方法--流式细胞术检测细胞
流式细胞术
流式细胞术流式细胞术是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。
这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。
流式细胞术（Flow CytoMetry，FCM）是对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。
基本信息中文名称:流式细胞术外文名称:Flow Cytometry, FCM优点:速度快、精度高、准确性好等作用快速测定细胞或细胞器生物学性质特点:1.测量速度快；2.可进行多参数测量最高速度:每秒钟3万个细胞4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
工作原理将待测细胞染色后制成单细胞悬液。
用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。
光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。
单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。
一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。
流式细胞术测定细胞周期
流式细胞术测定细胞周期一、实验原理碘化丙锭（PI）可以与细胞内DNA和RNA结合,采用RNA抑制剂将RNA 消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA 含量的多少。
由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。
因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期,S期和G2/M 期,并可通过Multicycle软件计算各时相的百分率。
值得注意的是, PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞) ,在标本制备时,必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性,才能使PI进入细胞内与细胞内的核酸结合。
乙醇通常为终浓度为70%的冷乙醇。
二、实验准备1、试剂胰酶、PBS、纯乙醇（4℃）、RNase A、Triton X-1002、主要器材300目尼龙过滤网三、实验步骤1、每个样品细胞数不得少于100万。
2、胰酶消化，收集细胞（贴壁细胞）或1000rpm离心5分钟直接收集细胞（悬浮细胞）。
3、4℃ PBS洗一次，将细胞重悬于0.3ml 4℃ PBS，加入0.7ml 4℃的纯乙醇，将枪头伸入液面下，轻轻打入乙醇，轻柔混匀两次，4℃固定过夜。
4、1000rpm离心5分钟，去上清，加入染色缓冲液PI染色缓冲液：50 μg/ml PI0.1 mg/ml RNase A0.05% Triton X-100总体积1ml/样品，37℃孵育40分钟。
5、1000rpm 离心5分钟，小心去除上清，加入1ml PBS，轻柔混匀，300目过滤，上机检测。
检测细胞凋亡的三种流式方法
检测细胞凋亡的三种流式方法细胞凋亡（apoptosis）是细胞自主性死亡的过程，是正常细胞发育和组织调控的重要途径。
为了研究细胞凋亡的机制和调控，科学家们发展出了许多方法来检测和定量细胞凋亡的发生。
其中流式细胞术（flow cytometry）是最常用的方法之一，根据不同的细胞特征和所需信息，可以有多种方法用于检测细胞凋亡。
下面将介绍三种常用的流式细胞术方法。
1. 荧光标记的Annexin V/PI双染法：Annexin V是一种细胞外结合蛋白，具有高度特异性结合细胞凋亡的特点。
当细胞凋亡发生时，磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞内翻转至细胞外，而Annexin V能够结合在PS上。
Propidium Iodide（PI）能够穿过损伤的细胞膜，结合到细胞核内的DNA分子上。
通过将Annexin V标记为绿色荧光染料，将PI标记为红色荧光染料，通过流式细胞术定量测量荧光信号的强度，可以区分出未凋亡细胞（Annexin V和PI双阴性），早期凋亡细胞（Annexin V阳性，PI阴性），晚期凋亡和坏死细胞（Annexin V和PI双阳性）等不同状态的细胞。
