黎耀基生物科技研究所教授
人SEPT9蛋白同源建模和活性位点分析_王俊生
第４２卷 第２期２０１４年３月河南师范大学学报（自然科学版）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖｏｌ．４２ Ｎｏ．２ Ｍａｒ．２０１４ 文章编号：１０００－２３６７（２０１４）０２－０１０７－０７人ＳＥＰＴ ９蛋白同源建模和活性位点分析王俊生，阮先乐，范小芳，王永立，陈 龙（周口师范学院生命科学与农学学院，河南周口４６６００１）摘 要：利用生物信息学在线软件预测了人ＳＥＴＰ ９蛋白质的二级结构和模体信息，同时对其三级结构进行同源建模和模建结果质量评价，其次预测了该蛋白质的活性位点信息，旨在从蛋白质序列特征和分子结构水平理解其在人类生理病理过程中的作用．结果表明，模建的ＳＥＰＴ ９蛋白结构品质较高，具有７段α－螺旋和２组β－折叠结构，是一个典型的α／β类蛋白，表面呈弱正电势分布；人ＳＥＰＴ ９蛋白具有８个不同模体，可能参与不同生化反应或执行不同的功能．搜寻获得了人ＳＥＰＴ ９蛋白配基结合位点有１０个，其中位点１可能是该蛋白的活性位点．这些研究结果对理解人ＳＥＰＴ ９蛋白功能以及配基结合位点定位非常重要，也为针对ＳＥＰＴ ９蛋白的分子对接和药物从头设计提供了理论基础．关键词：人ＳＥＰＴ ９蛋白；同源模建；活性位点中图分类号：Ｑ５１８．２文献标志码：ＡＳｅｐｔｉｎ广泛存在于真菌［１］、线虫［２］、果蝇［３－４］、爪蟾［５］及哺乳动物［６］等绝大多数真核生物中．研究［７］表明，人基因组中存在多达１３种Ｓｅｐｔｉｎ基因亚家族，并且与细胞的重要生物功能密切相关，从血管生成到小泡运输，从癌症到神经系统一系列疾病等［８－１０］．ＳＥＰＴ ９蛋白最早是在白血病中作为粒细胞／淋巴细胞／白血病的伴随蛋白得到鉴定的［１１］，并且是从胸癌和卵巢癌的等位基因失衡区中克隆获得的［１２，１３］．ＳＥＰＴ９基因位点复杂，至少编码５种不同的蛋白质单体，能够和其他ＳＥＰＴ蛋白形成低聚体复合物［１４，１５］，不同的ＳＥＰＴ ９蛋白单体均具有一个ＧＴＰａｓｅ保守结构域，该结构域含有核定位信号，他们的差异主要表现在氨基酸组成上［７－８］．不同的ＳＥＰＴ９变异剪接本以及ＳＥＰＴ ９蛋白表达的改变被认为与前列腺癌［２］、卵巢癌［９，１６］、胸癌［１７］、结肠癌［１８］、头颈部癌［１９－２０］等疾病密切相关，也与遗传性神经痛性肌萎缩［２１］密切相关．随着对ＳＥＰＴ蛋白的研究日益深入，人类ＳＥＰＴ蛋白之间的互作以及功能不断被证实，如ＳＥＰＴ ９蛋白与ＳＥＰＴ ２和ＳＥＰＴ ７蛋白互作［２２］，可能参与了细胞骨架的组装完成；ＳＥＰＴ ２、６和７之间存在相互作用［２３］，也有研究［２４］表明，该ＳＥＰＴ９与ＡＨＮＡＫ，ｅＩＦ４Ｅ和Ｓ１００Ａ１１基因共同在伪足突起、癌症细胞的迁移和侵袭中表现出很重要的作用．然而，关于蛋白的三级结构信息以及基于三级结构的活性位点信息尚未见报道，因此本研究基于ＳＥＰＴ ９蛋白突变剪接体（ＡＡＨ５４００４．１）氨基酸序列，利用生物信息学方法预测其二级结构、模体类别和数量，并利用同源建模方法模建了该蛋白质的空间结构，分析和平估了模建的质量，最后预测了该蛋白的活性位点信息，为治疗该基因突变引起的人类疾病进行药物设计奠定理论基础．１ 材料和方法１．１ 序列来源在美国国立信息技术中心ＮＣＢＩ数据库中查询下载人ＳＥＰＴ ９蛋白序列，序列获取号为ＡＡＨ５４００４．１，由美国国立卫生研究院、哺乳动物基因中心、国家癌症研究院对人眼部癌变组织的测序项目提供［２５］，该蛋白由４２２个氨基酸组成，定位在人体第１７号人色体上（１７ｑ２５．２－ｑ２５．３），与卵巢癌、遗传性神经痛、肌萎缩、白血病等多种人体病症相关．收稿日期：２０１３－１１－２６基金项目：河南省教育厅项目（１４Ｂ２１００２２）；河南省高校博士科研启动经费（ＺＫＳＹＢＳＣＸ２０１１１０）作者简介：王俊生（１９７０－），男，陕西蒲城人，周口师范学院副教授，博士，主要从事生物信息数据挖掘研究．１．２ 二级结构和蛋白质模体预测利用ＮＰＳ（Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ，ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ－ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ）提供的Ｐｒｏｓｃａｎ，对人ＳＥＰＴ９蛋白序列进行模体预测；使用在线网站Ｅｘｐａｓｙ的Ｃｏｉｌｓ程序预测卷曲螺旋区域，用Ｍｕｌｔｉｃｏｉｌ程序预测二聚体和三聚体．１．３ 模建、蛋白质表面静电构象和模建结果评价分析方法利用ＣＰＨｍｏｄｅｌｓ ３．２在线服务器（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＣＰＨｍｏｄｅｌｓ／）对人ＳＥＰＴ ９蛋白序列（ｇｂ｜ＡＡＨ５４００４．１）进行同源建模，获取其三级结构信息，并且用Ｒａｓｍｏｌ视图软件可视化．模建结果检测评价采用ＮＩＨ ＭＢＩ实验室提供的结构基因组学和蛋白质确证分析服务器（ｈｔｔｐ：／／ｎｉｈ－ｓｅｒｖｅｒ．ｍｂｉ．ｕｃｌａ．ｅｄｕ／ＳＡＶＥＳ／）中提供的不同软件，从拉氏散点图、３Ｄ－１Ｄ符合度两方面进行评价．蛋白质表面静电构象通过计算ＳＥＰＴ ９蛋白（ＡＡＨ５４００４．１）各氨基酸残基的静电，使用软件Ｓｗｉｓｓ－ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ４．０．１模建蛋白质表面静电构象．１．４ 蛋白质活性位点分析活性位点分析采用在线软件Ｑ－ＳｉｔｅＦｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ．ｌｅｅｄｓ．ａｃ．ｕｋ／ｑｓｉｔｅｆｉｎｄｅｒ／）［２６］．均采用软件默认设置参数．２ 结果与分析２．１ 人ＳＥＰＴ９蛋白的二级结构预测利用ＳＰＯＭＡ在线软件对人ＳＥＰＴ ９蛋白二级结构预测结果表明（如图４），该蛋白质序列中α螺旋占２９．６２％，β－延伸链占１２．３２％，β转角占３．３２％，无规则卷曲占５４．７４％，而利用ＧＯＲ４软件对该蛋白二级结构预测表明，该蛋白质序列中α螺旋占３４．３６％，延伸链占１５．６４％，无规则卷曲占５０．００％，无β转角．与ＳＯＰＭＡ软件预测结果基本一致．从ＳＯＰＭＡ预测的β转角结构来看，所有６个β转角结构均不超过４个氨基酸残基（５个由２个残基构成，１个由３个残基构成），因此该蛋白的二级结构中β转角不会形成环（Ｌｏｏｐ）结构．２．２ 人ＳＥＰＴ９蛋白的特殊卷曲螺旋预测对人ＳＥＰＴ ９蛋白二级结构卷曲螺旋区域进行预测，结果（图２－Ａ）表明，在蛋白质序列上分布着几段可能的卷曲螺旋区域，其中２１５－２４２区段形成卷曲螺旋的可能性较大，但预测得分没有超过０．４，其他区段得分更小．使用在线网站Ｅｘｐａｓｙ的Ｍｕｌｔｉｃｏｉｌ程序预测该蛋白质的二聚体、三聚体卷曲螺旋（使用ＰａｉｒＣｏｉｌ算法），蓝线表示二聚体卷曲螺旋预测分值，红线表示三聚体卷曲螺旋预测分值，预测的分值皆为０．因此，该蛋白质难以形成稳定二聚体、三聚体卷曲螺旋（图２－Ｂ）．２．３ 人ＳＥＰＴ９蛋白的模体预测对人ＳＥＰＴ ９蛋白序列进行模体预测，结果（表１）表明，该蛋白包含１个Ｎ－糖基化位点、１个ｃＡＭＰ－和８０１河南师范大学学报（自然科学版） ２０１４年ｃＧＭＰ依赖的蛋白激酶磷酸化位点、４个蛋白激酶Ｃ磷酸化位点、９个酪蛋白激酶ＩＩ磷酸化位点、１个酪氨酸激酶磷酸化位点、１个Ｎ段肉豆蔻酰基化位点、２个酰胺化位点、１个ＡＴＰ／ＧＴＰ结合位点，模体类型和氨基酸位置详细信息见下表．表１ 人ＳＥＰＴ ９蛋白的模体预测模体名称序列号模式类型氨基酸序列随机概率Ｎ－糖基化位点ＰＳ００００１Ｎ－｛Ｐ｝－［ＳＴ］－｛Ｐ｝３６３－３６６：ＮＴＴＨ ５．１３８ｅ－０３依赖ｃＡＭＰ和ｃＧＭＰ的蛋白激酶磷酸化位点ＰＳ００００４［ＲＫ］（２）－ｘ－［ＳＴ］２６７－２７０：ＫＲＬＳ １．５７２ｅ－０３蛋白激酶Ｃ磷酸化位点ＰＳ００００５［ＳＴ］－ｘ－［ＲＫ］７１到７３：ＴＰＲ；９１到９３：ＴＰＲ；１６０到１６２：ＳＲＫ；２５７到２５９：ＳＬＲ１．４２３ｅ－０２酪蛋白激酶ＩＩ磷酸化位点ＰＳ００００６［ＳＴ］－ｘ（２）－［ＤＥ］５７到６０：ＳＲＬＥ；９１到９４：ＴＰＲＤ；１０３到１０６ＳＲＮＥ；１１９到１２２：ＳＩＬＥ；１６７到１７０：ＴＳＥＥ；１９５到１９８：ＴＶＩＤ；２８６到２８９：ＴＬＥＥ；３３８到３４１：ＳＤＨＥ；３６５到３６８：ＴＨＣＥ１．４８２ｅ－０２酪氨酸激酶磷酸化位点ＰＳ００００７［ＲＫ］－ｘ（２，３）－［ＤＥ］－ｘ（２，３）－ｙ１０７到１１４：ＫＡＰＶＤＦＧ４．０７４ｅ－０４４．０８３ｅ－０４Ｎ－肉豆蔻酰基化位点ＰＳ００００８Ｇ－｛ＥＤＲＫＨＰＦＹＷ｝－ｘ（２）－［ＳＴＡＧＣＮ］｛Ｐ｝１４４到１４９：ＧＬＧＫＳ １．３９７ｅ－０２酰胺化位点ＰＳ００００９ｘ－Ｇ－［ＲＫ］－［ＲＫ］３４５到３４８：ＮＧＫＲ；３５０到３５３：ＬＧＲＫＶ８．６３６ｅ－０４ＡＴＰ／ＧＴＰ结合位点ＰＳ０００１７［ＡＧ］－ｘ（４）－Ｇ－Ｋ－［ＳＴ］１４１到１４８：ＧＱＳＧＬＧＫＳ ７．７８１ｅ－０５２．４ 利用ＣＨＰ同源建模法的建模结果与评价以人Ｓｅｐｔｉｎ ３蛋白的ＧＴＰａｓｅ域的三维结构（序列号为３ＳＯＰ．Ｂ，与待建模序列相似性为６９．６％，显著性水平为１ｅ－１０６，模板长度２７０个残基，覆盖待建模板的６３．７％）为模板，利用ＣＰＨｍｏｄｅｌｓ同源建模法进行建模，结果（见图３－Ａ）表明，人ＳＥＰＴ９蛋白三级结构中α－螺旋、Ｂ－折叠、Ｂ－转角，无规则卷曲（白色）结构清晰可见，由７段α－螺旋和２组β－折叠构成，其中１组平行β－折叠片层结构由６个β折叠单链组成，位于蛋白质内部，另一组β－折叠片层结构由３个较小的β折叠单链组成，靠近蛋白质外部，无规则卷曲（包括β－转角）起着连接α－螺旋或β－折叠的作用．因此该蛋白是一个典型的α／β类蛋白．利用Ｗｈａｔ＿ｃｈｅｃｋ程序获得模建结果的拉氏图（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ ｐｌｏｔ）（图３－Ｂ），结果表明，拉氏图中最合理区（图３Ｂ中的Ａ，Ｂ，Ｌ区）和一般允许区（图３Ｂ中ａ，ｂ，ｐ）以及免强允许区（图３Ｂ中－ａ，－ｂ和－ｐ区）的残基数占比分别为８７．８％、１１．４％和０％，不允许区（白色区）为０．８％，在允许区内总计占９９．２％，因此，模建结果比较理想；进一步利用ｖｅｒｆｙ３Ｄ－１Ｄ软件检测模建结果的原子结构（３Ｄ）与序列（１Ｄ）的符合度，结果９０１第２期 王俊生，等：人ＳＥＰＴ ９蛋白同源建模和活性位点分析（图４）表明，最大得分０．６８，最小得分－０．０３，并且平均得分大于０．２的残基数占建模总残基数（２７０个氨基酸位置，包含一个空位）的８４．７％，出于可接受的水平．因此，利用ＣＨＰｍｏｄｅｌ同源建模法获得的人ＳＥＰＴ ９蛋白的三级结构符合蛋白质立体化学品质规则．２．５ 人ＳＥＰＴ９蛋白表面电位预测通过计算ＳＥＰＴ ９蛋白（ＡＡＨ５４００４．１）各氨基酸残基的静电，使用软件Ｓｗｉｓｓ－ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ４．０．１模建蛋白质表面静电构象（图５），正电势与负电势共存于蛋白质表面，其中表面正电集团成族分布，占据较多的位置，表面整体呈正弱电势，其中负电势的残基成较小的簇状分布，负电残基分布在１６９、１７０、１７７、１８４、１８６、１８７、１９８、２０４、２０９、２２１、２２４、２２９－２３０、２４１、２６２、２６４、２８３、２８８－２８９、３００、３０７、３１３、３１５－３１７、３１９－３２０、３２５、３２９、３３９、３４１、３６０、３６２、３６８、３７４、３８６和３９４位；其中２８８～２８９位的Ｇｌｕ呈较强负电势分布在表面，３００、３０７、３１５、３１７和３２０位的Ａｓｐ以及３１，３１６，３１９位的Ｇｌｕ形成一个较大的负电集团，也分布在蛋白质表面，这些部位可能会影响到分子间的识别和结合，其余负电散布在蛋白质内部．蛋白内部正负电荷分布相对较均匀，整体偏中性．２．６ 活性位点分析活性位点是指蛋白质立体结构中形成的能够结合配基的活性腔（口袋），利用Ｑ－ＳｉｔｅＦｉｎｄｅｒ软件对人ＳＥＰＴ ９蛋白的配基结合位点进行预测，结果（图６）表明，该蛋白总体积为２．６６６ ３Ｅ－２６ｍ３，含有１０个可能的配基结合位点，大多数靠近蛋白质结构表面；各位点空腔体积（见表２）有明显差异，体积最大的位点１和最小的位点９的体积分别为２．１６和１．２６Ｅ－２８ｍ３．表２表明，组成各配基结合位点的氨基酸残基种类和数目具有较明显差异，可能影响了不同位点的空腔大小．０１１河南师范大学学报（自然科学版） ２０１４年表２ 人ＳＥＰＴ９蛋白配基结合位点信息活性位点序号位点体积／（１Ｅ－３０ｍ３）活性位点氨基酸残基及其位置编号１ ２１６Ｓｅｒ１４８，Ｉｌｅ１５１，Ａｓｎ１５２，Ｓｅｒ１６８，Ｉｌｅ１７２，Ｐｒｏ１７３，Ｌｙｓ１７４，Ｔｈｒ１７５，Ｉｌｅ１７６，Ｇｌｕ１７７，Ｉｌｅ１７８，Ｌｙｓ１７９，Ｉｌｅ１８１，Ａｓｐ１９８２ ２００Ｔｙｒ３０９，ｐｒｏ３１０，Ｇｌｎ３１１，ｐｈｅ３１４，Ａｓｐ３１５，Ａｓｐ３２０，Ａｓｎ３２４，Ａｓｎ３８３，Ａｓｐ３８６，Ｉｌｅ３８７，Ｓｅｒ３９０，Ｉｌｅ３９１３ １６３Ｓｅｒ１４３，Ｇｌｙ１４４，Ｌｅｕ１４５，Ｇｌｙ１４６，Ｌｙｓ１４７，Ｓｅｒ１４８，Ｔｈｒ１４９，Ｉｌｅ１７２，ｐｒｏ１７３，Ｌｙｓ１７４，ｔｈｒ１７５，４ ２００Ａｓｎ１５２，Ｌｙｓ１５６，ｌｙｓ１６２，ｐｒｏ１６６，Ｔｈｒ１６７，Ｓｅｒ１６８，Ｇｌｕ１６９，Ｇｌｕ１７０，Ａｓｐ３３９，Ｈｉｓ３４０，Ｇｌｕ３４１，５ １５２Ｔｈｅ２９８，Ｌｅｕ３０１，Ｌ ｅｕ３０２，Ｉｌｅ３０６，Ａｓｐ３０７，Ｖａｌ３０８，Ｐｒｏ３１０，Ｇｌｎ３１１，Ｌｙｓ３１２，Ａｒｇ３２８，Ｉｌｅ３３１６ １７０Ｍｅｔ２６６，Ｌｙｓ２６７，Ａｒｇ２６８，Ｓｅｒ２７０，Ｌｙｓ２７１，Ｖａｌ２７２，Ａｓｎ３０４，Ｇｌｙ３０６，Ｉｌｅ３０７，Ａｓｐ３１１，Ｇｌｎ３１３，Ｐｈｅ３１４，Ｉｌｅ３８７，Ｉｌｅ３９１，Ｈｉｓ３９２７ １３４Ｇｌｎ２２８，ＧＬｕ２２９，Ｇｌｕ２３０，Ｖａｌ２３１，Ａｓｎ２３２，Ｉｌｅ２３３，Ａｓｎ２３４，Ｌｙｓ２３６，Ｉｌｅ２３９，Ｐｒｏ２４０８ １５３Ｇｌｕ１３４，Ａｓｎ１３６，Ｓｅｒ１８０，Ｔｈｒ１８２，Ｌｙｓ１９３，Ｔｈｒ１９５，Ｉｌｅ１９７，Ｐｈｅ２１８，Ｇｌｎ２２２，Ａｓｐ２４１，Ｔｈｒ２４２，Ａｒｇ２４３，Ｖａｌ２４４９ １２６Ａｓｎ２２０，Ｔｙｒ２２３，Ｌｙｓ２７１，Ｖａｌ２７２，Ｖａｌ２７３，Ｉｌｅ３９１，Ｈｉｓ３９２，Ｐｈｅ３９３，Ａｌａ３９５，Ｔｙｒ３９６，Ｌｙｓ３９９１０ １３３Ｉｌｅ１７８，Ｔｈｒ１９９，Ｐｒｏ２００，Ｇｌｙ２０１，Ｐｈｅ２０２，Ｇｌｙ２０３，Ｈｉｓ２０５，Ｃｙｓ２１１，Ｐｒｏ２１４，Ｉｌｅ２１５注：人ＳＥＰＴ ９蛋白体积为２．６６６３Ｅ－２．６ｍ３３ 讨论和结论本研究预测了人ＳＥＰＴ ９蛋白的二级结构，并以人ＳＥＰＴ ３蛋白结构为模板，采用同源建模方法首次获得了人ＳＥＰＴ ９蛋白的三维结构，模建的原子空间分布质量经拉氏图检验，蛋白质主链上大多数氨基酸的Φ角和Ψ角分布在合理的区域，并且原子空间结构（３Ｄ结构）和氨基酸序列（１Ｄ结构）的兼容性或适配性较好．