB（含有50μg/ml Kan和100μg/ml SM）培养基中28℃振荡培养过夜；2）取1ml活化后的菌液接入50ml LB（含有50μg/ml Kan和100μg/ml SM）中，28℃振荡培养至合适浓度OD600约0.8-1.0；3）4℃，4000rpm离心15min，沉淀用MMA buffer重悬，菌液终浓度为OD600约1.0-2.0；4）室温静置2hr以上，用1ml注射器对合适苗龄的本生烟进行浸润。

农杆菌感受态制备和转化：电转法和热击法

农杆菌感受态制备和转化：电转法和热击法电转法1）挑取新鲜单菌落接种到10mL YEP培养基（含50ug/ mL利福平）的试管里，28℃、200r/min培养过夜。

2）稀释2 mL培养过夜的农杆菌到含200 mL YEP培养基的500 mL三角瓶里，28℃、200r/min培养至OD600达0.5。

4℃、5000 r/min离心5分钟收集细胞。

3）用适量体积的 10%的甘油（用去离子水配置）重悬洗涤沉淀2次，洗涤时一定要轻柔地把细胞悬均匀，每次4℃、5000 r/min离心5分钟收集细胞，小心将上清倒掉。

4）将细胞重悬于1 mL 10%的甘油里，细胞可以立即使用，也可分装成每管40μL（质粒连接产物体积不能超过感受态细胞体积的1/10，否则容易爆杯），经液氮速冻后，-70℃冰箱保存备用。

5）取一管感受态细胞放在冰上融化，加入100ng DNA样品混匀，将样品放入冰上的电击杯中，按照电击仪厂商说明进行电击转化，之后涂布在含有相应抗生素的YEB平板上培养（质粒抗性+农杆菌菌株抗性）。

热击法1）挑单菌落于2 mL YEP培养基（含Rif 50mg/ mL）中28℃过夜活化；2）取2 mL过夜菌液接种于200 mL YEP培养基中28℃振荡培养生长至OD600约等于0.5左右；3）冰上放置30 min左右，5000 rpm离心5 min；4）在60 mL冰水浴预冷的无菌0.1M CaCl2溶液中中悬浮细胞；5） 5000 rpm离心5 min，悬浮细胞加入20 mL冰水浴预冷的含15%甘油的0.1M CaCl2，轻敲管壁使菌体悬浮均匀，每管200 µL 进行分装，液氮速冻后保存于-80℃待用；6）取200 µL感受态细胞，加入0.5 µg质粒DNA，液氮中速冻5 min，37℃水浴热击5min，之后迅速置于冰水浴中冷却2 min，然后加入1 mLYEB 空白培养基，28℃低速振荡培养4 hr；7） 6000 rpm离心2 min，弃部分上清，留约200 µL溶液，重悬细胞，涂布于含有相应抗生素的YEB 平板上，28℃倒置培养约36 hr。

农杆菌电击感受态的制备_转化及验证

农杆菌电击感受态的制备，转化及验证1.制备农杆菌电转感受态(1)挑取根癌农杆菌EHA 105单菌落，接种于5mlLB〔含利福平(Rif) 50mg/L,；链霉素100mg/L)液体培养基中，28'C, 220rpm震荡培养过夜。

(2)将2m1过夜培养的菌液加到50ml含同样抗生素的LB培养基中，28'C, 220rpm震荡3-4小时，至OD600=0.8左右。

(3) 5000rpm离心5分钟，去上清。

(4) 加入40m1 10%甘油悬浮菌体，冰浴30min.(5) 4'C, 5000rpm离心5分钟，去上清。

(6 加入30mL10%甘油重悬浮菌体，4'C, 5000rpm离心5分钟，(7)重复步骤6一次，去上清，加入2ml10%甘油悬浮，分装于1.5ml的离心管中(200 p 1/管)备用。

2 农杆菌感受态的电转化〔I)取2 ul质粒加到200 u I EHA 105感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟。

