四种豆子纳豆发酵工艺条件的研究

四种豆子纳豆发酵工艺条件的研究
四种豆子纳豆发酵工艺条件的研究
摘要
纳豆是一种传统的发酵豆制品，除了含有丰富的营养物质外，还含有一
种具有强烈溶栓功效的纳豆激酶( Nattokinas，简称NK)，其独特的保健功
效受到了国内外很多学者的关注。

近年我国心脑血管病患病率处于持续上升
态势，为了预防和治疗这种因血粘度过高而产生的疾病，大力推广纳豆产品
是尤为重要的。

虽然国内的纳豆深加工产品品种繁多，但纳豆糕点类产品却
少见报道;此外，传统纳豆多以黄豆为原材料，品种较为单一。

基于以上问
题，本研究分别选用黄豆、黑豆、鹰嘴豆和芸豆作为纳豆发酵主要原料，对
四种豆子的鲜纳豆发酵和纳豆粉干燥进行了工艺条件优化，并开发了一种新
型茶香木糖醇纳豆糕产品，主要研究内容和结论包括四个方面。

(1)四种豆子的纳豆发酵条件的研究。

以纳豆芽抱杆菌活菌数、NK活
性、产品感官质量为发酵的三个指标，通过单因素试验和正交试验，分析得
出黄豆纳豆发酵工艺的最佳条件:黄豆常温下浸泡16h，接种量为4.5%，在
37℃条件下，发酵18h;黑豆纳豆发酵工艺的最佳条件:黑豆常温下浸泡20h,
接种量为2.0%，在37℃条件下，发酵20h;鹰嘴豆纳豆发酵工艺的最佳条
件:鹰嘴豆在常温下浸泡20h，接种量为1.5%，在37℃条件下，发酵16h;
芸豆纳豆发酵工艺的最佳条件:芸豆在常温下浸泡14h，接种量为4.0%，在
37℃条件下，发酵12h0
(2)纳豆干燥工艺条件的研究。

通过对比真空冷冻干燥、电热真空干燥、
热风干燥对黄豆纳豆纤溶活性和含水量的影响，确定了纳豆最佳干燥工艺，
即热风干燥，温度为50 0C，时间为32h0
(3)纳豆粉颗粒形态的观察。

将干燥后的纳豆制粉，利用扫描电镜
( Scanning Electron Microscopy, SEM)观察其颗粒形态，由于纳豆粉不是
单一物质而是复合物，因此四种纳豆粉的特性不一，分别具有不同的极性、
吸附性和勃连性，导致在粉碎过程中机械作用下造成了形状各异的颗粒结
构。

(4)茶香木糖醇纳豆糕配方的研究。

通过单因素试验、正交试验，确定
茶香木糖醇纳豆糕的最佳配方:黄豆纳豆粉lkg，绿茶粉30g，食用油SOOmL,
木糖醇350g。

在研究茶香木糖醇纳豆糕保藏方式时发现，添加3%海藻糖不
仅可以保持纳豆较高的NK活力和大量的纳豆芽抱杆菌活菌数，而且对产品
有一定的矫臭、除臭和保鲜的作用，延长了产品的货架期。