通过对模建的三级结构可视化，清晰地表明，该蛋白具有７段α－螺旋和２组β－折叠结构，其中１组平行β－折叠片层结构由６个β折叠单链组成，位于蛋白质内部，另一组β－折叠片层结构由３个较小的β折叠单链组成，靠近蛋白质外部，无规则卷曲（包括β－转角）起着连接α－螺旋或β－折叠的作用，这是一个典型的α／β类蛋白；计算其表面电荷分布，表明该蛋白质表面呈弱正电势分布，有２个相对集中的负电集团，内部正负电荷分１１１第２期 王俊生，等：人ＳＥＰＴ ９蛋白同源建模和活性位点分析布较均匀．Ｑ－ＳｉｔｅＦｉｎｄｅｒ通过聚类蛋白质表面上范德华力（甲基）探针有利的区域来定位配体，该算法使用一个精度为基础的阈值来验证成功与否，精度定义为与配体距离１．６埃以内的探针在一个集群内的百分比，并且以２５％的精确度阈值来定义一个成功的预测［２６］．该算法已被证明在前３名有正确预测的情况下，对于Ｎｉｓｓｉｎｋ等描述的ＧＯＬＤ对接测试集（１３４个蛋白质－配体复合体）取得了９０％的成功预测［２７］．Ｑ ＳｉｔｅＦｉｎｄｅｒ预测的第一个位点作为结合位点平均准确率达到了６８％［２６］．本研究预测获得了人ＳＥＰＴ ９蛋白可能的配基结合位点有１０个，空腔体积大小不等，而这些位点体积大小与实际可能结合的配基体积大小差异较小，并具有较高的精确性，这一点在后续的分子对接、从头药物设计或结构鉴定或功能位点比较等研究中具有非常重要的作用［２５］．另外我们也利用基于口袋侦测算法的ＣＡＳＴｐ软件（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｓ．ｂｉｏｅｎｇｒ．ｕｉｃ．ｅｄｕ／ｃａｓｔｐ／ｖｉｅｗ／ｖｉｅｗｅｒ．ｐｈｐ）对该蛋白的配基结合位点进行了预测，结果预测的结合位点中口袋体积最大的位点１与Ｑ ＳｉｔｅＦｉｎｄｅｒ预测的位点１在氨基酸组成上仅２个氨基酸差异，即多了Ｔｈｒ１６７，但缺少了Ｉｌｅ１７８，基本可以肯定两者是同一个活性位点．在一般情况下，利用ＣＡＳＴｐ进行配基结合位点预测，有７４％的蛋白配基结合位点被确定位于最大的口袋［２８］，因此基于两种不同算法获得较为一致的预测结果，可以推测位点１应该是ＳＥＰＴ ９蛋白的真正活性位点，可以考虑把活性位点１作为后续研究重点，用于理论药物设计研究．当然其他配基结合位点能否成为真正的活性位点还需要通过其他技术方法进行进一步的研究．以上研究结果为进一步研究人ＳＥＰＴ ９蛋白结构与功能关系提供了理论依据，同时也为设计新型的人ＳＥＰＴ ９蛋白结构制剂，寻找神经性退行病、癌症和肿瘤缓解药物奠定了基础．参 考 文 献［１］ Ａｄａｍ Ｊ Ｃ，Ｐｒｉｎｇｌｅ Ｊ Ｒ，Ｐｅｉｆｅｒ Ｍ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｅｐｔｉｎｓ ｉｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（Ｐｒｉｎｔ），２０００，１１（９）：３１２３－３１３５．［２］ Ｓｈａｒｏｎ Ａ，Ｗａｎｇ Ｒ，Ｍａｔｚｋｉｎ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｍｓｆ－ａ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ－１ａｎｄ ａｕｇｍｅｎｔｓ ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ－ｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｏ ａｆｆｅｃｔ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６（６６）：８５６－８６６．［３］ Ｂａｒｒａｌ Ｙ，Ｍｅｒｍａｌｌ Ｖ，Ｍｏｏｓｅｋｅｒ Ｍ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｏｒｔｅｘ ｂｙ ｓｅｐｔｉｎｓ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｐｏｌａｒｉｔｙｉｎ ｙｅａｓｔ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，２０００，５（５）：８４１－８５１．［４］ Ｂｅｉｔｅｓ Ｃ Ｌ，Ｘｉｅ Ｈ，Ｂｏｗｓｅｒ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｓｅｐｔｉｎ ＣＤＣｒｅｌ－１ｂｉｎｄｓ ｓｙｎｔａｘｉｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２（５）：４３４－４３９．［５］ Ｂｅｒｌｉｎ Ａ，Ｐａｏｌｅｔｔｉ Ａ，Ｃｈａｎｇ Ｆ．Ｍｉｄ２ｐ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ ｓｅｐｔｉｎ ｒｉｎｇｓ ｄｕｒｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ ｉｎ ｆｉｓｓｉｏｎ ｙｅａｓｔ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，１６０（７）：１０８３－１０９２．［６］ Ｂｏｕｒｎｅ Ｈ Ｒ，Ｓａｎｄｅｒｓ Ｄ Ａ，Ｍｃｃｏｒｍｉｃｋ Ｆ．Ｔｈｅ ＧＴＰａｓｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３４９（６３０５）：１１７－１２７．［７］ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｓ Ｅ，Ｈａｌｌ Ｐ Ａ．Ｓｅｐｔｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ａ ｒｏａｄ ｌｅｓｓ ｔｒａｖｅｌｌｅｄ［Ｊ］．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，３９２（８／９）：７６３－７６７．［８］ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｅ Ａ，Ｐｅｔｔｙ Ｅ Ｍ．Ｃｏｎｑｕｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｏｒｌｄ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅｐｔｉｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１０，７７（６）：５１１－５２４．［９］ Ｃｏｎｎｏｌｌｙ Ｄ，Ａｂｄｅｓｓｅｌａｍ Ｉ，Ｖｅｒｄｉｅｒ－Ｐｉｎａｒｄ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｐｔｉｎ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，３９２（８／９）：７２５－７３８．［１０］ Ｒｏｅｓｅｌｅｒ Ｓ，Ｓａｎｄｒｏｃｋ Ｋ，Ｂａｒｔｓｃｈ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｐｔｉｎｓ，ａ ｎｏｖｅｌ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｉｎ ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ．［Ｊ］．Ｋｌｉｎｉｓｃｈｅ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｅ，２００９，２２１（３）：１５０－１５５．［１１］ Ｏｓａｋａ Ｍ，Ｒｏｗｌｅｙ Ｊ Ｄ，Ｚｅｌｅｚｎｉｋ－ｌｅ Ｎ Ｊ．ＭＳＦ（ＭＬＬ ｓｅｐｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｆｕｓｉｏｎ），ａ ｆｕｓｉｏｎ ｐａｒｔｎｅｒ ｇｅｎｅ ｏｆ ＭＬＬ，ｉｎ ａ ｔｈｅｒａｐｙ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｕｔｅ ｍｙｅ－ｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｗｉｔｈ ａｔ（１１；１７）（ｑ２３；ｑ２５）［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９９，９６（１１）：６４２８－６４３３．［１２］ Ｋａｌｉｋｉｎ Ｌ Ｍ，Ｓｉｍｓ Ｈ Ｌ，Ｐｅｔｔｙ Ｅ Ｍ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ ｓｐｌｉｃｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＭＬＬ ｓｅｐｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｆｕｓｉｏｎｇｅｎｅ（ＭＳＦ）ｔｈａｔ ｍａｐ ｔｏ ａ １７ｑ２５ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｌｏｓｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ ｏｖａｒｉａｎ ｔｕｍｏｒｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０００，６３（２）：１６５－１７２．［１３］ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｓ Ｅ，Ｍｃｉｌｈａｔｔｏｎ Ｍ Ａ，Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｊ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｓｅｐｔｉｎ ｇｅｎｅ ｔｏ ａ ｒｅｇｉｏｎ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １７ｑ，ｃｏｍ－ｍｏｎｌｙ ｄｅｌｅｔｅｄ ｉｎ ｓｐｏｒａｄｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｔｕｍｏｒｓ．［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，６０（１７）：４７２９－４７３４．［１４］ Ｓａｎｄｒｏｃｋ Ｋ，Ｂａｒｔｓｃｈ Ｉ，Ｂｌ ｓｅｒ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅｐｔｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．［Ｊ］．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，３９２（８／９）：７５１－７６１．［１５］ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｅ Ａ，Ｋａｌｉｋｉｎ Ｌ Ｍ，Ｓｔｅｅｌｓ Ｊ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｅｐｔ９ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｓｅｐｔ１４，ａ ｎｏｖｅｌ ｔｅｓｔｉｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｐｔｉｎ［Ｊ］．Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ，２００７，１８（１１）：７９６－８０７．２１１河南师范大学学报（自然科学版） ２０１４年［１６］ 吕讷男．Ｓｅｐｔｉｎ－９和Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ在卵巢上皮性癌患者外周血和肿瘤组织中的蛋白水平及其临床意义［Ｄ］．北京：北京协和医学院，２０１１．［１７］ Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｍ Ｅ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｅ Ａ，Ｐｒｉｖｅｔｔｅ Ｌ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ ＳＥＰＴ９＿ｖ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７，６７（１８）：８５５４－８５６４．［１８］ Ｔóｔｈ Ｋ，Ｇａｌａｍｂ Ｏ，Ｓｐｉｓáｋ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｓｅｐｔｉｎ ９ｇｅｎｅ ｏｎ ＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．［Ｊ］．Ｐａ－ｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，１７（３）：５０３－９５０．［１９］ Ｓｔａｎｂｅｒｙ Ｌ，Ｄ＇ｓｉｌｖａ Ｎ Ｊ，Ｌｅｅ Ｊ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ ＳＥＰＴ９＿ｖ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｉｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１０，３（４）：２３９－２４５．［２０］ Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｋ Ｌ，Ｒｏｍｉｇｈ Ｔ，Ｅｎｇ Ｃ．Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｆｉｖｅ ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ ｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｈｅａｄａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９，６９（２４）：９３０１－９３０６．