2.荧光标记的DNA碎片染色法：3. 荧光标记的Caspase活性检测法：Caspases是细胞凋亡过程中的关键酶，它们在给定的信号下被激活并参与调节细胞凋亡的执行阶段。
通过使用荧光标记的Caspase底物，如FLICA系列（Fluorochrome Inhibitor of Caspases）、CaspGLOW系列（Caspase-Glo Kits），可以测量细胞中Caspase的活性。
这些底物在被Caspase酶剪切后会释放出荧光信号，通过流式细胞技术可以测量荧光信号的强度。
由于Caspase活性与细胞凋亡过程密切相关，因此可以利用这些荧光标记底物来定量测量细胞凋亡的发生。
总结起来，流式细胞术是一种非常有效的方法用于检测细胞凋亡的发生。
Annexin V/PI双染法可以定量测量不同状态的细胞，DNA碎片染色法可以测量细胞凋亡的程度，荧光标记的Caspase活性检测法可以测量细胞中Caspase的活性。
《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程
流式检测细胞凋亡Annexin V 检测细胞凋亡 (2)实验原理 (2)实验用品 (2)操作步骤 (3)Annexin V Blocking (5)凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7)实验原理 (7)实验用品 (8)操作步骤 (9)BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12)实验原理 (12)BrdU Flow Kits 试剂盒 (12)结果分析 (17)流式仪器设置指南 (18)线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22)实验原理 (22)实验用品 (22)样本制备 (23)结果分析 (24)注意事项 (24)Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26)实验原理 (26)实验步骤 (27)结果分析 (28)Annexin V 检测细胞凋亡实验原理Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。
它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。
在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。
Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。
由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。
因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。
实验用品1. 一次性12×75mm Falcon试管。
2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C保存。
33. 微量加样器和加样头。
4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。
流式细胞术实验方法
流式细胞术实验方法PI 染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。
4、离心，弃上清液。
5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。
7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。
9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。
GFP PI染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。
以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9）细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。
3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。
用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。
4、离心弃上清液。
5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。