关键词:豆子，纳豆发酵，热风干燥，纳豆粉，纳豆糕配方
目录
摘要....................................... ......................................... ......................................... . (I)
ABSTRACT.................................
......................................... ......................................... .. (III)
1前言....................................... ......................................... ......................................... . (1)
1.1纳豆的定义、起源与分类....................................... ......................................... .. (1)
1.2纳豆营养价值与保健功效....................................... ......................................... .. (1)
1.2.1纳豆的营养价值....................................... ......................................... .. (1)
1.2.2纳豆的保健功效....................................... ......................................... .. (3)
1.3纳豆芽抱杆菌的研究进展....................................... ......................................... .. (5)
1.3.1纳豆芽抱杆菌的起源和种类....................................... .. (5)
1.3.2纳豆芽抱杆菌的相关鉴定方法....................................... . (5)
1.4纳豆激酶的相关研究进展....................................... ......................................... .. (6)
1.4.1纳豆激酶的发现与定义....................................... ......................................... .. (6)
1.4.2纳豆激酶的生化特性....................................... ......................................... (6)
1.4.3纳豆激酶的溶栓机理....................................... ......................................... (6)
1.4.4纳豆激酶酶活的测定方法....................................... (7)
1.5纳豆的干燥方法研究现状....................................... ......................................... .. (9)
1.6纳豆的开发应用....................................... ......................................... (9)
1.6.1纳豆在食品领域的开发与应用....................................... . (9)
1.6.2纳豆在非食品领域的开发与应用....................................... . (10)
1.7本课题的主要目的、意义和研究内容....................................... (10)
1.7.1研究的目的和意义....................................... ......................................... .. (10)
1.7.2研究的内容....................................... ......................................... .. (11)
2四种豆子纳豆发酵条件的优化....................................... ......................................... .. (12)
2.1引言....................................... ......................................... ......................................... . (12)
2.2实验材料与仪器....................................... ......................................... . (13)
2.2.1原料与试剂....................................... ......................................... .. (13)
2.2.2主要仪器与设备....................................... ......................................... (13)
2.2.3菌种.......................................
(14)
2.2.4培养基....................................... .........................................
(14)
2.3实验方法....................................... ......................................... . (14)
2.3.1真空冷冻干燥菌种的恢复培养....................................... .. (14)
2.3.2纳豆芽抱杆菌个体形态的鉴定....................................... .. (14)
2.3.3测定纳豆芽抱杆菌生长曲线....................................... (14)
2.3.4纳豆感官指标的评价....................................... ......................................... . (15)
2.3.5纳豆芽抱杆菌活菌数的测定....................................... (15)
2.3.6纳豆激酶酶活力的测定方法....................................... (16)
2.4实验结果与分析....................................... ......................................... . (17)
2.4.1纳豆芽抱杆菌个体形态的鉴
(17)
2.4.2纳豆芽抱杆菌生长曲线的测定....................................... .. (18)
2.4.3四种纳豆发酵条件的优化....................................... . (1)
9
2.5本章小结....................................... ......................................... . (30)
3纳豆粉的制备及其颗粒形态的观察....................................... ......................................... (32)
3.1引言....................................... ......................................... ......................................... . (32)
3.2实验材料与仪器....................................... ......................................... . (32)
3.2.1原料与试剂....................................... ......................................... .. (32)
3.2.2主要仪器与设备....................................... ......................................... (32)
3.3实验方法....................................... ......................................... . (33)
3.3.1纳豆粉制备流程....................................... ......................................... (33)
3.3.2三种干燥方法对黄豆纳豆NK活力和含水量的影响 (33)
3.3.3四种纳豆粉颗粒的形态观察....................................... (34)
3.4实验结果与分析....................................... ......................................... . (34)
3.4.1真空冷冻干燥对黄豆纳豆NK活力的影响....................................... (34)
3.4.2电热真空干燥对黄豆纳豆NK活力的影响....................................... (35)
3.4.3热风干燥对黄豆纳豆NK活力的影响....................................... .. (35)
3.4.4纳豆粉的制备....................................... ......................................... . (36)
3.4.5扫描电镜观察结果....................................... ......................................... .. (36)
3.5本章小结....................................... ......................................... . (38)
4茶香木糖醇纳豆糕的研制....................................... ......................................... . (40)
4.1引言....................................... ......................................... ......................................... . (40)
4.2实验材料与仪器....................................... ......................................... . (41)
4.2.1原料与试剂....................................... ......................................... .. (41)
4.2.2主要仪器与设备....................................... ......................................... (41)
4.3实验方法....................................... ......................................... . (42)
4.3.1茶香木糖醇纳豆糕的质量评
(42)
4.3.2茶香木糖醇纳豆糕最佳配方的优化....................................... (42)
4.3.3海藻糖对茶香木糖醇纳豆糕中NK活力和纳豆芽抱杆菌的影响...............
43
4.3.4茶香木糖醇纳豆糕中纳豆芽抱杆菌活菌数、NK活性测定 (43)
4.3.5茶香木糖醇纳豆糕的理化、卫生指标检验....................................... (43)
4.4实验结果与分析....................................... ......................................... . (44)
4.4.1茶香木糖醇纳豆糕最佳配方的优化....................................... (44)
4.4.2海藻糖对茶香木糖醇纳豆糕中NK活力和纳豆芽抱杆菌的影响...............
46
4.4.3茶香木糖醇纳豆糕纳的理化、卫生指标检验结果.......................................
49
4.5本章小结....................................... ......................................... . (49)
5结论与展
......................................... ......................................... .. 50
5.1结论....................................... ......................................... ......................................... . (50)
5.2展望与设想....................................... ......................................... (51)
致谢....................................... ......................................... ......................................... . (52)
参考文献....................................... ......................................... ......................................... . (53)
攻读学位期间发表的学术论文目录....................................... ......................................... . (58)
原创性声明及关于学位论文使用授权的声明....................................... .. (59)
1
目U舀
1.1纳豆的定义、起源与分类
传统纳豆是以大豆为原料，接种纳豆芽抱杆
菌(Baciiiu sbtiiis natto)后，在一定条件下通过发酵而制成的一种豆类食品。