［２１］ Ｈａｎｎｉｂａｌ Ｍ Ｃ，Ｒｕｚｚｏ Ｅ Ｋ，Ｍｉｌｌｅｒ Ｌ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｐｔ９ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｎｅｕｒａｌｇｉｃ ａｍｙｏｔ－ｒｏｐｈｙ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００９，７２（２０）：１７５５－１７５９．［２２］ 郭 佳．酿酒酵母轴向出芽地标蛋白Ｂｕｄ３ｐ与ｓｅｐｔｉｎ细胞骨架相互作用的研究［Ｄ］．武汉：武汉大学，２０１１．［２３］ Ｉｔｏ Ｍ，Ｏｋｕｉ Ｈ，Ｎａｋａｇａｗａ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｒｏｌｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｗｉｔｈ ｎ－ｓｕｌｆａｎｙｌ，ｓｕｌｆｉｎｙｌ，ａｎｄｓｕｌｆｏｎｙｌ ｍｏｉｅｔｉｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，１１（４）：４８９－４９４．［２４］ Ｓｈａｎｋａｒ Ｊ，Ｍｅｓｓｅｎｂｅｒｇ Ａ，Ｃｈａｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｐｓｅｕｄｏｐｏｄｉａｌ ａｃｔｉｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，７０（９）：３７８０－３７９０．［２５］ Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ Ｒ Ｌ，Ｆｅｉｎｇｏｌｄ Ｅ Ａ，Ｇｒｏｕｓｅ Ｌ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ １５，０００ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｃＤ－ＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，２００２，９９（２６）：１６８９９－１６９０３．［２６］ Ｌａｕｒｉｅ Ａ Ｔ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｒ Ｍ．Ｑ－ｓｉｔｅｆｉｎｄｅｒ：ａｎ ｅｎｅｒｇｙ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００５，９（２１）：１９０８－１９１６．［２７］ Ｎｉｓｓｉｎｋ Ｊ Ｗ，Ｍｕｒｒａｙ Ｃ，Ｈａｒｔｓｈｏｒｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｅｗ ｔｅｓｔ ｓｅｔ ｆｏｒ ｖａｌｉｄａｔｉｎｇ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２００２，４９（４）：４５７－４７１．［２８］ Ｄｕｎｄａｓ Ｊ，Ｏｕｙａｎｇ Ｚ，Ｔｓｅｎｇ Ｊ，ｅｔ ａｌ．ＣＡＳＴｐ：ｃｏｍｐｕｔｅｄ ａｔ ａｓ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｍａｐ－ｐｉｎｇ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ａｎｎｏｔａｔｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，３４：１１６－１１８．Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＳＥＰＴ９ Ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｉｔｓ Ａｃｔｉｖｅ ＳｉｔｅＷＡＮＧ Ｊｕｎｓｈｅｎｇ，ＲＵＡＮ Ｘｉａｎｌｅ，ＦＡＮ Ｘｉａｏｆａｎｇ，ＷＡＮＧ Ｙｏｎｇｌｉ，ＣＨＥＮ Ｌｏｎｇ（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｚｈｏｕｋｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｏｕｋｏｕ ４６６００１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＳＥＰＴ ９ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅ－ｑｕｅｎｃｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｉｔｓ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｏｔｉｆ ｗｅｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｂｙ ｏｎｌｉｎｅｗｅｂｓｉｔｅ．Ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ａｔｏｍｉｃ ｍｏｄｅｌ（３Ｄ）ｗｅｒｅ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ ｇｒａｐｈ ａｎｄ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ ３Ｄｖｓ１Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｔｈｅｎ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＳＥＰＴ ９ｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｑｕａｌｉｔｙ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ，ｉｔ ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｓｅｖｅｎα－ｈｅｌｉｘ ａｎｄ ｔｗｏ ｔｙｐｅｓ ｏｆβ－ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｔｒａｎｄ，ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏα／βｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｈｅｓｕｒｆａｃｅ ｉｎ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｐｐｅａｒｅｄ ｗｅａｋ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅ．Ｅｉｇｈｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｏｔｉｆ ｐａｔｔｅｒｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｗｈｉｃｈ ｍｅａｎｓ ｔｈａｔ ｉｔ ｍａｙ ｂｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｒ ｐｅｒｆｏｒｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ａｔ ｌａｓｔ，１０ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｉｇ－ａｎｄ－ｂｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｉｔｓ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｏｎｅ ｍａｙ ｂｅ ｉｔｓ ｒｅａｌ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｖｅｒｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ＳＥＰＴ ９ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｎｄ ａｌｓｏ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａｂａｓｉｃ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｏｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｄｅ ｎｏｖｏ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｈｕｍａｎ ｂｅｉｎｇ；ＳＥＰＴ ９ｐｒｏｔｅｉｎ；ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ；ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ３１１第２期 王俊生，等：人ＳＥＰＴ ９蛋白同源建模和活性位点分析。
粪肠球菌β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的克隆表达及酶学性质表征
生物技术进展２０１９年㊀第９卷㊀第３期㊀２９６~３０２ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１研究论文Ａｒｔｉｃｌｅｓ㊀收稿日期:２０１９￣０３￣０６ꎻ接受日期:２０１９￣０４￣０２㊀基金项目:上海市曙光计划项目(１５ＳＧ２８)ꎻ高等学校学科创新引智计划项目(Ｂ１８０２２)ꎻ中央高校基本科研业务费专项资金(２２２２１８１８０１４)资助ꎮ㊀作者简介:陈宝莉ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为糖生物工程ꎮＥ￣ｍａｉｌ:157****2007＠１６３.ｃｏｍꎮ∗通信作者:赵黎明ꎬ教授ꎬ博士ꎬ研究方向为分离提取技术㊁糖生物工程和生物基材料工程ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｚｈａｏｌｉｍｉｎｇ＠ｅｃｕｓｔ.ｅｄｕ.ｃｎ粪肠球菌β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的克隆表达及酶学性质表征陈宝莉ꎬ㊀秦㊀臻ꎬ㊀赵黎明∗华东理工大学生物工程学院ꎬ发酵工业分离提取技术研发中心ꎬ生物反应器工程国家重点实验室ꎬ上海２００２３７摘㊀要:Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖因其重要的功能活性而具有广阔的应用前景ꎬβ￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷是酶法制备Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖领域一类重要的糖苷水解酶ꎮ从粪肠球菌(Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ)基因组中克隆得到一个ＧＨ２０家族β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶基因(ＥｆＮａｇａｓｅ)ꎬ并在大肠杆菌中进行了异源表达ꎬ研究了重组酶的酶学性质ꎮ序列分析发现ＥｆＮａｇａｓｅ与已报道的ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＴＩＧＲ４来源的β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶序列相似度最高ꎬ为５２.０８％ꎮ对其酶学性质研究发现纯化后的ＥｆＮａｇａｓｅ比活力为３６０６.１０Ｕ/ｍｇꎬ在温度５０ħ㊁ｐＨ６.０的条件下活性最高ꎬ且在温度低于５０ħ㊁ｐＨ３.５~１１.５的范围内展现出较高的稳定性(残余酶活>９０％)ꎮβ￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶是酶法制备Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖中重要的一类糖苷水解酶ꎮ研究发现ＥｆＮａｇａｓｅ具有高酶活㊁高热稳定性和严格的底物特异性ꎬ在酶法制备Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖领域具有良好的应用潜力ꎮ关键词:β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶ꎻ粪肠球菌ꎻ克隆ꎻ表达ꎻ酶学性质ＤＯＩ:１０.１９５８６/ｊ.２０９５￣２３４１.２０１９.００２２ＣｌｏｎｉｎｇꎬＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆβ￣Ｎ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅｆｒｏｍＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓＣＨＥＮＢａｏｌｉꎬＱＩＮＺｈｅｎꎬＺＨＡＯＬｉｍｉｎｇ∗ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｒｅａｃｔｏｒＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＲ＆ＤＣｅｎｔｅｒｏｆＳｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＩｎｄｕｓｔｒｙꎬＥａｓｔＣｈｉｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＳｈａｎｇｈａｉ２００２３７ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:Ｎ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｈａｓｂｒｏａｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｓｐｅｃｔｓｄｕｅｔｏｉｔｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖｉｔｙ.β￣Ｎ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｇｌｙｃｏｓｉｄｅｈｙｄｒｏｌａｓｅｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＮ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ.