体外细胞实验方法
体外细胞活性实验报告
一、实验目的本实验旨在探究不同浓度药物对细胞活性的影响，通过体外细胞培养和细胞活性检测方法，评估药物对细胞增殖的影响，为药物筛选和作用机制研究提供实验依据。
二、实验材料1. 细胞：人胚胎肾细胞（HEK293）。
2. 药物：实验药物A、B、C。
3. 培养基：DMEM培养基（含10%胎牛血清）。
4. 试剂：胰蛋白酶、MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-yl)-2,5-二苯基四唑溴化物）、DMSO（二甲基亚砜）等。
5. 仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪、离心机等。
三、实验方法1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于培养皿中，置于CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后，进行药物处理实验。
2. 药物处理：将实验药物A、B、C分别用DMSO溶解，配制成不同浓度（0、10、20、40、80、160、320 μg/mL）的药物溶液，分别加入培养皿中的细胞中，每组设3个复孔，培养24小时。
3. MTT检测：将药物处理后的细胞用胰蛋白酶消化，收集细胞，调整细胞密度为1×10^5个/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL，培养24小时。
向每个孔中加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），继续培养4小时。
加入150 μL DMSO，充分溶解蓝紫色结晶，用酶标仪测定各孔吸光度（OD）值。
4. 数据分析：采用GraphPad Prism软件进行统计分析，比较不同浓度药物对细胞活性的影响。
四、实验结果1. 不同浓度药物对HEK293细胞活性的影响：随着药物浓度的增加，药物A、B、C 对HEK293细胞的抑制作用逐渐增强。
其中，药物A在320 μg/mL浓度下对细胞活性抑制率最高，约为90%；药物B在160 μg/mL浓度下对细胞活性抑制率最高，约为70%；药物C在80 μg/mL浓度下对细胞活性抑制率最高，约为50%。
2. 不同浓度药物对细胞生长曲线的影响：随着药物浓度的增加，药物A、B、C对HEK293细胞的生长曲线逐渐下降，表明药物对细胞增殖具有抑制作用。
体外皮肤变态反应 U937细胞激活试验方法
体外皮肤变态反应U937细胞激活试验方法U937Cell Line Activation Test1范围本方法规定了体外皮肤变态反应U937细胞激活试验的基本原则、要求和方法。
本方法适用于化妆品用化学原料潜在致敏性的评价。
2试验目的本试验用于检测体外培养的人组织细胞淋巴瘤细胞表面标记物CD86的表达变化，以评价受试物引起皮肤变态反应的可能性。
3定义3.170%细胞存活率浓度值70%cell viability（CV70）受试物染毒后，细胞存活率为70%时对应的受试物浓度值。
3.2刺激指数stimulation index（S.I.）与溶剂对照相比，扣除同型对照后流式细胞仪测定的受试物阳性细胞相对强度值。
3.3CD86有效作用浓度值Effective Concentration150（EC150）CD86的相对荧光强度值达到150时对应的受试物浓度值。
4试验的基本原则当致敏物质接触皮肤后，树突状细胞在移动到淋巴器官的过程中分化成熟，并上调一系列表面分子的表达。
体外培养类树突状细胞：人组织细胞淋巴瘤细胞，并和受试物共暴露48h后，使用荧光抗体染料对细胞表面分子CD86染色并用流式细胞仪测定，从而评价受试物是否具有致敏性。
5试剂5.1细胞选用人组织细胞淋巴瘤细胞（The human histiocytic lymphoma cell line，U937细胞）。
细胞使用前应进行稳定性检测。
推荐使用clone CRL1593.2细胞株。
5.2培养基RPMI1640基础培养液中加入10%胎牛血清、适量抗生素，配制成1640完全培养基。
