烟草及烟草制品果胶的测定-中国烟草标准化

《烟草及烟草制品果胶的测定离子色谱法》研究报告安徽中烟工业公司2009年8月果胶测定行业标准研究报告关键字：烟草果胶离子色谱果胶酶摘要：比较了酸解法、酶解法、酸化酶解结合法三种前处理方法对烟草果胶水解的影响，采用离子色谱法测定水解物中的半乳糖醛酸的含量（果胶含量以半乳糖醛酸计），结果显示酸化酶解结合法可以有效水解烟草中的果胶，相对于酸解法和酶解法该法水解烟草果胶更为彻底，而且不破坏水解产物半乳糖醛酸。

离子色谱法测定半乳糖醛具有灵敏度高、分离度好等优点，方法的线性相关系数为1，回收率94 %～101 % ，RSD 为0.91 %。

四家实验室进行了方法比对实验，结果令人满意。

果胶是烟草中一种复杂的高分子聚合物，其基本结构是半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键聚合形成的聚半乳糖醛酸。

不同种类的烟草中果胶含量是不同的，通常含量在6％-12％之间，是烟草中含量较大的一类生物大分子物质[1]。

烟草中的果胶类物质含量过高时会使烟草在燃吸时燃烧不完全，对烟草吸味有负面影响，同时果胶在分解时还能产生有毒物质甲醇，对卷烟的安全性不利[2]。

与此同时果胶又对烟草保湿能力和柔韧性有着重要作用，因此果胶含量已成为烟草品质评价的重要指标，准确测定烟叶中的果胶含量对于烟草品质有着重要的意义[3、4]。

目前国内有关果胶测定的标准有:GB/T 10742-1989 造纸原料果胶含量测定、NY146.11-1988果汁的测定和NY82.11-1988果胶测定。

这三个标准制定时间比较早，三个标准都是先采用乙醇溶液回流除去小分子糖，再使用硫酸溶液水解果胶，咔唑比色法测定水解液中的还原糖，方法对半乳糖醛酸的选择性差，操作较为复杂且灵敏度也不高，而国际标准化组织ISO以及CORESTA也没有制定果胶测定的相关标准。

目前果胶测定方法主要有两大类，一类是直接测定果胶酸含量，果胶含量以果胶酸计；一类是通过酸解或者酶解将果胶水解，采用现代分析仪器测定水解产物半乳糖醛酸含量，果胶含量以半乳糖醛酸计。

第一类方法中，以重量法、容量法[5]为主，通过对果胶皂化处理，使果胶转化为果胶酸，使用氯化钙沉淀或者EDTA滴定果胶酸，测定果胶酸含量。

这类方法操作步骤复杂且重复性差，目前已较少采用。

第二类方法中，主要有比色法、色谱法等，其中比色法主要有咔唑比色法[6]、间-羟基联苯比色法[7]，其原理是在强酸条件下将果胶水解成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸进一步降解，通过咔唑或间-羟基联苯与半乳糖醛酸降解产物衍生化反应，进行比色测定半乳糖醛酸含量。

虽然比色法对半乳糖醛酸有一定的选择性，但是中性糖对测定结果有干扰[8]。

除了中性糖的干扰之外，游离态或结合态半乳糖醛酸与显色剂之间的反应也存在差异，结果导致采用比色法测定半乳糖醛酸的含量结果偏高[9-11]。

色谱法测定半乳糖醛酸的方法主要有气相色谱法[12、13]、液相色谱法[14、15]离子色谱法[16、17]等。

其中气相色谱法测定需要衍生化，操作复杂，采用的较少；高效液相色谱法虽然解决了选择性问题，但是只能采用示差折光检测器或者蒸发光散射检测器检测半乳糖醛酸，灵敏度不高；离子色谱法采用离子色谱柱分离半乳糖醛酸，带金电极的电化学检测器测定，方法选择性好，灵敏度高。

在本研究报告中，将采用离子色谱测定果胶水解产物半乳糖醛酸，并对方法进行优化。

果胶水解目前主要有三种方法，酸法[18-21]、酶法[22-24]以及酸化酶解结合法[16、25]，酸法水解需要较高浓度的酸和足够长的时间才能将果胶完全水解，酸解产物半乳糖醛酸一经释放就有降解趋势，形成内酯类物质[16,26]，因此采用酸法水解果胶定量测定半乳糖醛酸含量这种方法不是一种理想的方法[27]。