Ａβ￣Ｎ￣ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓｗａｓｃｌｏｎｅｄａｎｄｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１.ＥｆＮａｇａｓｅｓｈｏｗｅｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｗｉｔｈＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＴＩＧＲ４β￣Ｎ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ(５２.０８％).ＴｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＥｆＮａｇａｓｅｄｉｓｐｌａｙｅｄｉｔｓａｃｔｉｖｉｔｙｏｎｐＮＰ￣ＧｌｃＮＡｃｗｉｔｈｓｐｅｃｉｆｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ３６０６.１０Ｕ/ｍｇ.Ｉｔｓｈｏｗｅｄｏｐｔｉｍａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｔ５０ħａｎｄｐＨ６.０.Ｉｔｅｘｈｉｂｉｔｅｄｕｌｔｒａ￣ｈｉｇｈｓｔａｂｉｌｉｔｙ(ｒｅｓｉｄｕａｌｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ>９０％)ａｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｂｅｌｏｗ５０ʎＣａｎｄｐＨ３.５~１１.５.β￣Ｎ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｃｌａｓｓｏｆｇｌｙｃｏｓｉｄｅｈｙｄｒｏｌａｓｅｉｎｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＮ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｂｙｅｎｚｙｍａｔｉｃｍｅｔｈｏｄ.ＴｈｉｓｓｔｕｄｙｆｏｕｎｄｔｈａｔＥｆＮａｇａｓｅｈａｄｈｉｇｈｅｎｚｙｍａｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙꎬｈｉｇｈｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｓｔｒｉｃｔｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙꎬｗｈｉｃｈｈａｓｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｔｏｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｔｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＮ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:β￣Ｎ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅꎻＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓꎻｃｌｏｎｉｎｇꎻｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎻｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ㊀㊀Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖是生物体内许多重要糖类的组成成分ꎬ也是甲壳类动物的骨骼和真菌细胞壁的最小组成单位ꎮＮ￣乙酰氨基葡萄糖通过β￣１ꎬ４糖苷键连接形成自然界中来源最广泛的天然聚糖之一 几丁质(ｃｈｉｔｉｎ)[１~３]ꎮ其年储量仅次于纤维素[４]ꎮ几丁质水溶性差㊁不利于吸. All Rights Reserved.收ꎬ因而难以被直接使用于食品和药品中ꎬ而几丁质的水解产物易溶于水㊁生物相容性好[５]ꎬ具有更大的应用潜力ꎮ研究发现Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖具有许多重要的生理功能ꎬ例如:改善皮肤水合程度㊁加速伤口愈合㊁提高人体免疫力㊁改善骨关节炎和抗肿瘤等ꎬ因此被广泛应用于医疗㊁食品和化妆品等多个领域[６~８]ꎮ在工业生产中ꎬＮ￣乙酰氨基葡萄糖目前主要通过降解几丁质制备得到ꎮ常用的降解方法包括化学法和生物法ꎮ其中化学降解主要为酸水解和氧化降解ꎬ存在副产物较多㊁污染严重的问题ꎻ相比之下ꎬ生物降解法产物纯度高ꎬ环境污染小且操作简单ꎬ成为近年来的研究热点[９ꎬ１０]ꎮ生物法降解几丁质涉及多种糖苷水解酶的作用ꎬ根据作用底物和产物类型的不同可分为内切型几丁质酶(ｅｎｄｏｃｈｉｔｉｎａｓｅꎬＥＣ３.２.１.１４)㊁外切型几丁质酶(ｅｘｏｃｈｉｔｉｎａｓｅꎬＥＣ３.２.１.２９)㊁几丁二糖酶(ｃｈｉｔｏｂｉｏｓｉｄａｓｅꎬＥＣ３.２.１.２９)和β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶(β￣Ｎ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅꎬＥＣ３.２.１.５２)[１１]ꎮ其中内切型几丁质酶可随机水解几丁质糖链ꎬ得到低聚合度寡糖ꎻ外切型几丁质酶和几丁二糖酶可特异性作用于几丁质的非还原端ꎬ得到几丁二糖或单糖ꎻβ￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶可作用于几丁寡糖的非还原端ꎬ最终水解得到Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖ꎮβ￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶在自然界中的来源较为丰富ꎬ存在于多种动植物㊁细菌和真菌体内ꎮＣＡＺｙ数据库(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃａｚｙ.ｏｒｇ)依据蛋白质序列进化关系对糖苷水解酶进行归类ꎬβ￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶主要分布在ＧＨ３㊁ＧＨ２０㊁ＧＨ８４和ＧＨ１１６家族中ꎮ本研究涉及的粪肠球菌是人和动物肠道内重要的菌群之一ꎬ其内存在丰富的碳水化合物代谢酶系[１２~１４]ꎬ是发掘高效β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶的潜在微生物来源ꎮ本研究克隆得到了粪肠球菌来源的β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶基因ＥｆＮａｇａｓｅꎬ成功进行了原核异源表达ꎬ并对其酶学性质进行了初步研究ꎬ为开发高稳定性的β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶奠定了理论基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀菌株与质粒粪肠球菌(ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓꎬＣＧＭＣＣ１.２１３５)由本实验室保存ꎻ大肠杆菌感受态细胞ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＨ５α㊁ＢＬ２１(ＤＥ３)均购于康为世纪生物科技有限公司(上海)ꎻｐＥＴ￣２８ａ(＋)载体由本实验室保存ꎮＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００㊁蛋白Ｍａｒｋｅｒ均购自ＴａＫａＲａ公司(大连)ꎻ细菌基因组ＤＮＡ快速抽提试剂盒ꎬＳａｎＰｒｅｐ柱式质粒ＤＮＡ小量抽提试剂盒㊁ＤＮＡ胶回收试剂盒㊁ＰＣＲ产物纯化试剂盒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司ꎻＴａｑＤＮＡ聚合酶购自Ｖａｚｙｍｅ生物科技有限公司(南京)ꎻ限制性内切酶ＮｈｅⅠ和ＸｈｏⅠ购自ＴａＫａＲａ公司(大连)ꎻＴ４连接酶购自ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ(美国)ꎻ对硝基苯基￣Ｎ￣乙酰β￣Ｄ￣氨基葡萄糖苷(ｐＮＰ￣ＧｌｃＮＡｃ)购自Ｓｉｇｍａ公司(美国)ꎻ几丁二糖购自Ｍｅｇａｚｙｍｅ公司(爱尔兰)ꎻ其他试剂均为国产或进口分析纯ꎮ１.２㊀ＥｆＮａｇａｓｅ序列分析根据ＮＣＢＩ数据库提供的粪肠球菌来源的ＧＨ２０家族潜在糖苷水解酶基因序列(ＧｅｎＢａｎｋ登录号:ＡＡＯ７９９８９.１)ꎬ使用ＤＮＡＭＡＮ软件分析核酸序列并确定酶切位点ꎻ利用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５软件设计引物ꎮ利用ＢｌａｓｔＰ(ｈｔｔｐｓ://ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/Ｂｌａｓｔ.ｃｇｉ)分析与其他蛋白的序列相似性ꎮ使用ＭＥＧＡ７.０软件按照Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ运算方法构建系统发育树[１５~１８]ꎮ１.３㊀ＥｆＮａｇａｓｅ基因扩增与原核表达序列分析表明粪肠球菌来源的ＡＡＯ７９９８９.１基因为多结构域糖苷水解酶ꎬ包含一个ＧＨ１８家族结构域(Ｎ端)及ＧＨ２０家族结构域(Ｃ端)ꎮ为了获得特异性ＧＨ２０家族β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖酶ꎬ本研究选取该基因中ＧＨ２０家族催化区进行进一步的克隆表达研究ꎮ按照细菌基因组ＤＮＡ快速抽提试剂盒说明书ꎬ提取Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ基因组ＤＮＡꎬ并以此为模板ꎬ利用聚合酶链式反应扩增ＧＨ２０家族结构域基因(命名为ＥｆＮａｇａｓｅ)ꎬ上下游引物分别为ＥｆＮａｇａｓｅ￣Ｆ:５ᶄ￣ＡＴＴＣＡＴＧＣＴＡＧＣＡＡＡＡＧＴＧＴＣＴＴ￣ＴＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＣ￣３ᶄ和ＥｆＮａｇａｓｅ￣Ｒ:５ᶄ￣ＡＴＴＣ￣ＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＡＡＣＣＡＣＣＡＴＡＴＡＣＴＣＡＣＧＡＴ￣３ᶄ(下划线部分别为酶切位点ＮｈｅⅠ和ＸｈｏⅠ)ꎮＰＣＲ程序为:９４ħ２ｍｉｎꎻ９４ħ３０ｓꎬ５２ħ３０ｓꎬ７２ħ２ｍｉｎꎬ共３０个循环ꎻ７２ħ１０ｍｉｎꎮ用１％琼脂糖凝胶电泳鉴定ＰＣＲ产物并胶回收ꎮ胶回收片段与载体ｐＥＴ￣２８ａ(＋)经限制性内切酶酶切后ꎬ７９２陈宝莉ꎬ等:粪肠球菌β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的克隆表达及酶学性质表征. All Rights Reserved.用Ｔ４连接酶连接ꎮ将连接产物热激转化至Ｅ.ｃｏｌｉＤＨ５α感受态细胞中ꎬ挑单菌落验证阳性克隆ꎬ重组质粒命名为ｐＥＴ￣２８ａ￣ＥｆＮａｇａｓｅꎮ将重组质粒热激转化至Ｅ.ｃｏｌｉＢＬ２１(ＤＥ３)感受态细胞中ꎬ挑取阳性克隆在ＬＢ液体培养基中ꎬ３７ħ恒温震荡培养至ＯＤ６００达到０.６~０.８后ꎬ转移至３０ħ恒温摇床培养ꎬ用１ｍｍｏｌ/Ｌ的ＩＰＴＧ诱导表达１０ｈꎮ用超声波破碎细胞获得粗酶液ꎬ离心收集上清液ꎬ上样至已预平衡的Ｎｉ￣ＩＤＡ亲和层析柱中ꎬ继续用平衡缓冲液(２０ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ５００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌꎬ２０ｍｍｏｌ/Ｌ咪唑)冲洗至ＯＤ２８０小于０.０５ꎬ再用洗脱缓冲液(２０ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ５００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌꎬ４０ｍｍｏｌ/Ｌ咪唑)洗至ＯＤ２８０小于０.０５ꎬ除去非特异性结合蛋白ꎬ最后用洗脱缓冲液(２０ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ５００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌꎬ２００ｍｍｏｌ/Ｌ咪唑)洗脱目的蛋白并收集目标组分ꎬ用ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ检测蛋白纯度ꎮ１.４㊀酶活力的测定蛋白含量测定:采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法进行测定[１９]ꎮ取１００μＬ适当稀释的纯酶液ꎬ加入１ｍＬ１ˑＢｒａｄｆｏｒｄ工作液ꎬ迅速混匀后室温反应３ｍｉｎꎮ以蒸馏水作空白对照ꎬ于５９５ｎｍ波长下测定吸光值ꎮ以牛血清白蛋白(ＢＳＡ)为标准品绘制标准曲线ꎬ计算纯酶液的蛋白含量ꎮβ￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活的测定(ｐＮＰＧ法)[２０]:取１００μＬ２ｍｍｏｌ/ＬｐＮＰ￣ＧｌｃＮＡＧ与５０μＬ０.２ｍｏｌ/Ｌ柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ６.０)混匀ꎬ５０ħ预热１０ｍｉｎꎬ加入５０μＬ适当稀释的纯酶溶液ꎬ迅速混匀５０ħ反应１０ｍｉｎꎬ最后加入２００μＬ０.５ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ溶液终止反应ꎮ冷却至室温ꎬ以蒸馏水作空白对照ꎬ于４１０ｎｍ波长下测定吸光值ꎮ酶活力单位(Ｕ)定义:在上述条件下ꎬ每分钟生成１μｍｏＬ对硝基苯酚所需的β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶酶量为１个酶活力单位ꎮβ￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活的测定(３ꎬ５￣二硝基水杨酸ꎬＤＮＳ法)[２１]:取３５０μＬ溶解在０.２ｍｏｌ/Ｌ柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ６.