6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。
细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。
离心，弃上清。
4、 BS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。
流式细胞术检测原理
流式细胞术检测原理
流式细胞术（Flow cytometry）是一种基于细胞染色技术和流体动力学原理的分析仪器，主要用于分离、分析和检测细胞、微生物等样品中的细胞数量、大小、形态和生理状态等多项指标。
其检测原理是将样品中的细胞单独定位在精密的光学系统中，使用非常短的激光脉冲从而观察分析细胞。
在流式细胞术中，样品先进行预处理，以使细胞单独存在、不会聚集在一起或堵塞孔口。
细胞溶液被引入流式细胞术仪器的液体流管中，快速流动，并在途中被一个激光束所照射。
激光光束穿过流动的细胞，使得其中的染料激发并发出荧光，荧光信号被称为荧光强度。
检测系统会收集荧光信号，并将其转换为电信号，接着将诸如细胞大小、荧光强度和复杂度等信息转换为数字数据。
最终，所有这些数据都被存储在计算机中，可与之前的数据进行比较分析，从而获得关于细胞的详细数据信息。
流式细胞术检测原理能够检测出许多细胞特征，可以广泛用于细胞生物学、免疫学、癌症学等领域。
在医学、疾病诊断和治疗上有着广泛的应用价值。
细胞凋亡流式细胞术检测
该法简单、快速，但不适于常规多功能流式细胞仪 (不具备紫外光源)的检测。 主要有Caspases-3流式细胞检测试剂盒，Caspases-
2/ Caspases-4/Caspases-6/Caspases-7/Caspases-9等抗
体
2.6 DNA 碎片分析：Apo-BrdU
核酸内切酶活化使核小体内DNA断裂为50~300kb片段，裂解为200bp
通透性和对称性均会改变。
解决方法： 形态学特征是区分凋亡和坏死的“金标准”。
3.3 样本制备过程中凋亡细胞的选择性丢失：
贴壁培养细胞的分离
凋亡早期，细胞即脱离培养瓶表面并悬浮在培养液中。因此去除培养液， 然后加胰酶或EDTA消化的方法不可避免的会失去很多凋亡细胞。 ---将培养液和消化下来的细胞合在一起 胰酶消化本身就倾向于破坏细胞膜已破损的晚期凋亡和坏死细胞，导致 丢失。
2 细胞凋亡的流式检测方法
利用流式仪测定细胞光散射可对凋亡细胞进行分析 凋亡早期细胞因体积减小，胞浆及染色质固缩，FSC变 小，SSC增大 凋亡晚期细胞FSC、SSC均变小 坏死细胞则因细胞膜通透性改变，细胞肿胀， FSC 、 SSC 变大，胞膜破裂，胞内含物释出后 FSC 、 SSC 均变 小。
此法简单、可靠，由于凋亡时 细胞膜的改变大大早于DNA 的 改变，因此Annexin V/PI(或7-
AAD )双染色是检测早期凋亡
细胞的敏感方法。 由于该法必须用活细胞，因此 检测时间受到限制，且对凋亡 晚期细胞和坏死细胞无法准确 区分。
2.3 细胞内钙离子测定
Fluo-3-Am为新型的高度特异性Ca2+荧光指示剂，进入细胞后
2.1 PI单染检测
与细胞周期相同，利用PI染色，通过检测DNA含量来 同时判定细胞周期和凋亡。 凋亡过程中，细胞内核酸酶释放，细胞DNA发生有序
流式细胞术
临床型（台式机）
BD LSR
FACS Vantage DiVa
特点：
多数字化
适用用各类细胞分选
4路分选
科研型（大型机）
FACSAria
特点： 分辨率高 选配多种波长和 类型激光器 可把感兴趣细胞 分选到特定培养孔 或板上（4路和24 孔板） 适用于高速分选 和多色分析
第 二 部 分 流式细胞术在不同领域的应用
细 胞 周 期 分 析
• 在细胞周期内,DNA含量随细胞内时相发生周期性
• • •
• •
•
变化。 正常情况下,大多数细胞处于休止期(Go), G1期细胞虽有DNA合成，但DNA含量仍为2N， 为二倍体细胞,; 处于活跃的DNA合成期(S期)的细胞DNA• 含量为 2N-4N; 正经历细胞分裂(G2/M期)的细胞含有最大量的 DNA(4N)。 细胞经固定后用• PI (碘化丙啶) 等荧光染料染色 即可上机测定。 但标本需先经RNA酶处理以排除RNA干扰。
488 nm laser
FALS Sensor Fluorescence detector
Charged Plates
-
+
Single cells sorted into test tubes
信号检测--散色光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射 光，可以把不同类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射)光它 反应细胞的相对大小 和截面积的大小 SSC (90度角散射光) 代表细胞的颗粒度和 精细结构的变化