(2)把质粒和感受态混合液吸入电极杯，电击转化。

(3)马上加入lml新鲜的LB液体培养基，28'C, 150rpm轻摇4-6小时。

(4)收集菌体涂布于含有链霉素100mg/L),利福平(50mg/L)及质粒所含的抗性的LB固体培养基平板上，28℃培养2-3天。

其实和大肠杆菌电转化差不多，只不过培养温度是28度，摇的时间长一些，还有就是链霉素和利福平两种抗生素要加上，目的是防止根癌脓杆菌自带质粒的丢失，不过具体要加哪些抗生素还得看你是那种根癌脓杆菌非常感谢我用的不是电转化是把茎和叶浸在农杆菌液里30秒..想知道为什么不是把菌液直接滴在土里?可以采用注射法导入农杆菌还有就是把植株取出放入侵染液中用真空渗透法导入感受态制备及转化方案二1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。

农杆菌感受态制备

版本一1.1农杆菌感受态细胞的制备1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。

1.1.2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。

1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。

1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。

1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。

4℃5000rpm 离心5min，去上清。

1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。

1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。

1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。

再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。

28℃培养到形成单菌落。

其中 YM 可以用LB 代替，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl（7.0）0.01 DTT）替代。

版本二普通农杆菌感受态制备与转化：1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。

2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。

3. 5k rpm离心5分钟。

4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。

5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。

如不是马上使用，可以将之按200ul分装储存于-80℃待用。

农杆菌的培养与感受态制备

农杆菌的培养与感受态制备农杆菌感受态的制备与转化实验室根癌农杆菌感受态的制备：1.取保存于-70°LBA4404菌株在YEB（含125µg/ml链霉素或50mg/l利福平）或平板活化，挑取单菌落接种于5mlYEB（含125µg/ml链霉素或50mg/l利福平）或YEP(含50mg/l利福平)液体培养基中，28°C、200rpm培养24-28h。

2.取2ml菌液接种至50mlYEB（含125µg/ml链霉素或50mg/l利福平）或利福平)中，28°C、200rpm培养至OD600≈0.5左右。

3.菌液冰浴30min后，4°C、8000rpm离心10min收集菌液。

4.弃上清，用10ml0.15mol/lNacl重悬菌体，4°C、8000rpm离心10min收集菌液。

5.弃上清，用2ml20mmol/lCacl2重悬菌体，加入1ml60%无菌甘油(使其终浓度为20%），每管100μl分装，液氮冻存，-70°C保存。

重组质粒电转入农杆菌中：1.从大肠杆菌中提取重组质粒，将5μl重组质粒加入农杆菌感受态中，至于冰上30min。

2.将混合物加入电击杯中，选择“Agr”模式（电压2.2kv，时间4.9m）电击，加入800μlYEB培养基，28°C、200rpm振荡培养3-5h，8000rpm离心30S（实际操作中不离心，吸取菌液50、100、150ul等多做几个梯度，用无菌水稀释至180ul），弃上清，涂布于YEB平板（含农杆菌和质粒所带抗生素，如Kan和利福平）。

3.28°C恒温箱中倒置培养48h（24h以上）。

4.从农杆菌中提取质粒，双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测；扩目的片段并测序验证。

5.转化烟草等实验材料。

YEB培养基：1.0.5%（w/v）蔗糖，0.1%（w/v）细菌用酵母提取物，1%（w/v）细菌用胰蛋白胨，0.05%（w/v）MgSO4·7H2O，调节pH7.0，121°C灭菌15min。

农杆菌感受态细胞的制备和转化

Pei YX 实验室文档zengjieqiao 第七篇
农杆菌感受态细胞的制备
取-80℃保存的LBA4404于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。

挑取单菌落接种于5ml YEB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 h。

取2ml菌液转接于100ml YEB液体培养基中，28℃ 220rpm振荡培养至
=0.5。

OD
600
转入无菌离心管，4℃，5000rpm离心5min,去上清液。

溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。

加入30ml预冷的(0.05-0.1)M的CaCl
2
4℃ 5000rpm离心5min，去上清。

溶液，轻轻悬浮。

加入4ml预冷的含15%甘油的(0.05-0.1)M的CaCl
2
农杆菌悬浮液分装于无菌1.5 ml Eppendorf管中，每管200μl冻存于-80℃。

注意：(0.05-0.1)M的CaCl
溶液都可以，差别不是很大!
2
转化
分别向200μL根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中分别加入20 ng质粒DNA,轻轻混匀。