5.3染色缓冲液磷酸盐缓冲液中加入5%的胎牛血清。
5.4染料和抗体类物质7-氨基放线素菌-D染料（7-AAD）或碘化丙啶（propidium iodide,PI）FITC标记的小鼠单克隆CD86抗体（FITC-CD86）FITC标记的小鼠IgG1（FITC-IgG1）6试验方法6.1细胞准备6.1.1细胞培养U937悬浮细胞使用1640完全培养基，于37℃、5%CO2培养箱内培养，倒置显微镜下观察细胞状态。
动物试验_体外实验报告
一、实验目的本研究旨在探讨某种新型抗肿瘤药物在体外细胞模型中的抗肿瘤活性，为该药物的临床应用提供实验依据。
二、实验材料1. 细胞：人肺癌细胞系A549、人胃癌细胞系SGC-7901、人乳腺癌细胞系MCF-7。
2. 药物：新型抗肿瘤药物，以DMSO溶解，浓度为1000μM。
3. 主要试剂：RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、MTT试剂、二甲基亚砜（DMSO）、细胞计数试剂盒等。
4. 仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪、离心机等。
三、实验方法1. 细胞培养：将人肺癌细胞系A549、人胃癌细胞系SGC-7901、人乳腺癌细胞系MCF-7分别接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
2. 药物处理：将培养至对数生长期的细胞以1×104个/孔接种于96孔板，分别加入不同浓度的药物（0μM、10μM、50μM、100μM、200μM、400μM、800μM）处理，每组设6个复孔。
同时设置空白对照组和DMSO对照组。
3. MTT法检测细胞增殖：药物处理48小时后，每孔加入20μl MTT试剂，继续培养4小时。
然后加入150μl DMSO，在酶标仪上测定各孔吸光度（OD）值。
4. 统计分析：采用SPSS 22.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），P<0.05为差异具有统计学意义。
四、实验结果1. 不同浓度药物对三种肿瘤细胞增殖的影响：随着药物浓度的增加，三种肿瘤细胞的增殖活性均受到抑制。
其中，在50μM和100μM浓度下，A549、SGC-7901和MCF-7细胞的增殖活性显著降低（P<0.05）。
2. 不同浓度药物对三种肿瘤细胞IC50值的影响：通过计算IC50值，发现该新型抗肿瘤药物对A549、SGC-7901和MCF-7细胞的IC50值分别为46.2μM、35.8μM 和43.1μM。
五、讨论本研究通过体外细胞实验，探讨了新型抗肿瘤药物在三种肿瘤细胞中的抗肿瘤活性。
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告5篇
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告5篇篇1一、引言肿瘤细胞增殖实验是研究肿瘤发生、发展及其相关机制的重要手段。
随着科技的进步，体外检测肿瘤细胞增殖的方法逐渐成为研究热点。
本文将对体外检测肿瘤细胞增殖的实验方法、应用及优缺点进行综述，为相关研究者提供参考。
二、实验方法1. 细胞培养细胞培养是体外检测肿瘤细胞增殖的基础。
研究者需根据实验需求选择合适的细胞系，并掌握细胞培养的基本技术，如细胞的复苏、传代、冻存等。
2. 实验试剂与仪器在进行肿瘤细胞增殖实验时，需要使用一系列的试剂和仪器，如细胞计数试剂、酶标仪、显微镜等。
这些试剂和仪器的选择对实验结果的准确性至关重要。
三、实验技术1. MTT法MTT法是一种常用的检测细胞增殖的方法，其原理是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原MTT，生成蓝色结晶物并沉积在细胞中，从而反映细胞的增殖情况。
该方法具有操作简便、快速、准确等优点，在肿瘤细胞增殖实验中得到了广泛应用。
2. BrdU法BrdU法是通过检测细胞内BrdU的掺入量来反映细胞的增殖活性。
该方法需要预先在培养基中加入BrdU，然后通过特异性抗体检测BrdU的掺入量。