2.光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散
射特性。 在流式细胞仪上，前散射光（ FSC ）与细胞的大小 有关， 侧散射光（SSC）反映的是光在细胞内的折射作用， 与细胞内的颗粒多少有关。 在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降 低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。 此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内 颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。
流式细胞检测方法
Annexin Ⅴ-FITC 细胞凋亡试剂盒使用（细菌）K：不加菲A：5000ug/L菲B: 500ug/L C: 500ug/L1、在0,24,48,72h取样3ml，测定OD6002、在0,24,48,72h取样，三个平行各取1ml,混匀，6000r/min,离心20分钟，弃上清，收集细胞，用5mlPBS轻轻重悬（注意：PBS重悬不能省略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC的结合。
）3、实验组（4组）：取K、A、B、C组重悬的细胞，加入5mg/ml的溶菌酶2ml,35℃水浴30Min,6000r/min,离心10分钟，弃上清。
4、实验组：各取K、A、B、C组0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。
加入10μl Annexin V-FITC，轻轻混匀；再加入100μl碘化丙啶，轻轻混匀。
室温(20～25℃)避光孵育10分钟。
5、阳性对照组：取2份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。
1管放入沸腾的蒸馏水中煮30min（杀死细胞）,然后加入100μl 碘化丙啶（PI）单染，轻轻混匀，另1管加入10ul Annexin V-FITC单染，轻轻混匀。
室温(20～25℃)避光孵育10分钟。
6、阴性对照组：另取1份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml，混匀，不加任何染色剂。
7、将样品过400目筛网，进行流式细胞仪检测。
8、Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。
9、因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。
10、用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm。
Annexin V-FITC 的绿色荧光通过FITC 通道（FL1）检测；PI 红色荧光通过PI 通道（FL2 或FL3）检测，建议使用FL3。
流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是从70年代逐渐兴起的一种利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞等生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。
它是集现代物理电子技术、激光技术、光电测量技术、计算机技术、流体力学以及细胞荧光技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技分析检测技术，具有检测速度快、通量高、灵敏度高、采集数据量大、节约样本及成本等优点，已被广泛应用于从基础研究到临床实践的各个方面，涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中都发挥着重要的作用。
一、流式细胞术的基本原理待测样品（如细胞、染色体、微生物或人工合成微球等）经荧光染料染色后制成样品悬液，在一定压力下通过鞘液包围的进样管而进入流动室，排成单列的细胞，依次通过流动室检测区域。
以不同波长的激光作为激发光源，垂直照射检测区域的样品流，被荧光染色的生物颗粒在其照射下，产生散射光和激发荧光，它们同时被前向光电二极管和侧向90°方向的光电倍增管接收。