在冰浴中共放置30min。

置液氮中速冻5 min。

37℃热激5 min之后。

置冰上5 min,然后加入600μl YEB液体培养基。

于28℃、200 r/min培养4 h。

取100μL菌液均匀涂布于筛选培养基上,28℃放置36-48 h后可见抗性菌落长出。

阳性鉴定
挑去菌落过夜培养，进行菌液PCR！（注意做对照即：空的LBA4404也摇上，同时PCR）。

农杆菌EHA105感受态细胞的电击转化

农杆菌EHA105感受态细胞的电击转化
(1)调节电击仪,使其电脉冲为25ｕF,电压为2.5KV,电阻为400Ω
(2)从-70℃冰箱中取出EHA105感受态细胞,置于冰上使其融化.
(3)加1ｕL质粒于感受态细胞中,轻轻混匀.
(4)将上述菌液和DNA悬液加进电击杯的底部,迅速将电击杯放进电击仪.
(5)按设定的参数,启动对细胞的电脉冲.
(6)电击以后,尽快取出样品,加入1ML无抗YEB培养基.
(7)将上述菌液转入1.5MLdorf管中,28℃ 2小时以上
(8)将菌液涂布在加有相应抗生素的YEB培养基上, 28℃培养2-3天,直至菌落长出.
备注:所有操作最好在冰上进行,电击杯电击之前在冰上预冷.。

关于电激法做农杆菌的转化的问题(农杆菌,电激法,质粒)

农杆菌感受态细胞制备方法1．农杆菌稀释100倍过夜培养；3．5000rpm离心5min，弃去上清液；4．沉淀用1.5 ml 25mM CaCl2悬浮,冰浴20min；5．5000rpm离心5min，弃去上清液；6．每管用50μl CaCl2悬浮，20 min 后用于转化；7．加入质粒DNA 0.1～1μg，之后冰浴30 min；8．放入液N2中5min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；10．取出10～50μl菌液涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。

转化时一般200μl感受态细胞悬液（OD600为0.5-0.6）中加入的质粒含量不超过50ng,体积不超过10μl。

电转化步骤如下：1. 从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；2. 取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。

3. 将40～100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml 的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。

4. 打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。

5. 将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部；6. 将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1000μl的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。

7．37℃，220－250rpm复苏1小时。

8. 取20ul转化产物加160ulSOC涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。

其余菌液加1：1的30％的甘油后混匀－80℃保存。

注：每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal 80μl ，SOC 80μl，IPTG 20 μl。

电击杯清洗流程1．用清水将电击杯稍冲一下。

2．向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr。

3．弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。

4．加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30分钟。

农杆菌感受态的制备及电击转化

农杆菌感受态的制备及电击转化（1）将农杆菌EHA105菌株在含有50 mg/l 利福平的LB固体培养基上划线，28℃培养36~48 h；（2）挑取单克隆，于10 ml 含50 mg/l 利福平的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；（3）当OD600达到0.5~0.7时，6 000 r/min 4℃离心10 min收集菌体；（4）用预冷的10%无菌甘油洗菌体3次后用2 ml预冷的10%无菌甘油重悬沉淀，分装后于-70℃保存备用；（5）取重组质粒（pROK2-LbDREB）1 μl，加入100 μl EHA105感受态细胞，混匀后冰上放置；（6）将混合液放入预冷的电击杯中，1 800 V电击；（7）电击完成后迅速取出，加入500 μl LB液体培养基，迅速吸打混匀，尽可能多的将混合液移入无菌的离心管中，28℃摇菌1 h复苏；（8）取适量菌液涂布于含50 mg/l 卡那、50 mg/l 利福平的LB固体培养基上，28℃培养36~48 h；①农杆菌感受态细胞制备a. 在新活化的农杆菌EHA105/GV3101平板上，挑取单克隆于LB液体培养基（含利福平50mg/l）中，28℃，220r/min振荡培养至OD600达到0.6-0.7；b. 取1.5ml无菌离心管，每管分装1ml菌液，6000r/min离心10min；c. 去除上清，用1ml 10%无菌甘油重悬菌体，6000r/min离心10min，重复此过程3次，充分洗涤菌体以去除残留的培养基；d. 向洗好的菌体用100μl 20%无菌甘油重悬，-70℃保存备用。