０)中ꎬ质量分数１％的几丁二糖溶液ꎬ再加入５０μＬ适当稀释的纯酶溶液ꎬ迅速混匀５０ħ反应１０ｍｉｎꎬ最后加入６００μＬＤＮＳ溶液ꎬ沸水浴煮沸１０ｍｉｎ终止反应ꎮ冷却至室温ꎬ１００００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ取上清液ꎮ以蒸馏水作空白对照ꎬ于５４０ｎｍ波长下测定吸光值ꎮ酶活力单位(Ｕ)定义:在上述条件下ꎬ每分钟生成１μｍｏＬＮ￣乙酰氨基葡萄糖所需的β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶酶量为１个酶活力单位ꎮ１.５㊀ＥｆＮａｇａｓｅ的酶学性质研究１.５.１㊀最适温度及温度稳定性的测定㊀将纯酶溶液溶于０.２ｍｏｌ/ＬｐＨ６.０的柠檬酸盐缓冲液并稀释至适当浓度ꎬ按１.４中的酶活测定方法测定该酶于不同反应温度(３５~７０ħ)下的酶活ꎬ以最高酶活点为１００％ꎬ确定其最适反应温度ꎮ将纯酶溶液溶于０.２ｍｏｌ/ＬｐＨ６.０的柠檬酸盐缓冲液并稀释至适当浓度ꎬ于不同温度条件下(３５~６０ħ)水浴保温３０ｍｉｎꎬ冰浴冷却１０ｍｉｎ后ꎬ按１.４中的酶活测定方法测定不同温度条件下该酶的残余酶活ꎬ以未经处理的酶活为１００％ꎬ确定其温度稳定性ꎮ１.５.２㊀最适ｐＨ及ｐＨ稳定性的测定㊀将纯酶溶液溶于不同ｐＨ缓冲体系(柠檬酸盐缓冲液:２.５~６.５ꎬ磷酸盐缓冲液:５.５~８.０ꎬＴｒｉｓ￣ＨＣｌ:７.５~９.０ꎬ甘氨酸￣ＮａＯＨ:９.０~１３.０)中并稀释至适当浓度ꎬ按１.４中的酶活测定方法测定该酶于不同ｐＨ缓冲体系下的酶活ꎬ以最高酶活点为１００％ꎬ确定其最适反应温度ꎮ将纯酶溶液分别溶于不同ｐＨ缓冲体系中ꎬ置于５０ħ水浴中保温３０ｍｉｎꎬ冰浴冷却１０ｍｉｎ后ꎬ按１.４中酶活测定方法测定不同ｐＨ缓冲体系中该酶的残余酶活力ꎬ以未经处理的酶活为１００％ꎬ确定其ｐＨ稳定性ꎮ１.５.３㊀ＥｆＮａｇａｓｅ底物特异性㊀分别以天然糖类(壳二糖㊁壳聚糖㊁几丁二糖和几丁质)和人工合成的糖苷(ｐＮＰ￣β￣Ｄ￣葡萄糖苷㊁ｐＮＰ￣ＧｌｃＮＡｃ)为底物ꎬ由于ＥｆＮａｇａｓｅ对上述天然糖类的水解活性较低ꎬ为了探索ＥｆＮａｇａｓｅ对于上述底物是否具有催化能力ꎬ采用ＴＬＣ法分析产物ꎮ将适量的天然糖类与纯酶溶液混匀５０ħ水浴保温１ｄꎬ用薄层层析法分析产物组成(展开剂为异丙醇:水:氨水＝１５ʒ１ʒ７.５)ꎮ按照１.４中酶活测定方法测定ＥｆＮａ￣ｇａｓｅ水解人工合成糖苷的能力ꎬ以水解释放对硝基苯酚的速率来计算酶活力ꎮ１.５.４㊀ＥｆＮａｇａｓｅ动力学参数㊀用５０ｍｍｏｌ/ＬｐＨ６.０的柠檬酸盐缓冲液配制１１个不同浓度(０.０２ｍｍｏｌ/Ｌ㊁０.０２５ｍｍｏｌ/Ｌ㊁０.０４ｍｍｏｌ/Ｌ㊁０.０５ｍｍｏｌ/Ｌ㊁０.０６７ｍｍｏｌ/Ｌ㊁０.１ｍｍｏｌ/Ｌ㊁０.２ｍｍｏｌ/Ｌ㊁０.２５ｍｍｏｌ/Ｌ㊁０.５ｍｍｏｌ/Ｌ㊁１ｍｍｏｌ/Ｌ㊁２ｍｍｏｌ/Ｌ)的ｐＮＰ￣ＧｌｃＮＡｃ底物ꎬ加入适宜浓度的β￣Ｎ￣乙酰８９２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.氨基葡萄糖苷酶酶液ꎬ５０ħ分别反应５ｍｉｎ㊁１０ｍｉｎ㊁１５ｍｉｎ㊁３０ｍｉｎ㊁６０ｍｉｎ㊁１２０ｍｉｎꎬ利用ＳｉｇｍａＰｌｏｔ软件计算Ｖｍａｘ和Ｋｍ值ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀ＥｆＮａｇａｓｅ序列分析Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ来源的ＧＨ２０家族潜在的β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶基因全长１１０１ｂｐꎬ编码３６７个氨基酸ꎮ通过ＮＣＢＩ数据库中Ｂｌａｓｔ结果显示ＥｆＮａｇａｓｅ氨基酸序列与ＧＨ２０家族中的ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＴＩＧＲ４(ＡＡＫ７６１９８.１)来源的β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶序列相似度最高ꎬ为５２.０８％ꎮ用ＭＥＧＡ７.０软件以Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ运算方法构建系统发育树ꎬ分析结果(图１)同样显示ＥｆＮａｇａｓｅ与ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＴＩＧＲ４具有最近的进化关系ꎮ图１㊀ＥｆＮａｇａｓｅ与ＧＨ２０家族不同来源的糖苷水解酶系统发育树分析Ｆｉｇ.１㊀Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆβ￣Ｎ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅｆｒｏｍＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓａｎｄＧＨ２０ｆａｍｉｌｙ.注:基于ＧＨ２０家族中不同来源的糖苷水解酶氨基酸序列ꎬ利用ＭＥＧＡ７.０软件采用Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ法构建系统发育树ꎬ序列编号附于括号中ꎮ２.２㊀ＥｆＮａｇａｓｅ基因扩增与原核表达以Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ基因组ＤＮＡ为模板ꎬ通过ＰＣＲ扩增得到ＥｆＮａｇａｓｅ基因片段ꎬ１％琼脂糖凝胶电泳鉴定(图２Ａ)得到一条大小约为１１００ｂｐ具有特异性的核酸条带ꎬ符合理论预期ꎮ通过限制性内切酶双酶切反应㊁目的基因与载体的连接反应ꎬ挑取单菌落测序为阳性克隆ꎬ得到成功构建的重组质粒ｐＥＴ￣２８ａ￣ＥｆＮａｇａｓｅꎮ将其转入Ｅ.ｃｏｌｉＢＬ２１(ＤＥ３)感受态细胞中后ꎬ用１ｍｍｏｌ/ＬＩＰＴＧ诱导ꎬ３０ħ㊁２００ｒ/ｍｉｎ培养１０ｈꎮ超声波破碎细胞壁ꎬ离心取上清液ꎬ利用Ｎｉ￣ＩＤＡ亲和层析柱分离纯化ꎮ通过ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ检测纯化产物的纯度ꎬ结果(图２Ｂ)显示成功获得可溶性表达的高纯度的目的蛋白条带ꎬ分子量约为４０ｋＤａꎬ符合预期ꎮ以ｐＮＰ￣ＧｌｃＮＡＧ为底物检测纯化后的ＥｆＮａｇａｓｅ酶学性质ꎬＥｆＮａｇａｓｅ的比活力为３６０６.１Ｕ/ｍｇꎻ以几丁二糖为底物检测到ＥｆＮａｇａｓｅ的比活力为３５２.６０Ｕ/ｍｇꎮ图２㊀ＰＣＲ扩增产物琼脂糖凝胶电泳(Ａ)及重组蛋白ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳(Ｂ)结果Ｆｉｇ.２㊀Ａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ(Ａ)ａｎｄＳＤＳ￣ＰＡＧＥ(Ｂ)ｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ.Ａ:Ｍ:ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１ꎬ２:ＥｆＮａｇａｓｅ基因ＰＣＲ产物ꎻＢ:Ｍ:蛋白Ｍａｒｋｅｒꎻ１:粗酶液ꎻ２:纯酶液ꎮ２.３㊀ＥｆＮａｇａｓｅ酶学性质研究２.３.１㊀最适温度和温度稳定性㊀在相同ｐＨ条件９９２陈宝莉ꎬ等:粪肠球菌β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的克隆表达及酶学性质表征. All Rights Reserved.下ꎬ测定ＥｆＮａｇａｓｅ在不同反应温度下(３５~７０ħ)的酶活力ꎮ结果如图３Ａ所示ꎬＥｆＮａｇａｓｅ为中温酶ꎬ在５０ħ时酶活最高ꎻ当温度高于７０ħ时ꎬＥｆＮａｇａｓｅ失去活性ꎮ将酶液分别孵育于不同温度(３５~７０ħ)条件下３０ｍｉｎꎬ按标准酶活测定方法测其残余酶活ꎮ结果如图３Ｂ所示ꎬＥｆＮａｇａｓｅ在孵育温度低于５０ħ时表现出极高的热稳定性ꎬ酶活基本没有损失ꎬ延长孵育时间至一周ꎬ其残余酶活仍高于８０％ꎻ当孵育温度高于５０ħꎬＥｆＮａｇａｓｅ的稳定性开始降低ꎮ图３㊀重组蛋白ＥｆＮａｇａｓｅ的最适温度(Ａ)与温度稳定性(Ｂ)Ｆｉｇ.３㊀Ｏｐｔｉｍｕｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ(Ａ)ａｎｄｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｉｔｙ(Ｂ)ｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＥｆＮａｇａｓｅ.２.３.２㊀最适ｐＨ和ｐＨ稳定性㊀在５０ħꎬ不同ｐＨ缓冲液体系中测定ＥｆＮａｇａｓｅ的酶活力ꎮ结果如图４Ａ所示ꎬＥｆＮａｇａｓｅ的最适ｐＨ为６.０ꎻ当ｐＨ在５.０~７.０之间时ꎬ相对酶活高于５０％ꎬ且当ｐＨ５.０~６.５时ꎬＥｆＮａｇａｓｅ在柠檬酸盐缓冲体系中的相对酶活比在磷酸盐缓冲体系中的更高ꎻ当ＥｆＮａｇａｓｅ在ｐＨ高于７.５的条件下ꎬ酶活明显降低ꎮ将酶液分别溶于不同ｐＨ缓冲体系中５０ħ孵育３０ｍｉｎꎬ按标准酶活测定方法测定残余酶活ꎮ结果如图４Ｂ所示ꎬＥｆＮａｇａｓｅ具有极高的ｐＨ稳定性ꎬ在很宽的ｐＨ范围内(ｐＨ３.５~１１.５)残余酶活均高于９０％ꎻ当ｐＨ低于３.０时ꎬ残余酶活仍维持在７０％以上ꎻ当ｐＨ高于１２.５ꎬ残余酶活出现了大幅度下降ꎮ图４㊀重组蛋白ＥｆＮａｇａｓｅ的最适ｐＨ(Ａ)与ｐＨ稳定性(Ｂ)Ｆｉｇ.４㊀ＯｐｔｉｍｕｍｐＨ(Ａ)ａｎｄｐＨｓｔａｂｉｌｉｔｙ(Ｂ)ｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＥｆＮａｇａｓｅ.２.３.３㊀ＥｆＮａｇａｓｅ的底物特异性及动力学参数㊀分别以天然糖类(壳二糖㊁壳聚糖㊁几丁二糖和几丁质)和人工合成的ｐＮＰ￣β￣Ｄ￣葡萄糖苷㊁ｐＮＰ￣ＧｌｃＮＡｃ为底物ꎮ用ＴＬＣ检测ＥｆＮａｇａｓｅ水解几丁二糖的反应历程ꎬ结果如图５所示ꎬＥｆＮａｇａｓｅ可在６０ｍｉｎ内将几丁二糖完全水解成为Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖ꎮ而ＥｆＮａｇａｓｅ对几丁质的水解率很低ꎬ且不能水解壳二糖㊁壳聚糖ꎮ用ｐＮＰＧ法检测发现ＥｆＮａｇａｓｅ对ｐＮＰ￣ＧｌｃＮＡｃ表现出高的水解活性ꎬ不能水解其他人工合成的ｐＮＰ底物ꎮ结果表明ＥｆＮａｇａｓｅ对几丁二糖和ｐＮＰ￣ＧｌｃＮＡｃ有更高的特异性ꎬ对氨基葡萄糖衍生物没有催化活性ꎮ以００３生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.图５㊀薄层层析检测ＥｆＮａｇａｓｅ水解几丁二糖的反应历程Ｆｉｇ.５㊀ＴＬＣａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｔｉｍｅｃｏｕｒｓｅｏｆｃｈｉｔｉｎｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｂｙｐｕｒｉｆｉｅｄＥｆＮａｇａｓｅ.Ｍ:Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖与几丁二糖标准品ꎻ５ꎬ１０ꎬ１５ꎬ３０ꎬ６０ꎬ１２０:分别表示ＥｆＮａｇａｓｅ水解反应了５ｍｉｎꎬ１０ｍｉｎꎬ１５ｍｉｎꎬ３０ｍｉｎꎬ６０ｍｉｎꎬ１２０ｍｉｎꎮｐＮＰ￣ＧｌｃＮＡｃ为底物ꎬ检测得到ＥｆＮａｇａｓｅ的Ｖｍａｘ及Ｋｍ分别为５２０.３７μｍｏｌ/ｍｉｎ ｍｇ和０.５９９ｍｍｏｌ/Ｌꎮ３㊀讨论Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖由于其众多重要的生理活性而备受关注ꎬβ￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶作为酶法绿色制备Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖中具有重要意义的水解酶之一ꎬ也受到学者的广泛研究ꎮ本研究从粪肠球菌中克隆得到的β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶(ＥｆＮａｇａｓｅ)ꎬ通过相似度比对和构建系统进化树ꎬ确定其应归属ＧＨ２０家族糖苷水解酶ꎮ目前ꎬβ￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶主要分布在ＧＨ３㊁ＧＨ２０㊁ＧＨ８４和ＧＨ１１６家族中ꎬ其中ＧＨ２０家族的发现和研究最多ꎮ虽然目前已有报道的β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶很多ꎬ但普遍存在酶活较低的缺点ꎬ大约超过７０％的β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活低于１００μｍｏｌ/ｍｉｎ ｍｇ[２２]ꎮ相对于其他家族的β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶ꎬＧＨ２０家族的酶活更高ꎬＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ.来源[２３]的β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶水解ｐＮＰ￣ＧｌｃＮＡｃ的比活力为１７７３.１μｍｏｌ/ｍｉｎ ｍｇꎬ水解几丁二糖的比活为４８１.４μｍｏｌ/ｍｉｎ ｍｇꎻＳｈｉｎｅｌｌａｓｐ.来源[２４]的β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶水解ｐＮＰ￣ＧｌｃＮＡｃ的比活力为５３８.８μｍｏｌ/ｍｉｎ ｍｇꎬ水解几丁二糖的比活为３５.４μｍｏｌ/ｍｉｎ ｍｇꎮＥｆＮａｇａｓｅ以ｐＮＰ￣ＧｌｃＮＡｃ为底物的比活为３６０６.１０Ｕ/ｍｇꎬ以几丁二糖为底物的比活力为３５２.６０Ｕ/ｍｇꎬ已远高于多数其他来源的β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶ꎮＥｆＮａｇａｓｅ在温度５０ʎＣ㊁ｐＨ６.０的条件下活性最高ꎬ这和其他多数β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶性质相近ꎮ近６０％的β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶的最适温度在３７~５０ħꎬ最适ｐＨ多在５~８之间[２５]ꎮＥｆＮａｇａｓｅ展现出了良好的温度稳定性ꎬ在温度低于５０ħ的条件下孵育一周ꎬ其残余酶活仍高于８０％ꎻ且具有良好的ｐＨ稳定性ꎬ在ｐＨ３.５~１１.５的范围内展现出高的稳定性(残余酶活>９０％)ꎮ适用于大部分食品㊁化学和医药工业的生产条件ꎮ研究还表明ＥｆＮａｇａｓｅ对ｐＮＰＧ和几丁二糖有较强的水解活性和底物特异性ꎮＥｆＮａｇａｓｅ的优良性质为其在食品㊁化学㊁医药工业以及环境生物技术等领域中的应用奠定了基础ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＢｈａｔｔａｃｈａｒｙａＤꎬＧｕｐｔａＮＲＫ.