前向小角度的光散射信号（forward scatter, FSC）反映了细胞体积的大小；侧向90°方向的光散射信号（side scatter, SSC）反映了细胞内颗粒的复杂情况；激发荧光信号代表了所标记的被测细胞内部颗粒的信息。
这些光信号被转化成电信号，传送到计算机，经A/D 转换器传输到微机处理器形成数据文件，保存到计算机上，以备脱机后的数据处理和分析。
细胞的分选则是指根据所测定的各个参数将指定的细胞亚群从细胞主群体中分离出来的一种方式。
具体的操作是在流动室的喷口上方配有一个超高频的压电晶体，产生的振动能使喷出的液流形成均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。
将这些液滴充以正负不同的电荷，让其在高压电场的作用下发生偏转，落入各自的收集容器中，而不予充电的液滴则落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。
流式细胞术
流式细胞术科技名词定义中文名称：流式细胞术英文名称：flow cytometry assay;flow cytometry;FCM其他名称：荧光激活细胞分选法(fluorescence-activated cell sorting,FACS)定义1：一种细胞分选或分析技术。
即以荧光素标记抗体结合相应细胞，用激光束激发单行流动的细胞，根据细胞所携带荧光(强度或类别)进行分选或分析。
测和诊断（三级学科）定义2：一种对悬液中细胞、微生物或细胞器等进行单个快速识别、分析和分离的技术。
用以分析细胞大小、细胞周期、DNA含量、细胞表面分子以及进行细胞分选等。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）定义3：用荧光剂对细胞特定成分染色，利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，并能对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
简介一种在液流系统中，快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。
其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。
根据这些参数将不同性质的细胞分开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。
目前最高分选速度已达到每秒钟3万个细胞。
特点1.测量速度快；2.可进行多参数测量；3.是一门综合性的高科技方法（FCM 综合了光学，电子学，流体力学，细胞化学，免疫学，激光和计算机等多门学科和技术）；4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
流式细胞方法测定
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
血液流式细胞术检测细胞因子方法
血液流式细胞术检测细胞因子方法
血液流式细胞术是一种用于分析和鉴定血液中不同类型细胞的高效技术。
在医学领域，它被广泛应用于研究和临床诊断中。
近年来，血液流式细胞术也被用于检测和分析细胞因子，这对于研究免疫反应、炎症和其他疾病过程具有重要意义。
细胞因子是一类分泌性蛋白质，它们在细胞间传递信号，调节免疫反应、细胞增殖和分化等生物学过程。
通过血液流式细胞术检测细胞因子，可以帮助科研人员和临床医生更好地理解细胞因子在疾病发生发展中的作用，为疾病的诊断和治疗提供重要信息。
血液流式细胞术检测细胞因子的方法主要包括以下几个步骤，首先，通过特定的抗体对血液样本中的细胞进行标记，这些抗体可以与目标细胞因子结合。
然后，利用流式细胞仪对标记的细胞进行检测和分析，流式细胞仪可以测量细胞的大小、形状、表面标记物和内部成分，从而确定细胞中细胞因子的含量和分布。
最后，利用专业的数据分析软件对流式细胞仪获取的数据进行处理和解读，得出细胞因子的定量和定性结果。
血液流式细胞术检测细胞因子方法具有高灵敏度、高通量和多
参数分析的优势，能够同时检测多种细胞因子，为疾病的研究和诊断提供全面的信息。
随着技术的不断发展和完善，血液流式细胞术检测细胞因子的应用范围将会更加广泛，为医学研究和临床诊断带来新的突破和进展。
流式细胞仪检测细胞增殖方法有哪些
流式细胞仪检测细胞增殖方法有哪些？在生物学和医学研究中，细胞增殖是一个关键过程，对于理解生命活动的基本规律以及疾病的发病机理具有重要意义。
随着科技的发展，流式细胞仪作为一种高效、灵敏的分析工具，广泛应用于细胞增殖的检测。
流式细胞仪通过快速分析单个细胞，可以对细胞周期、细胞增殖活性、细胞凋亡等多个方面进行研究。