追溯纳豆的历史，距今已有数千年之久，虽然国内外各界针对其起源持有不同的看
法，但多数人认为纳豆的雏形来源于中国的豆豉。

唐天宝13年(公元754年)鉴真东渡
口本带去了豆豉及其制作技术，由于当时豆豉最初是在寺庙的厨房(纳所)制作出来的，
因此称其为纳豆!0。

口本民间自制纳豆的现象产生于江户时代，如今纳豆已经成为大多
数口本人生活中必不可少的食物之一[z]。

明治维新之后，纳豆的流行不再仅限于东京，
而是逐渐推广至全国。

随着科技的进步，冷冻技术得到了一定的发展与完善，从而推动
了纳豆从小作坊生产逐步向工厂化生产的转变。

纳豆的相关行业标准也于80年代初期制
订完成!3]。

随着时间推移，各项研究发现经常食用纳豆的人抵抗能力和健康状况相对比
较好。

人们开始重视纳豆的保健功效，这使得纳豆在口本得到了广泛并迅速的推广。

即
使口本处于经济不景气的时期，纳豆食品产业也并未受到巨大的经济损失[[4]
纳豆、豆豉和天培均为发酵后的大豆制品。

豆豉早在我国汉朝的《史记》中就有记
载!，}。

天培则是我国移民针对印尼爪哇岛独特的气候条件因地制宜，根据豆豉工艺原理生
产的另一种发酵大豆制品!6]。

在唐朝时期豆豉伴随着佛教文化一同传入口本经改良后便
成为纳豆，至今已有千余年的历史!7]。

口本的纳豆大致分为细菌型和霉菌型2种，市面上
出售的多为细菌型。

1.2纳豆营养价值与保健功效
1.2.1纳豆的营养价值
纳豆中富含大豆贰元糖贰、大豆皂贰、染料
木素糖贰、大豆贰元、异黄酮和染料木
素贰元网及100多种酶。

这些具有一定生物活性的物质，就是纳豆保健功能的物质基础。

纳豆含有丰富的营养物质，其中包括纤维素、微量元素、多种氨基酸、各种酶类化合物、
纳豆芽抱杆菌及其特有的纳豆激酶(Nattokinase，简称NK) }'0}o
纳豆的氨基酸含量见表1-1 }"}。