②根癌农杆菌的电击转化a. 取-70℃保存的农杆菌感受态细胞，加入100ng重组质粒（pCAM-EG），吸打混匀后移入预冷的电击杯中；b. 1800V电压电击后迅速取出电击杯，加入500μl LB液体培养基，迅速吸打混匀；c. 尽可能多的吸出电击杯中的培养基，移入到无菌1.5ml无菌离心管中，28℃，振荡培养1h；d. 取转化的菌液200μl涂布于LB固体培养基（含利福平50mg/l和卡那霉素50mg/l）平板，28℃倒置培养24-48h。

农杆菌转化实验步骤

农杆菌转化实验步骤
农杆菌转化实验步骤
农杆菌转化是一种常用的基因转移技术，可以将外源DNA导入植物细胞。

下面是农杆菌转化实验的基本步骤：
1. 制备农杆菌：首先，选择适合的农杆菌株，常用的是农杆菌株Agrobacterium tumefaciens。

接种农杆菌于适宜的培养基中，培养至合适的生长期。

2. 构建质粒：在进行转化实验前，需要构建包含目标基因的质粒。

质粒可以通过常规的分子生物学技术，如PCR扩增、限制性酶切和连接等方法来获得。

3. 准备细菌：将构建好的质粒转化到农杆菌中。

通常采用电穿孔或热激方法，使质粒能够进入农杆菌内。

4. 感染植物：选择适当的植物愈伤组织或幼苗作为接受体，将其暴露在含有农杆菌的培养基中。

农杆菌会侵入植物细胞，并将质粒转移
到植物基因组中。

5. 抗生素筛选：转化后的细菌通常在培养基中含有特定抗生素。

将被转化的植物细胞接种于含有抗生素的选择培养基中，该抗生素能够选择出已转化的细胞。

只有具备目标基因的细胞能够生长并形成抗性。

6. 再生植物：选定抗生素抗性的植物细胞，进一步培养和处理以促进其发育和增殖。

通过激素处理和适当的培养条件，可以使其分化成完整的植株。

7. 验证转化：最后，通过分子生物学技术，如PCR和Southern blot 分析，来确认转化的植物是否成功地获得了外源基因，以及其在植物细胞中的表达。

农杆菌转化实验是一种常用且有效的方法，可用于植物基因工程及改良研究。

通过以上步骤，可以成功将目标基因导入植物细胞中，以获得具有所需性状的转基因植物。

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤

一、目的及要求了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。

二、实验原理在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。

在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。

感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。

农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。

将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。

制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。

三、实验仪器、材料和试剂仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。

以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。

材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株试剂：YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌；链霉素（Sm）储液：125mg/ml0.15 N NaCl，高压灭菌。

20mM CaCl2，高压灭菌。

四、实验步骤1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C振荡培养过夜；2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5；3. 5000rpm, 离心5min；4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min；5. 弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C保存备用。

农杆菌感受态细胞的制备与转化

实验五、农杆菌感受态细胞的制备与转化
01
实验目的：学习农杆菌感受态细胞的制备和转化原理。
02
实验要求：掌握农杆菌的特点及真核表达载体结构及应用。
03
技术应用：高等植物（双子叶植物或单子叶植物）转基因鉴定基因功能，包括过表达（诱导型或组成型），RNAi等。
04
试剂： YEB液体培养基（液体和固体），Kan（卡那霉素），Rif（利福平）； CaCl2(预冷)；NaCl；50%无菌甘油。
02
实验材料：农杆菌GV3101菌株，重组双元表达载体pCAMBIA1300
01
农杆菌简介：第一例转基因植物就是用农杆菌介导法完成的。
01
菌种：根癌农杆菌和发根农杆菌，二者均属革兰氏阴性菌，对双子叶植物侵染广泛，在某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。
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实验原理：
双元表达载体系统主要包括两个部分：
2.双元表达载体系统
双元表达载体
双元表达载体中Ti质粒pCAMBIA1300 的结构
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农杆菌感受态细胞的制备流程
将10l构建好的质粒DNA加入200 l 农杆菌感受态细胞中，混匀；
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冰浴30min，液氮迅速冷冻3-5min，37℃水浴无抗）YEB培养基，28℃振荡培养4h（选作）；
一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记，如NPTII基因以及Lac Z基因等。双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。

农杆菌感受态制备转化

农杆菌感受态制备转化
农杆菌感受态制备
1.平板，单克隆培养
2、挑单克隆于5mllb培养基中，摇到饱和（1-2day）
3、50m离心管中4500rpm，
15min
4.用1ml氯化钙（预冷）悬浮50ml细菌，并在冰上操作。