本文将探讨流式细胞仪在检测细胞增殖方面的主要方法，包括但不限于溴脱氧尿苷（BrdU）掺入法、细胞周期蛋白检测法以及细胞大小分析法等，为读者提供全面的技术应用概览。
流式细胞仪检测细胞增殖方法：1、3H（氚离子）掺入法原理：是在细胞DNA合成时，用3H脱氧胸腺嘧啶核苷代替普通的脱氧胸腺嘧啶核苷掺入新合成的DNA中，增殖的细胞因为掺入3H而具有放射性，通过定量检测样品细胞的放射性大小而反映细胞的增值活性缺点：1）使用的是具有放射性的同位素，操作较为复杂，同时需要采取放射性保护措施2）低比例高活跃增殖和高比例低活跃增殖可能得到的是相同的结果，用此方法无法进行鉴别3）此方法无法进一步得到具有活性的增值细胞用于下一步的研究4）此方法时间较短，无法检测加入前细胞的增殖情况，而且检测到放射性只能说明细胞DNA合成，而不能提供合成DNA的细胞是否进入增殖阶段的信息2、相对计数法原理：将对照组和各实验组控制在相同条件下直接计数然后比较计数结果得到增殖结论注意点：对照组与实验组每种细胞所加浓度必须相同，每组至少设置3个复孔，这样每个孔可以得到1个细胞数，将3个复孔取平均值后就是这个组的结果。
如果同时需要得到每孔目标细胞增殖后的绝对参数，在每孔细胞中加入1*105PE标记的人工微球作为内参收集各组的细胞于EP管中，注意必须尽量将各组的所有细胞都收集起来。
标记需要计数细胞的标志表型的荧光素偶联抗体，4℃静置30minPBS洗涤一次，洗去游离的抗体3、示踪染料标记法示踪染料与细胞结合的方式：1）能够与细胞内的蛋白质上的氨基发生非特异性的共价结合2）能够非特异性地嵌入细胞膜的脂质双分子层中与细胞发生非共价性结合原理：示踪染料的荧光信号都很强，当细胞分裂时，母细胞内的染料会被平均分配到子细胞中，细胞荧光信号会被减弱一半，所以通过检测减弱的、发射示踪染料荧光信号的细胞比例就可以判断细胞增殖的强弱。
单个核细胞分离及流式细胞术检测方法
单个核细胞分离及流式细胞术检测方法
1.取外周血20mL，转移至250mL无菌生理盐水瓶中，加20mL生理盐水混匀，按照体积比3：1加入羟乙基淀粉，即加入13.5mL羟乙基淀粉，充分摇匀后，室温静置15min。
此时加上操作，一共需要耗时25min。
2.吸取上层清亮溶液至50mL无菌离心管，20℃，1800rpm，离心5min，弃上清，最后用10mL生理盐水重悬细胞。
此时加上操作，共耗时25min。
3.吸取提前预热至室温的Ficou人淋巴细胞分离液10mL于50mL离心管中，将细胞悬液沿管壁缓慢加入到分离液中，室温，2000rpm离心25min。
此时加上操作，共耗时35min。
4.小心吸取中间白膜层置于另一无菌15mL离心管，加生理盐水补足体积至
13mL，吹打混匀，室温，1800rpm离心5min，弃上清液，然后再重复该步骤1次。
此时加上操作，共耗时20min。
5.用500微升生理盐水重悬，稀释100倍进行细胞计数，吸取合适数量的细胞进行流式标记（共分为23个流式标记管，至少需1.15×107细胞），每管50微升孵育体积，每种抗体加入1.5微升，全部加完后用中枪混匀，放于4度冰箱孵育30min，并每10min弹匀一次。
此时加上操作，共耗时80min。
6.取出孵育完毕的抗体，用PBS清洗两次（2000rpm离心5min），最后用200微升PBS重悬。
此时加上操作，共耗时40min。
7.将样品拿至流式检测室过筛网，上机检测。
此时加上操作，共耗时45min。
8.关机及出流式报告，30min。
流式细胞术原理及应用
流式细胞仪电子系统
如何将光信号显示于电脑上进行显示分析？
➢ 将模拟信号转化为数字信号 ➢ 计算每个脉冲峰的高度、宽度和面积 ➢ 和计算机连接以传出数据
荧光信号
光电倍增管PMT 电信号 放大器
线性放大：输入与输出线性关系 如DNA、RNA、总蛋白
对数放大：输入与输出对数关系 如细胞膜表面抗原
流式分选系统
Annexin-V FITC单染管 样本
Annexin-V/PI检测细胞凋亡实验结果分析
圈定准确的细胞群
Q1（Annexin-VFITC- PI+）：裸核 Q2（Annexin-VFITC+ PI+）：晚期凋亡细胞或死细胞 Q3（Annexin-VFITC- PI-）：活细胞 Q4（Annexin-VFITC+ PI-）：早期凋亡细胞
• 激发的光谱必须在仪器滤光片能 接受的合适范围内
• 荧光素光谱的重叠应当尽量减少 • 染料的亮度与抗原表达量相匹配
即根据抗原表达强弱合理选择荧 光抗体：低表达用强荧光，强表 达可以用弱荧光 • 根据仪器型号选择抗体，不同的 仪器滤光片设置不同，对荧光素 相对检测灵敏度也不同
染色
Hale Waihona Puke 对照设置对照设置阴性对照：排除自发荧光 同型对照：排除非特异性荧光 补偿对照：调节补偿