纳豆与其他一些常见的食物的营养成分见表1-2}"-} o 表1-1纳豆中所含氛基酸的种类和含量(g/100g) }"}
Tab.l一 1 Amino acid content of natto(g/100g) }"}
氨基酸名称
目一氨酸
丙氨酸
撷氨酸
异亮氨酸
亮氨酸
天门冬氨酸
谷氨酸
乙氨酸
精氨酸
组氨酸
苯丙氨酸
酪氨酸
脯氨酸
色氨酸
蛋氨酸
肤氨酸
丝氨酸
苏氨酸
全氨基酸
游离氨基酸
游离率(%)
0.60
0.06
10.0
0.80
0.20
0.10
25.0
10.0
0.12
n曰n曰
n曰n曰
1.60
2.00
0.28
12.0
18.0
0.04
2.00
3.40
11.0
OCn曰月呀n曰OC 1 11
1.20
0.90
0.36
0.10
0.09
OCn曰
n曰1
0.60
1.00
0.50
0.03
6.50
，乙n曰
21
1.50
0.20
0.07
4.50
0.04
0.20
0.20
0.02
0.01
5.00
1.20
0.80
0.04
0.22
4.00
26.0
表1-2纳豆及其它常见食品的营养成分的比较[[12]
Tab.l-2 Comparison the nurtrients of natto and common food[“]
营养成分
热量/Kcal
水分//g
蛋白质//g
月旨肪//g
糖分//g
纤维素//g
灰分//g
钙//mg
铁/mg
纳豆
蒸煮大豆鸡蛋
16
10
63.5 16.0 71.8 21.2 9.00
60
30
12
11
9.80 0.90 2.30 7.60 2.10 0.00
1_10 0.00 90.0 70.0 4.00 55.0 3.30 2.00 2.20
维生素维生素维生素0.07
0.22
1.80
0.08
0.56
1_10
0.09
0.50
0.09
0.21
4.90
0.40
0.10
1.2.2纳豆的保健功效
1.2.2.1溶解血栓
口本学者须见洋行发现纳豆中含有一种特殊的酶类物质，具有很强的溶栓作用，为
其定名为纳豆激酶。

其相对分子质量在27000左右，由275个氨基酸残基组成，经实验
证明NK没有任何毒副作用。

随后的研究将NK应用动物体和人体中，发现它不仅可以
直接溶解血栓，而且还可以通过产生纤溶酶原激活剂间接溶解血栓!13]
研究显示，平均SOg纳豆中含有80万单位尿激酶，对于有心肌梗死危险的患者，一
次需投入尿激酶30万单位，相当于18}19g纳豆，因此少量纳豆的食用在一定程度上可
以代替尿激酶起到预防作用。

由于纳豆激酶进入人体内溶栓的速率在2}8h内比较高，
而血栓类疾病发作的高危时间为上午，所以建议当口晚饭时间食用，这样对于次口上午
心肌梗死的发作可以起到一定的预防作用!14] 纳豆激酶作为一种新兴溶血栓药物具有以下优点:纳豆芽抱杆菌在固体和液体环境
下均可进行发酵生产，因此纳豆激酶的生产造价低廉，具有更强的普适性;纳豆激酶属
于食源性激酶，在体内半衰期长，无任何毒副作
用;纳豆激酶不仅可直接作用于纤维蛋
白，也可间接的通过促进静脉内皮细胞产生纤溶酶原激活剂，其溶栓作用迅速;纳豆激
酶分子量比其它溶栓激酶小，易于被人体顺利吸收;NK口服进入人体后可以被肠道吸
收，是目前唯一可以口服的溶栓药物。

同其他传统溶血栓药物相比具有更广阔的发展空
间!‘，一，8}。

1.2.2.2抗癌
黄豆本身就含有丰富的黄酮、酚类化合物、硒元素等物质，这些物质有良好的防癌
效果;纳豆发酵后会产生染料木普和染料木素(抗癌活性成分);此外，纳豆中还含有胰
蛋白酶抑制剂，相关的动物实验已经证实了其具有一定的抗癌功效!}9-}0
1.2.2.3促进消化、调节肠道
纳豆发酵过程中的代谢产物含有丰富的淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等，这些酶可
以帮助人体加速消化分解食物，有助于肠道吸收。