5.每100微升分装在冷冻
管中。

用液氮快速冷冻后，将其储存在-70℃下
农杆菌转化
1.50ul活性质粒+5ul质粒，置液氮中速冻2min，
2.37℃热休克5min
3.加1mllb，28℃培养3-4h
3.8000rpm/min去除上清液，用200ullb悬浮，吹干涂布板。

农杆菌耐药性：利福平+庆大霉素+携带者耐药性。

（gv3101）庆大霉素40mg/ml（0.4g/10ml）；利福平50mg/ml
二甲基亚砜溶解200mllb+200ul母液
农杆菌转植物
1.打顶后三天进行改造，前一天送足够的水
2.摇菌od600=1.2~1.6（先小摇后，取200ul大摇200ml）
3.室温5000rpm，15min，丢弃上清液并将其悬浮在等体积渗透介质中（200ml/转化）：1/2ms2/1000ml渗透介质42g；蔗糖50g；梅斯0。

5g；用1mkoh调节pH至5.8/5.7，定容至1000ml，加入10ul 1mg/ml 6-BA和200ul SIL wetl-7，充分混合，以OD=0.8左右悬
浮细菌溶液。

不少于0.7
4.将菌液倒入大平皿中，植株浸泡20s盖上白盆，过夜后揭开正常培养。

实验三农杆菌感受态细胞制备及转化

农杆菌介导基因转化
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的T-
E
• 菌体重悬于4ml冰预冷的20 mM的CaCl2中，冰浴10-20 min
F
• 4℃，5 000 rpm离心5 min，弃上清 • 菌体重悬于1ml冰预冷的20 mM的CaCl2，分装100µ l/管，24 h内使用或液氮速冻后-70 °C保存
G
感受态制备的要点：
OD600：0.4～0.6 OD值超过0.6必须重新活化当OD达到0.3时，每隔20min测一次OD值。分光光度计要测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态，有沉淀要摇匀。注意比色杯的正确选择及使用光电比色法定量测试原理：朗伯比尔定律：“当一束平行单色光垂直通过某一均玻璃比色杯只适用于可见光区,在紫外区测定时要用石英比色杯。石英玻璃在紫匀非散射的吸光物质时, 其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比”。外线到红外线的整个光谱波段都有较好的透光性能，可见光透过率在９３％以其中“吸收层厚度”就是实践中的比色杯厚度，如果测试中使用的比色杯不是同上，特别是在紫外光谱区，最大透过率可达８０以上，而普通的玻璃在紫外光一套，就无法保证其厚度一致，也就人为导致测试结果出现偏差。谱区的透过率较差。一般，测定波长在350毫微米以上时，可以用玻璃比色杯；
所以涂板后无单菌落出现，出现长满板的情况为抗生素失活。

农杆菌感受态制备

版本一1.1农杆菌感受态细胞的制备1.1.1. 取-70 C保存的EHA105于含50用/ml链霉素平板划线，28 C培养。

1.1.2. 挑取单菌落接种于 5ml YM液体培养基中，220rpm 28 C振荡培养12-16 hr。

1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM 液体培养基中，28 C 220rpm 振荡培养至 OD600=0.5。

1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm 离心5min,去上清液。

1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCI2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min °4C 5000rpm离心5min，去上清。

1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。

1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendof管中，每管200 M冻存于-70 C。

1.2.双元载体转化农杆菌 EHA105取1⑷左右的质粒 DNA加入到200ml EHA105 感受态细胞中，混匀后，冰浴30min , -70 C放置10min。

再在37 C水浴5min或42 C水浴1min，接着冰浴 2min，加入800mlYM 液体培养基 28 C, 175rpm 摇培3hr后涂在含50旧/ml Kanamycin 的YM平板上。

28 C培养到形成单菌落。

其中 YM 可以用LB代替，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCI2 0.01Tris-HCI （7.0）0.01 DTT ）替代。

版本二普通农杆菌感受态制备与转化：1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml ）中28 C过夜活化。

2. 取2ml过夜菌液接种于 50ml YEP培养基中28 C生长至 OD600约等于0.5左右（4hr ）。

3. 5k rpm离心5分钟。

4. 在10ml 0.15M NaCI 中悬浮细胞。

5. 5 krpm 离心5分钟，悬浮细胞于 20ml冰预冷的CaCI2。

农杆菌感受态制备与转化

双元载体的农杆菌转化
1.1农杆菌感受态细胞的制备
1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。