酶法水解果胶是一种较好的技术，处理过程中不存半乳糖醛酸的降解，但是酶法水解需要不同类型活性的酶，包括聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶、半纤维素酶，这些酶的综合作用才能有效水解果胶[13,22,23,27]。

Haikel[16]比较了酸法和酶法分别水解苹果果胶，结果显示酶法水解果胶半乳糖醛酸产率达66%，而酸法不过35%左右，表明酶法比酸法对果胶聚半乳糖醛酸链有更高的解聚作用。

作者还采用文献[25]方法比较了采用酶法和酸化酶解结合法测定苹果果胶、柑橘果胶、甜菜根果胶和菊苣果胶，结果显示除甜菜根果胶外，其它测定结果两种方法没明显差异。

本研究报告将分别比较三种水解方法对烟草果胶测定的影响，优化烟草果胶水解方法。

1、材料与方法1.1 仪器与试剂ICS3000 离子色谱系统、ED3000 电化学检测器(美国Dionex 公司) , CarboPac PA-10 (2 mm ×50 mm) 保护柱, CarboPac PA-10 (2 mm ×250 mm) 分析柱；CSM-I旋风式样品磨（配40目筛，北京一轻研究所）；AG204分析天平，（瑞士梅特勒公司，感量0.1 mg）；SHB - III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司) ;HH4数显恒温水浴锅（上海浦东物理光学仪器厂）；FD240鼓风式烘箱（德国Binder公司）；SHA-BA型水浴恒温振荡器（金坛荣华仪器制造有限公司），Milli-Q-Academic超纯水发生器(法国MILLIPORE 公司) 半乳糖醛酸标准品（含1个结晶水，≥97%，Sigma公司）；超纯水（电阻率≥18 MΩ•cm）；50%氢氧化钠溶液(美国Fisher公司)；无水乙酸钠（优级纯，美国戴安公司）；无水乙醇、乙酸、三水乙酸钠、盐酸、苯甲酸皆为分析纯(上海国药集团)。

固体果胶酶（Ruibio，酶活30 u/mg，来源：Aspergillus niger，1个酶活力单位（u）定义为可在pH 3.5、55℃下每小时水解果胶生成1mg半乳糖醛酸）。

1.2 试剂配制1.2.1 0.1 mol/L乙酸/乙酸钠缓冲溶液，pH 4.0；1.2.2 0.05、0.1、0.2、0.5 、2、4、6 mol/L盐酸溶液；1.2.3 果胶酶溶液，300 u/mL，乙酸/乙酸钠缓冲溶液配制；1.2.4 80%乙醇溶液；1.2.5 标准溶液1.2.5.1半乳糖醛酸标准储备液称取30 mg（精确至0.1 mg）半乳糖醛酸，0.1%苯甲酸溶液溶解并定容至100 mL容量瓶中，定为半乳糖醛酸标准储备液。

半乳糖醛酸标准储备液置于4 ︒C 下保存，有效期6个月。

取用时放置于常温下，达到常温后方可使用。

1.2.5.2半乳糖醛酸标准系列溶液分别移取50 μL、100 μL、250 μL、500 μL和1000 μL半乳糖醛酸储备液于100 mL容量瓶中，以0.1%苯甲酸溶液定容，得到半乳糖醛酸标准系列溶液。

1.2.6 流动相超纯水作为流动相A。

移取50%氢氧化钠溶液13.1 mL，稀释定容至1 L，配制250 mmol/L氢氧化钠溶液，作为流动相B；称取无水乙酸钠82 g，溶解后定容至1 L，配制1 mol/L乙酸钠溶液，作为流动相C。

1.3 样品处理方法1.3.1 酸解法将烟叶切丝，40 ℃下烘干，粉碎，过40目筛，置于样品瓶中备用；准确称取1 g（精确至0.1 mg）烟末，置于150 mL 圆底烧瓶中,加入60 mL无机酸溶液，在沸水水浴中回流水解，冷却过滤，定容至100 mL，取1.0 mL至100 mL 容量瓶中，NaOH溶液调节pH值至中性后定容，过0.45 μm水系滤膜离子色谱分析。