大豆营养元素中糖类占到28%，木质素、纤维素和半纤维素等膳食纤维占到了糖类
的2/3，大量膳食纤维的摄入对于便秘有明显的改善效果。

纳豆中含有丰富的纳豆芽抱杆
菌，大量的纳豆芽抱杆菌进入肠道后，可以在肠内存活数十天，并且菌体会分泌一些酶
和维生素，起到抑制腐败菌的生长，促进了益生菌的繁殖的作用，对于调节肠道菌群平
衡有很大的作用四。

1.2.2.4降低胆固醇和血压
纳豆中含有丰富的亚油酸，其含量大约占到纳豆全脂质的50%，有关报道表明亚油
酸具有一定降低胆固醇的生理作用，对于与高血压、动脉硬化、和心脏病的预防有很好
的功效!23]
1977年帝国女子大学营养学教授林右市组织研究小组，通过给遗传性高血压的小白
鼠饲喂纳豆和蒸煮大豆，对比其血压变化，观察结果显示小白鼠在食用蒸煮大豆后，4
个月内血压的波动最高值为0.033Mpa;将纳豆参入饲料后，出现血压降低现象，4个月
内波动最高值为0.027MPa。

通过进一步的研究得知，纳豆以及包裹纳豆的勃性物质中都
含有丰富的血管紧张肤转化酶抑制剂(ACE inhibitor尹'}5} o
1.2.2.5防治糖尿病
纳豆中含有氨基酸诱导体的有效成份能使小肠中的a一葡萄糖普酶的活力下降，从而
使体外摄入的的蔗糖与淀粉转化成的单糖量减少，而人体的小肠只能吸收单糖，因此随
着吸收的糖量减少，就起到了防治糖尿病的作用阴。

1.2.2.6抗菌、抗氧化
纳豆在发酵的过程中会产生一些抗菌素，如2,6-毗陡二梭酸、杆菌肤等，这些物质
对酵母菌、大肠杆菌、霉菌、沙门氏菌和伤寒菌等较好的拮抗和抑制作用四。

纳豆中所含的卵磷脂、超氧化物歧化酶、维生素E等，这些抗氧化类物质可以清除
自由基，延缓人体衰老。

1.2.2.7促凝血、防治骨质疏松
纳豆中所含的维生素K:可以参与帮助血凝的蛋白质的合成。

由于纳豆的摄入可以使
抗凝血治疗中服用华法令的患者的凝血酶时间值恢复正常(一般服用华法令后凝血酶时
间值会异常)，因此人们推测纳豆中含有的维生素K:能与华法令产生拮抗作用。

大豆经纳豆芽抱杆菌发酵后外层的勃性物
质含有丰富的维生素Ka，这种维生素可以
溶于水。

目前发现的唯一一种可以产生维生素K:的细菌就是纳豆芽抱杆菌。

这些勃性物
质的主要成分是y-PGA，它可在维生素K:的参与下与Ca离子进行藕合，从而可以提高
人体对钙的吸收。

口本相关机构于二十世纪末，选取了上千名平均年龄达到60岁并伴随
有骨质疏松症状的志愿者进行了调研，研究发现:维生素K:的服用，除了起到减缓腰
痛的症状，还可以增加骨骼重量08}。

据相关报道，每天服用lOg纳豆就可以提供人体所
需的维生素KZ o
1.3纳豆芽抱杆菌的研究进展
1.3.1纳豆芽抱杆菌的起源和种类
从纳豆中分离得到一种名为纳豆菌的微生物，随后对其进行菌种鉴定发现它属于芽
抱杆菌属，因此命名为纳豆枯草芽抱杆菌，简称纳豆芽抱杆菌，它具有枯草杆菌的形态
特征，是好氧的革兰氏阳性菌四。