1.1.
2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。

1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。

1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。

1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。

4℃5000rpm离心5min，去上清。

1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。

1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。

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2. 双元载体转化农杆菌EHA105
取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min(液氮一分钟)。

再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。

28℃培养到形成单菌落。

其中YM 可以用LB 代替，第一次的CaCl2溶液可用溶液（0.1MCaCl2
0.01Tris-HCl（7.0）0.01 DTT）替代。

农杆菌感受态的制备和转化

1.农杆菌感受态的制备感受态制备溶液:8% PEG 4000, 4% DMSO,50mM CaCl220Mm重悬细胞效果更好？挑取农杆菌(EHA105和LBA4404)单菌落接种于含氯霉素或链霉素和利福平5mLYEB液体培养基中,28℃,200～250r/min振荡培养30～36h,转入100mLYEB液体培养基中(1:20比例接种),在相同条件下培养至菌液OD600=0.4-0.6(约10h)。

然后冰上放置菌液15min，4℃,4000r/min离心10min,用适量50mmol/L冰浴CaCl2溶液重悬后在相同条件下离心,再用1/10原体积50mmol/L冰浴感受态制备溶液重悬,用1.5mL离心管分装成50μL小份,置于冰上，液氮速冻之后现用或-80℃保存备用。

Not Iike E.coli cells, fresh A.bacterium competent cells had higher transformation efficiency . As time went on . the transformation efficiency was decreased. When the storage time was longer than7 days and the temperature is higher than 4℃, A. bacterium lost the competent ability.2.冻融法转化农杆菌50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），与质粒混合均匀之后, 放置冰上30 min，然后置于液氮速冻3-5min,28℃水浴热激5min,然后加入无抗生素的LB培养基，28℃，200～250r/min振荡培养2h，涂布抗性平板，28℃静置培养36小时后挑菌落鉴定。

1. 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备1) 挑取单菌落GV3101，接种于5mL附加有50mg/L的利福平的液体LB培养基中，28℃，200rpm，过夜；2) 取2mL培养物至50mL液体LB培养基中，继续培养至OD600为0.5左右；3) 将培养物冰浴30min，4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；4) 用l0mL 0.lmol/L冷的NaCl悬浮菌体；5) 4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；6) 1 mL 20mmo1/L冷的CaCl2悬浮，分装成50uL/管，液氮速冻后，-80℃保存。

实验五农杆菌感受态细胞的制备和质粒转化

感受态细胞制备的原理
• 感受态细胞制备的原理是细菌在低温和低渗氯化钠溶液中，菌细胞壁通透性增加。
实验原理
• 转化方法：电击法、 CaCl2、 NaCl等化学试剂法 • 感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。 • 转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( TransfoKan培养基
影响转化率的因素
• • • • 细胞生长状态和密度。转化的质粒 DNA 的质量和浓度。试剂的质量。防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。
实验试剂
农杆菌LBA4404 YM培养基， 0.1mol/LNaCl溶液（预冷） 20mM CaCl2溶液（预冷）卡那霉素（50mg/ml）质粒DNA （上周日提取）
2.挑取单菌落接种到40ml YM液体培养基（硫酸链霉素，25mg/ml）中，28℃条件下，250rpm悬浮培养12-20小时。
3．在超净工作台上将菌液转入灭过菌的50ml离心管中，4℃ ，5000×rpm离心8min。 4．在超净工作台上弃上清，用100mM NaCl （4℃ 预冷）重悬农杆菌，4℃， 5000×rpm离心8min。 5．在超净工作台上弃上清，加入原始农杆菌菌液 1/50体积（800ml）的20mM CaCl2溶液重悬菌体，并分装成500ml/管。 6．将分装后的离心管置于液氮中10秒，-80℃保存。
农杆菌感受态细胞的制备
1.将农杆菌LBA4404（抗硫酸链霉素，25mg/ml）接种在YM平板上，26-28℃ 培养48小时。
YM培养基的配方：酵母提取物0.4g/L；甘露醇 10g/L；NaCl 0.1g/L；MgSO4 0.1g/L； K2HPO4 0.5g/L；琼脂粉 15g/L pH：7.2-7.4