同型对照抗体与实验所用的特异性抗体 a.相同种属来源 b.相同免疫球蛋白及亚型 c.相同荧光素标记 d.由未免疫动物血清纯化而来
例如一个双色染色的实验 使用的抗体为抗体CD3 FITC，抗体CD4 PE对应的同型对照是IgG1 FITC，IgG1 PE
细胞凋亡检测
1 （Annexin-v/PI、线粒体膜电位、Caspase-3、TUNEL） 2 细胞周期检测
流式细胞的测定方法
流式细胞的测定方法主要包括以下步骤：
1. 样品制备：样品需要充分混匀，以避免出现任何聚集或死区，尽可能在短时间内完成注射和检测。
2. 流动细胞室的选择：要确保流动细胞室清洁、无污染，否则可能会影响实验结果。
3. 激光源的选择：常用的激光源包括488nm、633nm和407nm等，不同波长的激光对不同特性的抗体或染色剂有选择性的激发。
4. 实验参数的设置：根据不同的实验需求，调整参数，如脉冲数、脉冲宽度、荧光强度等。
5. 实验过程：对样本进行检测，通过荧光仪检测散射光和荧光信号，借助计算机软件进行数据分析。
此外，还有细胞表面标志物测定、细胞周期和细胞凋亡的测定等方法，可以进一步对流式细胞术的应用进行扩展。
流式细胞术是一种在生物医学研究中广泛使用的技术，它能够快速、准确地分析大量细胞。
通过该技术，可以检测细胞群的多种参数，包括细胞表面标志物、细胞内部生理指标、细胞周期和凋亡率等。
同时，流式细胞术对样本的要求较低，能够快速获得大量数据，具有很高的灵敏度和精确度。
然而，流式细胞术也有其局限性，如对某些染色方法或特定细胞类型的适应能力有限，对实验环境和操作人员的要求较高。
因此，在进行流式细胞的测定时，需要根据具体实验需求和样本特性选择合适的方法和参数，以保证实验结果的准确性和可靠性。
流式细胞的方法分别检测CD4
流式细胞术分别检测CD4+T细胞以及CD8+T细胞CD70、CD40L、CD11a以及Perforin的蛋白表达量本实验采用直接标记的流式抗体，采用双色荧光标记标记PBMC，直接在PBMC中检测各种基因在CD4或者CD8中的表达，CD70、CD40L和CD11a为细胞膜蛋白，采用以下操作步骤：1）在第一部分实验中将外周静脉血分离出PBMC之后，取约1×106个PBMC细胞,调整细胞数至1×106／毫升；2）取100μl调整好浓度的细胞悬液至流式检测管中，每个样本均取8管；3）各检测样本按表2.1加入各标记抗体20μl，对照组按表2.2加入20μl标记抗体，混匀，并设阴性对照组，室温避光孵育20分钟；4）加入2ml PBS洗液重悬细胞，1000 rpm离心5分钟，弃上清；5）加入0.5 ml PBS洗液重悬细胞；6）流式上机检测。
表2.1流式各检测样品所加抗体编号 1 2 3 4 5 6所加抗体CD4-PECD11a-FITCCD4-PECD40L-FITCCD4-PECD70-FITCCD8-PECD11a-FITCCD8-PECD40L-FITCCD8-PECD70-FITC 表2.2流式照组所加抗体编号 1 2 3 4 5 阴性对照所加抗体CD4-PE CD8-PE CD70-FITC CD11a-FITC CD40L-FITC 不加穿孔素为细胞内蛋白，必须得破膜之后才能染色，采用以下步骤操作：1）在第一部分实验中将外周静脉血分离出PBMC之后，取约1×106个PBMC细胞,调整细胞数至1×106／毫升；2）取100μl调整好浓度的细胞悬液至流式检测管中，每个样本均取8管；3）各检测样本加入各表面标记抗体20μl（分别加入CD4-PE或者CD8-PE），混匀，并设阴性对照组，室温避光孵育20分钟；4）加入2ml PBS洗液重悬细胞，1000 rpm离心5分钟，弃上清；5）加0.5ml流式固定剂，室温暗处孵育15min，离心5分钟，弃上清；6）加1.5ml流式破膜剂，室温暗处孵育10min；7）1000 rpm离心5分钟，弃上清；9）加100μl流式破膜剂，室温暗处孵育30min；9）加入细胞内标记抗体20μl（perforin-FITC）10）加2到3ml PBS洗液, 1000 rpm离心5min,弃上清；11）加入500μl PBS洗液，流式上机检测。
免疫学检验-流式细胞术
同型对照，则测定结果的可靠性将受到影响。另外,样品标记、溶血、洗
涤、仪器质控和上机检测是流式细胞术的一个连续的过程，需进行全程
质控,将质控品和待测标本一起操作，所得结果如达标，则提示本次实验
结果可靠.
FCM的检测原理——
5.
获取实验数据前,应先调节仪器的光路补偿，
校正不同荧光探测之间的光谱重叠。分析实验数据时，要根据实验目的
不消除将使检测结果容易出现假阳性。
5. 其他 细胞浓度低、溶剂的性质等都会影响检测结果。
FCM的检测原理——
1.