世界上第一位在纳豆的研究中发现并命名纳豆杆菌的学者是Sawamura } 1905年尺
村发现纳豆上所繁殖拉丝的枯草杆菌有其特性，提出单独作为一“种”，命名为纳豆芽抱
杆菌伊aciiiu nattosawamura)}30}。

而纯种纳豆菌伊aciiiu natto No.l)的分离纯化是由口本学
者半询教授在1934年首次完成，并将其引入到纳豆的大型工业化生产中。

现已知并常用
与纳豆生产的纯菌种!31]的种类有:Baciiiu natto Sawamura 06, Baciiiu natto Sawamura IFO
3339、Baciiiu subtiis IFO 3007等。

1.3.2纳豆芽抱杆菌的相关鉴定方法
1.3.
2.1微生物鉴定法
首先对其菌落的大小、形态、表面、边缘、凸凹度、透明度等进行鉴定;其次对其
进行革兰氏染色后，利用透射电镜和扫描电镜来观察单个细菌的形态以及大小;最后根
据《常见细菌系统鉴定手册》X30和第八版《伯杰细菌鉴定手册》[33]对菌株进行11项生理
生化鉴定实验，其中包括接触7}}0氯化钠生长实验、酶实验、VP实验、厌氧实验、淀
粉水解实验、明胶水解实验、石蕊牛奶实验、硝酸盐还原实验、酪氨酸水解实验、丙酸
盐和柠檬酸盐利用实验等，最后还要进行纳豆发酵实验[34]。

这种检测方法虽然实验操作
繁琐，但是对实验环境要求不高，准确度也相对较高，因此被广为采纳。

1.3.
2.2基因鉴定法
将待检菌种的16S rRNA序列递交GenBank 通过Blast进行同源序列检索，根据同
源性比例，来确定待测菌种是否为纳豆芽抱杆菌[X30。

近年分子生物学的发展口新月异，
这种利用16SrRNA全部核普酸序列来确定生物分类地位的方法已经在很多领域被广泛
使用，这种方法不仅可以从分子的角度来描述不同菌株种内之间存在的差异，而且与微
生物鉴定方法相比更为快速便捷。

尤其是在细菌的在系统分类学研究中是目前最为有用
也是最为常用的方法，这种方法在新种的确定工作中具有重要的作用因。

1.4纳豆激酶的相关研究进展
1.4.1纳豆激酶的发现与定义
最初这种丝氨酸蛋白酶是由口本的Sumi H 等人于1987年首次发现并为其定名为
“纳豆激酶; }}3}。

它是一种可以分泌到细胞外的酶类物质，具有高效溶栓能力的蛋白酶。

其高纤溶活性可用于预防和治疗各种血栓类疾
病。

1.4.2纳豆激酶的生化特性
利用不同方法进行测定，所得到的NK分子量范围在2730035000。

随后的研究中
根据基因测序后得出NK是一条单链多肤，其分子量为27728，这条多肤是由275个氨
基酸残基组成的!37]。

用Svunsson柱型电泳法测定纳豆激酶的等电点，得到它的等电点(PI) 为8.6士0.3。

与其有同源性的酶类物质包括枯草杆菌蛋白酶A、枯草杆菌蛋白酶E，其同
源比例分别为99.3%, 99.5% }'S}o Asp-32, His-64, Ser-221是纳豆芽抱杆菌的活性部位Ser-125, Leu-126, Gly-127是纳豆芽抱杆菌与底物结合的部位[38]，研究发现纳豆激酶最
敏感的底物是Suc-Ala-Aeu-Pro-PNA，其次为H-D-Val-Leu-娜s-PNA该酶对底物5-223 8 , 5-2302也有一定活性。

NK的活性在45 0C以下的环境中相对而言比较稳定，将其置于60 0C 以上的的环境中，其活性会随着温度升高逐渐丧失;即使对NK反复冻融5次，它的酶
活仍然很高，基本维持在95%左右。