Ｂａｃｔｅｒｉａｌｃｈｉｔｉｎａｓｅｓ:Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｐｏｔｅｎｔｉａｌ[Ｊ].Ｃｒｉｔ.Ｒｅｖ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２００７ꎬ２７(１):２１－２８.[２]㊀ＹａｄａｖＶꎬＰａｎｉｌａｉｔｉｓＢꎬＳｈｉＨꎬｅｔａｌ..Ｎ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ６￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ(ｎａｇＡ)ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒＮ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕ￣ｃｏｓａｍｉｎｅａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎｉｎＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｓ[Ｊ].ＰＬｏＳＯＮＥꎬ２０１１ꎬ６(６):ｅ１８０９９.[３]㊀ＣｈｅｎＪＫꎬＳｈｅｎＣＲꎬＹｅｈＣＨꎬｅｔａｌ..Ｎ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｃｈｉｔｉｎｂｙｃｈｉｔｉｎｄｅｇｒａｄｉｎｇｆａｃｔｏｒｓｉｎｃｈｉｔｉｎｂａｃｔｅｒｔａｉｎａｎｅｓｉｓ[Ｊ].Ｉｎｔ.Ｊ.Ｍｏｌ.Ｓｃｉ.ꎬ２０１１ꎬ１２(２):１１８７－１１９５. [４]㊀ＬｉａｑａｔＦꎬＥｌｔｅｍＲ.Ｃｈｉｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ:Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ.Ｐｏｌｙｍ.ꎬ２０１８ꎬ１８４:２４３－２５９.[５]㊀ＰｈｉｌＬꎬＮａｖｅｅｄＭꎬＭｏｈａｍｍａｄＩＳꎬｅｔａｌ..Ｃｈｉｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａ￣ｒｉｄｅ:Ａｎｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｗｉｔｈｔｈｅｐｒｏｐｏｓｉｔｉｏｎｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｍａｌｄｅｇ￣ｒａｄａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓ[Ｊ].Ｂｉｏｍｅｄ.Ｐｈａｒｍ.Ｂｉｏｍｅｄ.Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ.ꎬ２０１８ꎬ１０２:４３８－４５１.[６]㊀王春茹ꎬ郭晓风ꎬ单胜艳.天然型Ｎ￣乙酰￣Ｄ￣氨基葡萄糖的生理功效及市场前景[Ｊ].食品研究与开发ꎬ２０１４ꎬ３５(２):１３１－１３４.[７]㊀ＷｅｉｍｅｒＳꎬＰｒｉｅｂｓＪꎬＫｕｈｌｏｗＤꎬｅｔａｌ..Ｄ￣Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｓｕｐｐｌｅ￣ｍｅｎｔａｔｉｏｎｅｘｔｅｎｄｓｌｉｆｅｓｐａｎｏｆｎｅｍａｔｏｄｅｓａｎｄｏｆａｇｅｉｎｇｍｉｃｅ[Ｊ].Ｎａｔ.Ｃｏｍｍｕｎ.ꎬ２０１４ꎬ５:３５６３.[８]㊀ＨｕｌｉｋｏｖａＫꎬＳｖｏｂｏｄａＪꎬＢｅｎｓｏｎＶꎬｅｔａｌ..Ｎ￣Ａｃｅｔｙｌ￣ｄ￣ｇｌｕ￣ｃｏｓａｍｉｎｅ￣ｃｏａｔｅｄｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅｄｅｎｄｒｉｍｅｒｐｒｏｍｏｔｅｓｔｕｍｏｒ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃＢｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｖｉａｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｉｎｔ.Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ.ꎬ２０１１ꎬ１１(８):９５５－９６１. [９]㊀ＷａｎｇＳＬꎬＬｉｕＣＰꎬＬｉａｎｇＴＷ.Ｆｅｒｍｅｎｔｅｄａｎｄｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｈｉｔｉｎ/ｃｈｉｔｏｓａｎｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｂｙｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ１０３陈宝莉ꎬ等:粪肠球菌β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的克隆表达及酶学性质表征. All Rights Reserved.ｃｈｉｔｉｎａｓｅｓｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓＴＫＵ０２７[Ｊ].Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ.Ｐｏｌｙｍ.ꎬ２０１２ꎬ９０(３):１３０５－１３１３.[１０]㊀ＪｕｎｇＷＪꎬＰａｒｋＲＤ.Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｈｉｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ:Ｐｒｅｓｅｎｔａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ[Ｊ].ＭａｒｉｎｅＤｒｕｇｓꎬ２０１４ꎬ１２(１１):５３２８－５３３５.[１１]㊀ＪｅａｎＣꎬＶａｉｙａｐｕｒｉＢꎬＤｉｖｙａＶꎬｅｔａｌ..Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｃｈｉｔｉｎａｓｅｓｔｏｅｎｈａｎｃｅｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｌｅｔｔ.ꎬ２０１３ꎬ３５(１１):１７１９－１７３２.[１２]㊀ＬｅｉｓｎｅｒＪＪꎬＬａｒｓｅｎＭＨꎬＩｎｇｍｅｒＨꎬｅｔａｌ..Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｏｍ￣ｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｒｅｌａｔｅｄｃｈｉｔｉｎａｓｅｓｆｒｏｍＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＥＧＤａｎｄＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓＶ５８３[Ｊ].Ｊ.Ａｐ￣ｐｌ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.ꎬ２０１０ꎬ１０７(６):２０８０－２０８７.[１３]㊀ＲｏｂｅｒｔｓＧꎬＴａｒｅｌｌｉＥꎬＨｏｍｅｒＫＡꎬｅｔａｌ..Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｎｅｎ￣ｄｏ￣ｂｅｔａ￣Ｎ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｍｅｄｉａｔｅｓｇｒｏｗｔｈｏｆＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓｏｎａｈｉｇｈ￣ｍａｎｎｏｓｅ￣ｔｙｐｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ[Ｊ].Ｊ.Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ.ꎬ２０００ꎬ１８２(４):８８２－８９０.[１４]㊀Ｓｅｒｒａｎｏ￣ｍａｌｄｏｎａｄｏＣＥꎬＧａｒｃíａ￣ｃａｎｏＩꎬＧｏｎｚáｌｅｚ￣ｃａｎｔｏＡꎬｅｔａｌ..ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌＮ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕ￣ｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ(ＡｔｌＤ)ｆｒｏｍＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ[Ｊ].Ｊ.Ｍｏｌ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１８ꎬ２８(１):１４－２７.[１５]㊀ＢｒｙｓｏｎＶꎬＶｏｇｅｌＨＪ.Ｅｖｏｌｖｉｎｇｇｅｎｅｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｓｃｉ￣ｅｎｃｅꎬ１９６５ꎬ１４７(３６５３):６８－７１.[１６]㊀ＳａｉｔｏｕＮꎬＮｅｉＭ.Ｔｈｅｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄ:Ａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｓ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.Ｅｖｏｌ.ꎬ１９８７ꎬ６８(２):１９７－２１１.[１７]㊀ＫｕｍａｒＳꎬＳｔｅｃｈｅｒＧꎬＴａｍｕｒａＫ.ＭＥＧＡ７:Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｏｌｕ￣ｔｉｏｎａｒｙｇｅｎｅｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｖｅｒｓｉｏｎ７.０ｆｏｒｂｉｇｇｅｒｄａｔａｓｅｔｓ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.Ｅｖｏｌ.ꎬ２０１６ꎬ３３(７):１８７０－１８７４.[１８]㊀ＦｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎＪ.Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅｌｉｍｉｔｓｏｎｐｈｙｌｏｇｅｎｉｅｓ:Ａｎａｐｐｒｏａｃｈｕｓｉｎｇｔｈｅｂｏｏｔｓｔｒａｐ[Ｊ].Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎꎬ１９８５ꎬ３９(４):７８３－７９１. [１９]㊀ＢｒａｄｆｏｒｄＭＭ.Ａｒａｐｉｄａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｇｒａｍｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｕｔｉｌｉｚｉｎｇｔｈｅｐｒｉｎ￣ｃｉｐｌｅｏｆｐｒｏｔｅｉｎ￣ｄｙｅｂｉｎｄｉｎｇ[Ｊ].Ａｎａｌｙｔ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.ꎬ１９７６ꎬ７２(１－２):２４８－２５４.[２０]㊀ＱｉｎＺꎬＬｕｏＳꎬＬｉＹꎬｅｔａｌ..ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆａｎｏｖｅｌｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓａｎｄｉｔｓｕｓｅｉｎｍｅｍ￣ｂｒａｎｅｒｅａｃｔｏｒ[Ｊ].ＬＷＴꎬ２０１８ꎬ９７:９－１６.[２１]㊀ＱｉｎＺꎬＣｈｅｎＱＭꎬＬｉｎＳꎬｅｔａｌ..Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ￣ｔｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌｃｏｌｄ￣ａｄａｐｔｅｄｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｃｈｉｔｏｏｌｉｇｏ￣ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ[Ｊ].ＦｏｏｄＣｈｅｍ.ꎬ２０１８ꎬ２５３:１３９－１４７.[２２]㊀ＲｕｉＺꎬＺｈｏｕＪꎬＳｏｎｇＺꎬｅｔａｌ..Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆβ￣Ｎ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅｓ[Ｊ].Ａｐｐｌ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１８ꎬ１０２(１):９３－１０３.[２３]㊀ＺｈｏｕＪꎬＳｏｎｇＺꎬＺｈａｎｇＲꎬｅｔａｌ..Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｂｉ￣ｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆａｇｌｙｃｏｓｉｄｅｈｙｄｒｏｌａｓｅｆａｍｉｌｙ２０β￣Ｎ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅａｎｄｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ[Ｊ].ＢＭＣＢｉｏｔｅｃｈ￣ｎｏｌ.ꎬ２０１７ꎬ１７(１):３７－５１.[２４]㊀ＺｈｏｕＪꎬＳｏｎｇＺꎬＺｈａｎｇＲꎬｅｔａｌ..ＡＳｈｉｎｅｌｌａβ￣Ｎ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕ￣ｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅｏｆｇｌｙｃｏｓｉｄｅｈｙｄｒｏｌａｓｅｆａｍｉｌｙ２０ｄｉｓｐｌａｙｓｎｏｖｅｌｂｉ￣ｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ[Ｊ].Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈ.ＬｉｆｅＵｎｄｅｒＥｘｔｒｅｍｅＣｏｎｄｉｔ.ꎬ２０１７ꎬ２１(４):１－１１.[２５]㊀刘阳ꎬ杨雅麟ꎬ张宇婷ꎬ等.维氏气单胞菌Ｂ５６５β￣Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖苷酶的表达㊁纯化及酶学性质[Ｊ].中国生物工程杂志ꎬ２０１５ꎬ３５(２):３８－４４.２０３生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.。