1.3.2 酶解法准确称取1 g（精确至0.1 mg）烟末，置于150 mL磨口三角瓶中，加入100 mL 80%(体积分数,下同)乙醇，沸水浴回流1 h以除去水溶性糖[28-31]，趁热抽滤，80%热乙醇润洗三遍。

将滤片放入150 mL磨口三角瓶中，使用100 mL乙酸/乙酸钠缓冲溶液将残留在布氏漏斗壁上的样品残渣洗入三角瓶中，加入果胶酶溶液，55 ℃水浴酶解，酶解结束后布氏漏斗真空抽滤，滤渣用蒸馏水洗涤3次，合并滤液定容至250 mL，取1.0 mL稀释至250 mL后过0.45 μm水系滤膜离子色谱分析。

1.3.3酸化酶解结合法1.3.3.1 酸化准确称取1 g（精确至0.1 mg）烟末，置于150 mL磨口三角瓶中, 加入100 mL 80%(体积分数,下同)乙醇，沸水浴回流1h以除去水溶性糖，趁热抽滤，80%热乙醇润洗三遍。

将滤片放入150 mL磨口三角瓶中，使用100 mL 0.05 mol/L 盐酸溶液将残留在布氏漏斗壁上的样品残渣洗入三角瓶中，沸水浴1 h，趁热布氏漏斗真空抽滤，热水润洗三遍，滤液定容至250 mL，得溶液A1.3.3.2残渣酶水解将上述抽滤样品残渣转移至150 mL磨口三角瓶中，加入100 mL乙酸/乙酸钠缓冲溶液和1 mL果胶酶溶液，55 ℃水浴振荡后布氏漏斗真空抽滤，滤液定容至250 mL，得溶液B。

1.3.3.3 酸化液酶水解取1 mL上述溶液A于100 mL磨口三角瓶中，加入20 mL乙酸/乙酸钠缓冲溶液和1 mL果胶酶溶液，55 ℃水浴振荡后酶解液转移至250 mL容量瓶中，加入1.0 mL溶液B，以0.1%苯甲酸溶液定容，得溶液C，过0.45 m滤膜后离子色谱分析。

1.4 离子色谱测定方法色谱柱：CarboPac PA-10（2 mm×250 mm）柱温：30 ℃；流速：0.25 mL/min；进样量：25 µL；淋洗液梯度洗脱程序如表1所示；检测器采用金电极脉冲安培检测模式，检测电位波形如表2所示。

表1 淋洗液梯度洗脱程序时间(min) 流动相A 流动相B 流动相C0.00 25% 60% 15%15.00 25% 60% 15%表2 检测器检测电位波形时间(sec) 电位(V) 积分状态0.00 0.100.20 0.10 开始0.40 0.10 结束0.41 -2.000.42 -2.000.43 0.600.44 -0.10 0.50-0.102、结果与讨论2.1色谱条件的选择糖类分子具有电化学活泼型及在强碱溶液中呈离子化状态，Rocklin 等[31]于1983年首先报导了采用阴离子交换色谱柱分离，脉冲安培检测器测定糖的新方法。

中性糖类是pKa 在12-14之间的弱酸，在强碱溶液中会全部或者部分以阴离子形式存在，可以在阴离子交换柱上被保留并得到分离。

考虑到半乳糖醛酸上的羧基对酸性单糖在阴子分析柱上的洗脱，因此采取了淋洗强度较大的氢氧化纳/醋酸钠淋洗液体系[16,17,32]。

图1中的2张色谱图分别为:(a)标样图谱，(b)烟草水解样品图谱。

由图1中的(a)图可以看出，半乳糖醛酸获得了很好的分离效果，且分析速度快仅在12 min 内就完成了分析。

(b)图是烟草水解样品的色谱图，水解液中的中性单糖大部分在4 min 之内即完全出峰，且由于脉冲安培检测器具有优越的选择性使干扰因素大大降低，提高了半乳糖醛酸测定的灵敏度和准确度。