室温下，在pH7}9范围内酶活性最为稳定，pH7} 12
范围内较为稳定，但低于pH5开始不稳定。

实验发现加入Smmol/L Cys对NK的活性没
有影响，而加入Smmol几、1 mmol几的Neguvon 和DFP该酶的活性则完全被抑制住，因
此推测它是一种丝氨酸蛋白酶[13]
1.4.3纳豆激酶的溶栓机理
纳豆激酶的溶栓机理见图1-1。

纳豆激酶主要通过四种途径发挥其溶栓效用[39]。

途径
a是首先刺激血管内皮细胞使其分泌组织型纤溶酶原激活剂任PA)，刺激酶原产生纤溶酶
来溶解纤维蛋白;途径b中含有一种抑制尿激酶和t-PA的物质PAI-1，令这种物质彻底
失活或直接降解掉这种物质，t-PA和尿激酶被激活的数量就更多了，从而加速血栓的溶
解;途径c是将体内的尿激酶原激活为尿激酶，尿激酶与t-PA一同激活纤溶酶原，溶解
血栓。

以上三种途径均是通过间接的方法刺激产生溶栓物质来降解血栓。

途径d则是利
用纳豆激酶本身的溶栓作用来降解血栓，纳豆激酶本身就是一种具有直接水解交联纤维
蛋白作用的丝氨酸蛋白酶，其水解活性与t-PA 基本持平。

由于该酶对纤维蛋白原不敏感，
因此发挥溶纤作用时不水解纤维蛋白原，就不易引起出血了。

纳豆激酶正是通过这种直接
和间接结合的溶栓机理，才使得它具有如此显著的溶栓功效。

纳t "'.激f4}k CNK)
血竹内皮细胞
尿激f4}t原
尿激随
纤溶f'4(t原
纤溶f4}t
纤维蛋自
纤iii-蛋自}'"3解产物
图1-1纳豆激酶的溶栓机理[f 40]
Fig.l一 1 Thrombolysis mechanism of nattokinasef4o} 1.4.4纳豆激酶酶活的测定方法
如今关于NK活力测定的方法包括以下8种，这些对于NK活力的测定方法都存在
着各自的优缺点，目前被广泛使用的是平板法和纤维蛋白块溶解时间法!“州。

1.4.4.1四肤底物法
四肤底物法是通过改进枯草杆菌蛋白E酶活的测定方法得到的!43]。

将NK加入到
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA的溶液中，放置于恒温水浴环境中，控制时间为1 min温度为
370C，从水浴中取出后在410nm处用紫外分光光度计测定，单位时间内OD值的变化。

虽然这种方法可以迅速测定酶的活性并且操作简单，但这种方法测定的蛋白酶活性并不
能完全等同于其纤溶活性洲。

1.4.4.2琼脂糖一纤维蛋白平板法
琼脂糖一纤维蛋白平板法是目前测定纤溶酶溶栓活力最为常用的方法[f4o，此法的原
理是利用琼脂糖作为固体支持，将尿激酶和NK 点样在由纤维蛋白和凝血酶制成的人工
血栓平板上，置于370C的环境下孵育18h。

测量酶在平板上生成的溶圈直径，通过标准样
与待测样的溶圈直径的比较可以推算出待测样的活性值叫。

此法简便易行，相较于其他
方法一次可批量测定多个样品。

但通过对比粗制酶的活性测定和纯度较高的酶活性的测
定发现恒温时间对于粗制酶的活性测定影响比较大，而且恒温反应时间对于溶解圈面积
的影响也很大，所以在利用这种方法测酶活力时，对恒温时间的控制需要十分精确[47]
1.4.4.3血清板法
1996年口本原敏夫等人[48]介绍了由纤维蛋白平板法改进的血清板法。

将标准NK酶
液配制成不同浓度，分别加入到微型纤维平板的孔内;之后每隔30min测定一次OD655 ;
血栓纤维在655nm处有最大吸光度值，随着纳豆激酶的加入纤维蛋白逐渐被降解，而且
吸光度的减少同纳豆激酶的浓度具有一定线性关系，利用这种线性关系可以计算出酶活
力。