利用CRISPR/Cas9技术创制大豆高油酸突变系
/ E-mail: zwxb301@
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2019.84157
CRISPR/Cas9 系统是近几年开发的一种准确、 便捷、高效率的生物基因组编辑方法。通过向导 RNA 的介导和 Cas9 蛋白的切割来实现对靶基因的 定点编辑[23]。目前, CRISPR/Cas9 系统已经成功应 用 在 拟 南 芥 [24] 、 玉 米 [25]、 小 麦 [26]、 水 稻 [27-28] 、 大 豆[29]等植物中。Jacobs 等[29]第一次利用 CRISPR/ Cas9 技术在大豆中实现了定点突变。Cai 等[30]利用 CRISPR/Cas9 技术原理选取３个不同靶位点, 首次 应用农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化体系, 成功 创制出稳定遗传的大豆突变体材料。该技术应用在 大豆基因功能研究中起到重要作用, 然而, 应用在 大豆育种上的报道较少。本研究利用 CRISPR/Cas9 技术, 定点编辑了控制油酸含量的关键基因 FAD2-1A (Glyma10g42470), 并获得纯合 FAD2-1A 突变体, 对大豆分子育种和提高大豆品质具有重要 意义, 为进一步提高大豆品质奠定了重要的材料 基础。
脂肪酸, 性质稳定, 抗氧化作用强, 在人体的脂类 代谢中能降低有害胆固醇, 保持有益胆固醇, 从而 减缓动脉粥样硬化, 有效预防心血管疾病发生的几 率[7-8]。因此, 提高油酸的相对含量, 增加油酸/亚油 酸的比值, 已成为大豆品质改良育种的重要目标 之一。
所有生物的脂肪酸合成途径基本类似, 但是, 动物和酵母的脂肪酸合成主要在细胞质中进行, 而 植物脂肪酸合成主要发生在质体中和内质网上[9]。 在脂肪酸合成途径中, Δ12-脂肪酸脱饱和酶(deltatwelve fatty acid desaturase 2 enzyme, FAD2)是催化 油酸转化为亚油酸的关键酶[10]。目前, 拟南芥[11]、 棉花[12]、向日葵[13]、大豆[14]等植物中的 FAD2 基因 已经被克隆。大豆中存在 2 个 FAD2 基因, 分别为 FAD2-1 和 FAD2-2, 是 2 个非等位基因。其中, FAD2-1 基因在种子中特异性表达, 是决定种子油酸含量的 主 要 基 因 [15] 。 基 于 稳 定 性 及 磷 酸 化 作 用 不 同 , FAD2-1 基因又分为 FAD2-1A 和 FAD2-1B 两种[14]。 抑制或过表达 FAD2-1A 和 FAD2-1B 基因, 可以显著 提高或降低油酸/亚油酸比例[16-18]。Li 等[16]研究发现, 酵母细胞中不含有亚油酸, 而通过在酵母细胞中过 表达 GmFAD2-1B 基因后, 亚油酸的含量显著提高, 说明 GmFAD2-1B 基因是亚油酸代谢途径中的关键 基因。Pham 等[17-18]分 别获得 FAD2-1A 突变体与 FAD2-1B 突变体, 以及 FAD2-1A/FAD2-1B 双突变体 材料, 并发现无论是单突变还是双突变体中, 大豆 的油酸含量均显著提高。Wang 等[19]利用 RNAi 技术, 获得干涉 FAD2 基因转基因植株, 并发现转基因大 豆油酸含量高达 71.5%~81.9%。Zhang 等[20]和 Yang 等[21]分别通过 RNAi 技术, 获得油酸含量为 51.71% 和 27.38%~80.42%的干涉 FAD2-1B 基因转基因大 豆 。 Haun 等 [22]利 用 人 工 核 酶 技 术 定 点 突 变 大 豆 FAD2-1A 和 FAD2-1B 基 因 , 获 得 油 酸 含 量 高 达 80%的转基因大豆。因此, FAD2-1A 与 FAD2-1B 在决 定大豆种子油酸含量中起着重要作用, 是调控油酸 含量的 2 个主要基因[15]。
2,4-二氯苯氧乙酸和6-糠氨基嘌呤诱导苦瓜愈伤组织的研究
定 的药 用 价值 。 目前 有关 苦 瓜 的文 献 ， 主要 是 阐述其 品种 特性 ， 般 栽 培技 术 和性 状 调 控 Ｉ 而通 过 现 代 一 ６ ］ 。
苦瓜 愈 伤组 织 的诱 导 。将 无 菌苗 的上胚 轴 ， 下胚 轴 ， 叶切 割 成 ０５厘 米 左 右 的 小 段 ， 种 到 脱 分 化 子 ． 接
升 ；下胚 轴在 ２４ Ｄ 为 ０６毫克 ／升 和 Ｋ 为 ２０毫克 ／升 以及 ２４ Ｄ 为 ０８毫克 ／升 和 Ｋ 为 ３０ ，一 ． Ｔ ． ，一 ． Ｔ ．
毫 克 ／升 。
关键 词 ： 苦瓜 ； 织培 养 ； 伤 组 织 ；，一 Ｋ 组 愈 ２４ Ｄ； Ｔ 苦瓜 是 葫 芦科 苦 瓜属 蔓 性 １ 生蔬 菜 作 物【 年 ” 。其 含有 的多种 活性成分 ， 具有 降血糖［ 抗肿 瘤［ 抗 突 ２ 】 ， ３ １ ， 分 钟 ，． ０１ 化 汞 浸 种 ３ 钟 ， 菌 水 冲 洗 ， 种 到 ％氯 Ｏ分 无 接
培养基培养 ，观察不 同激素配 比诱导愈伤组织生长 情 况 ， 录 结果 。 记
对 良性 松 散 、 沙状 、 黄绿 色 的 苦瓜 愈伤 组 织 细 淡 胞 团进 行 继代 培 养 ， 出其 良性 的愈 伤组 织 细胞 。 得
化的植物组织培养技术对其进行研究 的还少有报道。 建立苦 瓜 细胞 悬 浮 体 系 的对 苦瓜 细胞 快 速 培养 ， 大规 模 的生产 出有 用 的 次级代 谢 产物 具有 重 要意 义 。
NaF对酸性海藻糖酶酶活测定的影响及作用机制探讨
NaF对酸性海藻糖酶酶活测定的影响及作用机制探讨谭海刚1,2，郭学武1，王亚洲1，肖冬光1（1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457）（2.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛 266109）摘要：研究了氟化钠对酵母酸性海藻糖酶酶活力测定的影响。
构建己糖转运蛋白基因缺失突变株TL-105(hxt14∆)和TL-106 (gal2∆)，分析氟化钠对菌株BY6-9α(亲本菌株)、TL-103(ath1∆)、TL-104(agt1∆)、TL-105(hxt14∆)和TL-106(gal2∆)酸性海藻糖酶酶活力、海藻糖酶分泌、海藻糖分泌、葡萄糖摄取和葡萄糖分泌的影响，结果表明，氟化钠对中性海藻糖酶、酸性海藻糖酶和海藻糖分泌均无影响，说明氟化钠对酸性海藻糖酶酶活力测定的影响与海藻糖酶和海藻糖分泌无关。
在稳定期，柠檬酸法测得菌株TL-105(hxt14∆)和TL-106(gal2∆)的酸性海藻糖酶酶活力分别比亲本菌株提高了17.06%和300.23%，而柠檬酸氟化钠法测得菌株BY6-9α、TL-105(hxt14∆)和TL-106(gal2∆)的酸性海藻糖酶酶活力却相差不大，同时，在对数期，菌株BY6-9α和TL-103(ath1∆)在酸性海藻糖酶酶活力测定前（氟化钠30 ℃诱导30 min）溶液中葡萄糖含量分别达到108.53±1.39和30.53±1.02 mg/L，这说明氟化钠能显著影响菌株对胞外葡萄糖的摄取并导致胞内葡萄糖的分泌，从而使测得的酸性海藻糖酶酶活力较高。
关键词：酵母；氟化物；酸性海藻糖酶基因；发酵；酶文章篇号：1673-9078(2014)6-64-69Effects and Mechanisms of Sodium Fluoride on Assay of AcidT rehalase ActivityT AN Hai-gang1,2, GUO Xue-wu1, W ANG Y a-zhou1, XIAO Dong-guang1(1.College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)(2.College of Food Science and Technology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)Abstract: The effect of sodium flu oride on the determination of acid trehalase activity in baker’s yeast was investigated in this study. The recombinant baker’s yeast stains TL-105(hxt14∆) and TL-106(gal2∆) with deleted genes encoding the hexose transporters were constructed. The acid trehalase activity, the secretion of neutral trehalase and acid trehalase, the secretion of glucose and trehalose and the uptake of extracellular glucose of BY6-9α(parental strain), TL-103(ath1∆), TL-104(agt1∆), TL-105(hxt14∆) and TL-106(gal2∆) were measured. It was found that sodium fluoride had less effect on the secretion of neutral trehalase, acid trehalase and trehalose, although it had obvious effect on the assay of acid trehalase activity. Thus, sodium fluoride was not related to the secretion of intracellular trehalase or trehalose in the assay of acid trehalase activity. The acid trehalase activity, examined by citrate procedure, of strains TL-105(hxt14∆) and TL-106(gal2∆) at the stationary phase was 17.06% and 300.23% higher than those of the parental strain, respectively. However, the acid trehalase activities of the three strains examined by citrate and sodium fluoride method showed less difference. Furthermore, the extracellular glucose concentration of strains BY6-9α and TL-103(ath1∆) at the exponential phase, which was incubated at 30 ℃for 30 min with sodium fluoride before the acid trehalase activity was assayed, was 108.53±1.39 and 30.53±1.02 mg/L in the reaction mixture, respectively. These results indicated that sodium fluoride significantly affected the uptake of ex tracellular glucose and led to the secretion of intracellular glucose.Hence, the acid trehalase activity of the strains treated with sodium fluoride was higher than those without sodium fluoride treatment.Key words: yeast; fluoride; acid trehalase genes; fermentation; enzymes海藻糖是两个葡萄糖以α(1,1)键连接的非还原性收稿日期：201401-05基金项目：国家自然科学基金资助项目（31171730）；国家高技术研究发展计划（863计划）（2013AA102106）；教育部“长江学者和创新团队发展计划”（IRT1166）作者简介：谭海刚（1979-），男，博士，讲师，研究方向：现代酿造技术通讯作者：肖冬光（1956-），男，教授，博导，研究方向：现代酿造技术二糖，在冷冻、高盐、高温等环境应力条件下，其含量可达菌体干重的25%以上[1~2]。
蔗糖及一些渗透剂对紫草培养细胞中红色素释放的效应
蔗糖及一些渗透剂对紫草培养细胞中红色素释放的效应
许赣荣;钟建江
【期刊名称】《食品与生物技术学报》
【年(卷),期】1993(000)004
【摘要】紫草悬浮培养细胞在胞内产生并积蓄花青苷（红色素）。
通过实验发现用一些渗透剂如甲苯，氯仿，聚乙二醇辛基苯基醚，二甲亚砚，醋酸和乙醇等处理培养细胞，可使细胞内的红色素释放出来。
培养的紫草细胞一般在含３％蔗糖浓度的ＬＳ培养基中生长，当提高蔗糖浓度至４．－％－４．５％时，细胞生长量及色素的产量均有增加。
实验结果表明，蔗糖浓度的提高不仅可以增加碳源，而且更重要的原因还可能是蔗糖渗透压的影响，在高糖浓度也即高
【总页数】1页(P281)
【作者】许赣荣;钟建江
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】TS241
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探讨了南瓜水溶性多糖提取的工艺条件,采用单因素试验和L9(34)正交试验设计,研究了不同提取温度、时间、次数和料液比等单因素对南瓜多糖提取率的影响.并采用水杨酸法检测羟基自由基(-OH),AP-TEMED法检测超氧阴离子自由基(O2),研究了南瓜多糖清除·OH和O2的效果.结果表明,最佳提取条件为:1∶40的料液比,在70℃水浴条件下提取3次,每次提取4 h.抗氧化试验表明南瓜多糖具有较好的抗氧化活性,是一种效果好、安全性高的新型天然抗氧化物质.