流式细胞仪的核心元件是激光,激光的稳定性受到环境温度的影
响很大，一般要求环境温度在20~25℃之问。另外，实验室内尽量减少灰尘
和烟尘，室内光源和仪器光源都要有良好的屏蔽作用。
2.
每天上机前须用质控品校正仪器，确保仪器的状态良好才能
则被当作废液抽吸掉，完成细胞分选的目的。
FCM的检测原理——
1.
荧光染色时的环境温度对结果有一定的影响，高温
影响更加明显。因为温度升高时溶剂与荧光染料分子运动加快，使
荧光淬灭的可能性增大。一般 20°以下时，荧光分子发光产额变化
不大，基本保持恒定。
2.
荧光染料发光的最好条件是在溶剂中处于离子化状
态。每一种荧光染料分子发光产额最高时都有最适 pH，从而保持
荧光发光基团溶剂之间电离平衡。pH改变,则会造成荧光光谱改变
响荧光强度。
FCM的检测原理——
3.
在对插入性荧光染料进行固定时,有些固定剂与细
胞的某些物质结合后,干扰了荧光染料与细胞成分的结合,造成荧光
强度的改变。例如,用醛类固定剂进行 DNA 分析时，可以使荧光
强度降低约 50%。
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2.2.2.5 流式细胞术检测细胞周期
2.2.2.5.1 实验原理
用流式细胞仪检测细胞周期，通常用碘化丙啶（propidium iodide，PI）染细胞核。
PI在一定波长的光下发出荧光，其强度与DNA含量成正比。
通过流式细胞仪分析各时期的细胞百分数，可检测细胞的增殖、凋亡。
2.2.2.5.2流式细胞仪检测A549细胞周期步骤
收集对数生长期细胞，计数，以(1~5)×105/孔接种于6孔板，置37℃，5％CO2条件下培养过夜，使细胞贴壁。
次日更换培养液，各孔分别加入含有0、80、400、2000、10000 mg/L不同浓度茶氨酸的细胞培养液2 mL/孔，继续常规培养；每24 h同法换液一次。
每个浓度设3个重复。
48 h后，中止培养，胰酶消化后，收集细胞于流式管1000 r/min离心5min，弃上，冷PBS洗涤细胞3次，离心去上清；
一边震荡一边向细胞沉淀中加入70%预冷乙醇混匀，4℃固定18 h以上；离心，弃去乙醇上清，加入预冷的PBS洗沉淀1次，离心去上清；
加入RNA酶（50 mg/L）10 μL/孔和PI（50 mg/L）300 μL/孔，震荡混匀。
室温、避光反应30 min；
流式细胞仪进行DNA检测，用Modifit软件分析各时相细胞周期的比例。
2.2.2.6流式细胞仪检测A549细胞凋亡
2.2.2.6.1实验原理
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。
AnnexinV 是一种分子量为35～36 kD的Ca2＋依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。
因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
2.2.2.6.2 结果判断
凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI 有抗染性，坏死细胞则不能。
细胞膜有损伤的细胞的DNA 可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。
因此，在细胞凋亡的早期PI 不会着染而没有红色荧光信号。
正常活细胞与此相似。
在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象
限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。
2.2.2.6.3流式实验步骤
收集对数生长期A549细胞，计数，以(1～5)×105个/孔接种于6孔板，置37℃，5％CO2条件下培养过夜，使细胞贴壁；次日更换培养液，各孔分别加入含有不同浓度茶氨酸的细胞培养液2 mL/孔，继续常规培养；每24 h同法换液一次；
在药物处理48 h后，以不含EDTA的胰酶消化并收集细胞于流式管1000 r/min离心5 min，弃上清。
冷PBS洗涤细胞3次，离心弃上清；
按照Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒的说明，向细胞中加入Binding buffer 150 μL/管和Annexin-V 5 μL/管，振荡混匀。
室温、避光反应15 min；
再次加入Binding buffer 100 μL/管和PI染料5 μL/管，振荡混匀；
用流式细胞仪检测细胞凋亡。