这种方法不但可以同时测多个样品而且成本低、快捷、简便。

1.4.4.4 Flion-酚法
酪蛋白经过蛋白酶的水解后会产生一些含有酚基的氨基酸(如色氨酸、酪氨酸等)，
这些含有酚基的氨基酸与Flion-酚试剂(磷铝酸与磷钨酸的混合物)在碱性条件的作用
下，会产生一种蓝色的化合物(钨蓝和铝蓝的混合物)，实验中测定这种蓝色物质在680nm
处的吸光度。

然后根据蓝色深浅度与酚类化合物的含量成正相关，可以推算出活力的大
小四。

此法的优点是步骤简单易于操作，成本低廉，同时可测多个样品，此法的缺点是
对于控制酶解时间要求十分严格，而且测定得值不能完全等同于纤溶酶活力。

1.4.4.5聚丙烯酞胺纤维蛋白平板法
聚丙烯酞胺纤维蛋白平板法遵循琼脂纤维蛋白平板法的原理并对其进行了一定的改
进，以聚丙烯酞胺作为载体利用平板电泳制胶模具来制平板，这种制板的方法可以很好
控制平板厚度以及薄层的均匀度，实验中通过蛋白染色法对纤维蛋白溶解情况进行指示
}soo。

这种方法突出的优点就是灵敏度高、可进行定量分析，这种方法主要用于相对纤溶
酶活性的测定、溶栓药物的初筛、纤溶酶活性成分的跟踪检测等。

1.4.4.6纤维蛋白块溶解时间法
此法通过对尿激酶和纤溶酶的国家标准的测定方法进行一定改进得来的。

纤维蛋白
溶解时间的测定方法具体步骤如下:在0 0C下的环境中，将NK溶液等一系列试剂按顺
序依次加入试管中，经过一段时间的剧烈的振荡后将其放置于恒温水浴中，控制温度在
370C。

反应过程中一旦出现纤维蛋白便开始进行计时，等到不再有气泡冒出时停止计时，
这段时间纤维蛋白溶解时间。

此法反应迅速，但不适用于多个样品的同时测定，这种方
法分辨率虽然高但是灵敏度不高，比较适用于粗酶的活性测定[47]
1.4.4.7试管法
试管法相对于其他酶活测定方法更为快捷。

测定方法如下:将pH为7.7的咪哩缓冲
液和NK收集液、凝血酶、纤维蛋白原分别依次加入直径为1 Smm的硅化试管中迅速的
振荡数秒的时间，待其产生絮状物放置380C'恒温水浴，3 Omin后放进冰水中终止其反应。

将试管中没有溶解的纤维蛋白用100目尼龙网过滤出来，用蒸馏水反复漂洗，并用滤纸
吸干，将纤维蛋白放入试管中，加入浓度为0.2 mol/L的NaOH溶液3mL，置于沸水中
1 Smin后迅速冷却。

随后用分光光度计测定其在280nm处的吸光值，利用下面的纤溶活
力计算公式，可以计算出纤溶酶活力!，‘}。

纤溶酶活力=
Azso(对照)x Azso(样品)
O. SmL x 30 min
x 3 x 1000}g
(1一1}
式中:
AZgo— 280nm处吸光度。

1.4.4.8酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附法的提出来自于口本Yushikazu Y等学者!5z]于1994年的报道，其中介
绍了针对测定纳豆激酶酶活的专用方法。

首先利用微孔板为载体，令NK的单克隆抗体
吸附于其上，对没有吸附的空缺部位进行充分的冲洗和封堵，之后加入NK等待2h后再
加入连有过氧化氢酶的多克隆抗体。

最后将底物溶液加入其中，等待大约l Omin后加入
1 mol/LHZS 04溶液，然后利用分光光度计测定。