作者：李俊丽向长萍 LI Jun-li XIANG Chang-ping 作者单位：华中农业大学园艺林学学院/园艺植物生物学教育部重点实验室/国家蔬菜改良中心华中分中心,武汉,430070 刊名：湖北农业科学ISTIC PKU英文刊名：HUBEI AGRICULTURAL SCIENCES 年，卷(期)：2006 45(5) 分类号：S642.1 O629.12 关键词：南瓜多糖提取抗氧化性。
“贝壳多孔羟基磷灰石基骨修复材料的研发”取得重大进展
行 ，预测该项技术在产 区扩大 推广 以后 ，将 可使本地 区乃 准号： １ＸＭＵ ０－０ ， Ｑ／２ Ｏ １ １）填补了国内在骨修复领域的一项 ２ ｏ 至全国沿海的鲆鲽类养殖综合 效益大幅度提升 ，养殖 产品 空 白。 由于该项目采用废弃贝壳资源 ， 不但可以保护环境 ， 还 有 望打入 国际市场 ，对推进我 国海 水养殖工业化进程 将起 可 以变废为宝 ， 创造社会和经济效益 ， 符合 国际低碳发展战
该系统运行一 年来 ，运行状态 稳定 、高 效 ，所养 的鲆 前， 项目研发的ＸＭＵ ｌ 该 －型贝壳多孔羟基磷灰石基骨修复材
度快 、养殖周 期短 、资源 消耗 低等特点 ，有效保证 了９ ％ 和三 致反应， ５ 主要技术指标已达到国际上 同类产品标准。 的水资源重复利用 ，所 有车间 内除人工 投饵外 ，其他管理 工作 完全 由微 机统 一操 作 ，取得 了 明显 的经济 、社 会和 批 量生产， 课题 组 已经根据 中华人 民共和 国标准法 ， 制定了 生态效 益。这种 生产模 式 已在该 试验站 的８ 个车 间全面进 ＸＭＵ １ －型贝壳多孔羟基磷灰石基骨修复材料 的企业标准（ 标
使全封 闭的循环 水养殖技术与 装备 取得 了重大突破 ，现 已 以废 弃贝壳为原 材料 ， 提取 羟基磷灰石和壳聚糖 ， 研发一种
建成规模化 的全封闭式养殖车 间多个、率先步入 循环 利用 新型 的骨修 复材料， 既可应用于骨科、 形外科、 整 五官科 手
资源的低碳养殖 。 鲽类和试养 的石斑鱼 、河 术， 也可作为载体 材料用于组织 工程和控 缓释药物制剂。目 等海水鱼类 ，都 表现 出生 长速 料 经理化测试 和生物学评价， 无发现毒 副作用、 过敏 、 热原 为 了对 该产 品实施 质量管 理 ， 并进 行医 院临床试用和
水飞蓟宾对α-鹅膏毒肽所致小鼠急性肝损伤的保护作用研究
目录摘要......................................................................................................................................... I Abstract .. (i)第一章前言 (1)第二章实验部分 (6)1 试验材料 (6)1.1 受试药物、试剂 (6)1.2 试验仪器 (6)1.3 试验动物 (7)2 试验方法 (7)2.1 给药剂量 (7)2.2 分组 (7)2.3 溶液的制备 (7)2.4 α-鹅膏毒肽小鼠LD50试验 (8)2.5 用LD50 α-鹅膏毒肽建立小鼠急性肝损伤的时效曲线 (8)2.6 四种保肝药物对LD50 α-鹅膏毒肽所致小鼠急性肝损伤的治疗作用 (9)2.7 水飞蓟宾对LD90 α-鹅膏毒肽所致小鼠急性肝损伤的预防性和治疗性作用 (9)2.8 水飞蓟宾对LD50 α-鹅膏毒肽所致小鼠急性肝损伤的治疗作用 (10)3 统计学处理 (10)4 试验结果 (11)4.1 α-鹅膏毒肽小鼠LD50试验 (11)4.2 用LD50 α-鹅膏毒肽建立小鼠急性肝损伤的时效曲线 (13)4.3 四种保肝药物对LD50 α-鹅膏毒肽所致急性肝损伤治疗作用 (17)4.4 水飞蓟宾对LD90 α-鹅膏毒肽所致小鼠急性肝损伤的预防性和治疗性作用 (20)4.5 水飞蓟宾对LD50 α-鹅膏毒肽所致小鼠急性肝损伤的治疗作用 (24)5 讨论 (28)参考文献 (35)致谢 (38)攻读硕士期间发表的论文 (39)水飞蓟宾对α-鹅膏毒肽所致小鼠急性肝损伤的保护作用研究摘要目的：建立α-鹅膏毒肽所致小鼠急性肝损伤模型，评价水飞蓟宾对α-鹅膏毒肽所致小鼠急性肝损伤的保护作用。
方法：用改良寇氏法计算α-鹅膏毒肽所致小鼠急性肝损伤的LD50和LD90。
天然维生素E及其抗氧化机理
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传播
引发剂
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天然维生素 " 的抗氧化机理
根据大量文献报道，维生素 ( 具有抗氧化性，
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家蚕翅原基发育的研究进展
原 基 的生长 处于 次要状 态［ ３ ］ 。
蛹 、成 虫 四个 阶 段 的完 全 变态 发 育 。 家蚕 的翅 属 于 内翅 类 ，翅 原基 （ｉｇ ｉ ） 在胚 胎 期就 已经特 ｗｎ ｓ ｄｃ
的结果使翅原基在幼虫期 的变化不 明显 ，五龄开 始 翅 原基 的形 态才 发 生 了 巨大 的变 化圜 。这 个 过 程
中 ，不 乏 关 于 翅 原 基 形 态 变 化 ，激 素 调 控作 用 的
研 究 ，还 有 相 当多 的研 究 是 从 分 子 层 面 上 揭 示 翅 原 基 的变化 。
关键词 ： 家蚕 ；翅 原基 ；激 素 ；发 育 ；相 关基 因 ；研 究
中 图分 类 号 ：￥ ８ ． ８１ ２ 文献 标识 码 ：Ａ 文章 编号 ： ２ ９ — ２ ５２ １ ）１ ４ — ４ ０ ５ １ ０ （０ ２０ — ４ ０
翅 膀 对 于 有 翅 亚 纲 （ｔ ｙｏ ） 昆 虫 的 觅 食 、 Ｐｅ ｇｔ ｒ ａ
化 出来 ，将来发育为翅芽 。幼虫期翅原基位 于第
２ 胸 节 两 侧 的 内壁 上 ，蛹期 翅 芽 位 于 蛹 翅 的 下 、３ 方 ，蜕 皮 后 发 育 为 成 虫 的前 后 翅 。缩 短 趋势 进化
通 过 石 蜡 切 片 技 术 ，制 作 翅 原基 生 长 过 程 的 连续 切 片 ，我 们 可 以观 察 到翅 原 基 是 包 被 在 翅 囊
求偶 、躲避敌害、扩大分布等发挥了重要的作用【 ｌ 】 。
自然 选 择使 有 翅 亚 纲 中 的 昆虫 的翅 朝 着 最 有 利 于 它 们 生存 、繁衍 的方 式 进 化 ，让 昆虫 有 了姿 态 万
植物GH3 基因家族的功能研究概况
植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (5): 507−515, w w 收稿日期: 2008-01-16; 接受日期: 2008-04-23基金项目: 973计划(No.2004CB117300)* 通讯作者。
E-mail: kxtang@.c n.综述.植物GH3基因家族的功能研究概况黎颖, 左开井, 唐克轩*上海交通大学农业与生物学院植物生物技术研究中心, 上海 200240摘要 植物GH3基因是一种典型的植物生长素原初反应基因, 此类基因与植物的生长发育密切相关。
GH3基因在植物生长素信号途径、光信号途径以及植物的防卫反应中起着重要作用。
植物GH3蛋白具有植物生长素氨基酸化合成酶活性, 这有助于维持植物生长素的动态平衡。
该文介绍拟南芥等植物中GH3基因的生物学功能研究概况和最新进展, 为植物GH3基因家族的进一步研究提供参考。
关键词 拟南芥, 植物生长素, GH3基因家族, 动态平衡黎颖, 左开井, 唐克轩 (2008). 植物G H3基因家族的功能研究概况. 植物学通报 25, 507−515.植物生长素(au xi n)影响植物的细胞分裂和增殖、植物的向光性和向重力性, 是一种重要的植物激素(W oodward and Bartel, 2005)。
植物生长素能够诱导一些基因的快速高表达, 这类基因被称为生长素原初反应基因。
植物生长素原初反应基因包括3个主要类别,分别是Aux/IAA 、SAUR 和GH3基因家族(Guilfoyle et al., 1998; Liscum and Reed, 2002)。
1987年, 第1个GH3基因在大豆(Glycine max )中被发现, 后来人们又陆续在拟南芥(Arab idopsis thaliana )、烟草(Nicotiana tabacum )和水稻(Oryza sativa )等植物中发现了相应的GH3基因(W right et al., 1987; Staswick et al., 2005)。
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★活動目的與議程
★與會貴賓介紹 ★計畫總辦公室介紹 ★各推動中心介紹
★時程規劃
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教育部代表
陳全木
胡郁芬 丁詩同
顧問/國立中興大學生命科學院院長
教育部資訊與科技教育司
專題講者
行政院科技會報 副執行秘書
李文權
錢宗良
農業科技研究院院長
國立臺灣大學解剖學暨細胞生物學研究所教授
7
諮詢委員-農業生技
吳金洌 廖一久 翁仲男 游汝謙 賴本智 黃木秋 周錦生 黃鵬林 江德敏 蔣丙煌 施明哲 蔡新聲
中央研究院農業生物科技研究中心 主任
朝陽科技大學生化科技研究所 講座教授 8
8
諮詢委員-醫藥生技
林淑華
國立臺灣大學醫學檢驗暨生物科技學系 教授 百衛國際事業有限公司 副總經理 國立臺灣大學解剖學暨細胞生物學研究所教授 宇智顧問股份有限公司 董事長(馮志峰副總 經理代出席) 中央研究院 院士
高百毅
錢宗良 徐小波 王惠鈞 林榮耀
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項目
10:10~10:30 10:30~10:45
10:45~11:00 11:00~11:15 11:15~11:30 11:30~11:45 11:45~12:00 12:00~13:00
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高階課程 - 生技關鍵技術 - 跨領域生技課程 跨領域生技產業 菁英培訓團隊 跨領域 生技產業學程 1.博士後 2.教師 3.醫師 4.業界菁英
醫藥生技 種子創業團隊 1.碩博士 2.博士後 3.教師 4.業界人才
生技創新創業觀摩會
成果展示 舉辦媒合會 推薦產業接收實習 11
參加國際展示及觀摩
計畫總辦公室
15:20~15:30
15:30~15:40
15:40~15:50
15:50~16:00
16:00~16:20
16:20~16:50 16:50~
專題演講II：創新創業在農 李文權 農業科技研究院院長 科院 國立陽明大學(醫藥) 吳俊忠院長 議題討論 I ：發掘潛力創業 東海大學(醫藥) 顧野松系主任 團隊 國立成功大學(醫藥) 張權發副教授 國立臺灣大學(農業) 蕭寧馨副主任 議題討論II：有效招收學員 國立臺灣師範大學(跨領域) 謝振傑教授 策略 臺北醫學大學(醫藥) 吳介信院長 茶敘 義守大學(跨領域) 蕭介夫校長 議題討論 III ：規劃及教授課程 東海大學(農業) 江文德院長 措施 國立臺灣大學(跨領域) 林發暄教 授 國立成功大學(農業) 蔣鎮宇主 任 議題討論IV：成果評比 國立交通大學(醫藥) 黃憲達副 院長 Break 生醫產業與新農業跨領域人才 錢宗良 國立臺灣大學解剖學暨細胞 培育計畫說明 生物學研究所教授 綜合討論 賦歸
★時程規劃
2
活動目的
□促進各推動中心間與計畫總辦公室之交流
□105年計畫成果展及執行經驗分享 □促使未來更有效推動及執行計畫
3
議程
時間 8:30~ 9:00~9:20 9:20~9:40 9:40~9:50 9:50~10:10 主持人/報告人 臺中高鐵站發車前往中興大學 報到 致詞及計畫概述 貴賓致詞 拍團體照 專題演講I ：生技醫藥產業創新 丁詩同 行政院科技會報副執行秘書 推動方案 茶敘 國立中興大學(農業) 徐堯煇教授 國立臺灣海洋大學(農業) 吳彰哲教 計畫分享：跨校/跨國資源 授 國立清華大學(醫藥) 黎耀基教授 計畫分享：校園創新創業資源 國立中興大學(醫藥) 洪慧芝研發 長 中原大學(跨領域) 吳宗遠教授 計畫分享：區域資源 綜合討論 午餐時間
國立臺灣師範大學 講座教授/院士 國立陽明大學藥理學科暨研究所 教授
中央研究院基因體研究中心 特聘研究員 安盟生技股份有限公司 執行長 國立政治大學科技管理研究所 教授
9 9
戚謹文 張子文
馬永霖 陳桂恒
★活動目的與議程
★與會貴賓介紹 ★計畫總辦公室介紹 ★各推動中心介紹
★時程規劃
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組織架構
教育部生技產業創新創業人才培育計畫總辦公室 農業生技產業教學實習推動中心 產學營運中心、技轉育成中心 法人基金會、業界團體 生技產業創新創業課程 - 農業生技關鍵技術 - 跨領域生技課程 農業生技產業 聯合教學團隊 農業生技 種子創業團隊 1.碩博士 2.博士後 3.教師 4.業界人才 跨領域生技產業 菁英培訓推動中心 諮詢委員會 醫藥生技產業教學實習推動中心 產學營運中心、技轉育成中心 法人基金會、業界團體 生技產業創新創業課程 - 醫藥生技關鍵技術 - 跨領域生技課程 醫藥生技產業 聯合教學團隊
教育部「生技產業創新創業人才培育計畫」
105年度成果展暨106年計畫交流會議
Training Program on Innovation and Entrepreneurship of Biotechnology
106年5月18日
國立中興大學 楊長賢副校長
1
★活動目的與議程
★與會貴賓介紹Biblioteka ★計畫總辦公室介紹 ★各推動中心介紹
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★活動目的與議程
★與會貴賓介紹 ★計畫總辦公室介紹 ★各推動中心介紹
★時程規劃
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106年度推動中心
國立臺灣海洋大學
桃 竹 中原大學(跨)
北 基
國立臺灣海洋大學(農) 國立臺灣大學(農、跨) 國立臺灣師範大學(跨) 國立陽明大學(醫) 臺北醫學大學(醫)
中央研究院 秘書長 國立臺灣海洋大學 春暉講座教授/院士 普力德生物科技股份有限公司 副董事長 金銥生命科學股份有限公司 董事長 台大蘭園 董事長 國立中興大學動物科學系 榮譽特聘教授 亞洲基因科技股份有限公司 總經理 國立臺灣大學生物科技研究所 教授 漢神國際實業股份有限公司 創辦人 衛生福利部 部長
計 畫 主持人
楊長賢 副校長/講座教授
國立中興大學生物科技學研究所
共 共 同 同 主持人 主持人
總辦 助理
張大慈 教授兼所長
國立清華大學分子與細胞生物研究所
邱詩羽、柯玟亘：
•計畫總辦公室(興大)、農業推動中心、跨領域推動中心
曾筱茜：
•計畫總辦公室(清大)、醫藥推動中心
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計畫網站
共 同 主持人
.tw/~iebt/