BrdU法具有较高的灵敏度和特异性，能够更准确地反映细胞的增殖情况。
3. 流式细胞术流式细胞术是一种能够同时检测单个细胞多个参数的技术，可以用于分析细胞的周期、凋亡、增殖等情况。
在肿瘤细胞增殖实验中，流式细胞术可以用于检测细胞的DNA含量、BrdU掺入量等指标，从而更全面地了解细胞的增殖情况。
四、应用及优缺点1. 药物筛选与评价体外检测肿瘤细胞增殖实验可以用于药物的筛选与评价。
通过检测药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用，可以评估药物的抗肿瘤活性，为药物的进一步研究和开发提供依据。
2. 肿瘤病理学研究体外检测肿瘤细胞增殖实验还可以用于肿瘤病理学研究。
通过分析肿瘤细胞的增殖特性，可以了解肿瘤的发生、发展及其相关机制，为肿瘤的诊断和治疗提供理论依据。
3. 个体化治疗与预后判断体外检测肿瘤细胞增殖实验在个体化治疗和预后判断中也具有重要价值。
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告随着肿瘤研究的不断深入，传统的体内实验已经难以满足对肿瘤细胞增殖的准确检测，因此体外实验成为了肿瘤学研究的重要手段之一。
体外实验可以通过模拟人体内不同的环境来检测细胞在不同条件下的生长和增殖情况，以评估化合物或药物对细胞增殖的影响。
本文将从体外检测肿瘤细胞增殖的方法、优点及缺点、应用以及发展趋势等方面进行综述。
一、体外检测方法1. MTT法MTT法是一种较为简单、高通量的体外检测肿瘤细胞增殖的方法。
MTT试剂被还原为紫色的甲基溴化四唑，可通过分光光度计读取细胞数量和代谢活性，进而评估细胞增殖。
该方法适用于多种肿瘤细胞，包括淋巴瘤、乳腺癌、慢性髓性白血病等。
2. SRB法SRB法是一种将孵育细胞暴露于固定试剂（如三甲基硫醇盐）的体外细胞增殖测试方法。
三甲基硫醇盐会在细胞内与酸性物质结合，形成具有吸光度的紫色络合物。
该方法通常测量细胞种植密度、药物浓度和孵育时间等参数对细胞增殖的影响。
3. CFSE染色法CFSE染色法是一种流式细胞术，它使用一种绿色荧光素酰氯，可标记细胞的染色体。
当染色的细胞进入体内时，它们在短时间内通过复制遗传物质而散发出增加的荧光。
该方法适用于检测细胞核分裂、增殖速度和细胞寿命等方面的变化。
二、优点与缺点1. 优点（1）能评估化合物或药物对肿瘤细胞生长的影响，但不需进行动物实验。
（2）与体内实验相比，体外实验具有时间和成本优势。
（3）体外实验结果容易重复，从而提高结果的可靠性。
2. 缺点（1）不如体内实验直接评估药物治疗的效果。
（2）细胞生长环境和体内情况不同，在实验室条件下模拟体内情况会受到一些限制。
（3）细胞在体外环境下不可避免地发生异常。
三、应用体外实验在肿瘤学研究中被广泛应用，主要包括以下方面：1. 药物筛选体外实验可用于筛选具有抗肿瘤活性的化合物或药物，以确定哪些化合物或药物更有可能进入进一步的临床试验。
2. 分子机制研究体外实验可以通过检测肿瘤细胞的生长速率、形态和分化来验证分子机制假设。
体外细胞的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在研究体外细胞培养技术，通过观察细胞在不同条件下的生长、形态变化和生物学特性，探讨细胞培养方法在生物学研究中的应用。
二、实验材料与仪器1. 材料：- 人胚胎肾细胞（HEK293细胞）- DMEM培养基- 胎牛血清（FBS）- 0.25%胰蛋白酶- 10%胎牛血清- 无菌培养皿- 移液器- 吸管- 显微镜- 紫外可见分光光度计2. 仪器：- 培养箱- 恒温培养箱- CO2培养箱三、实验方法1. 细胞培养：- 将HEK293细胞接种于无菌培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
- 每2-3天更换一次培养基。
2. 细胞传代：- 当细胞生长至80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集细胞。
- 将收集到的细胞用DMEM培养基稀释至所需浓度，接种于新的培养皿中。
3. 细胞形态观察：- 使用显微镜观察细胞在不同培养时间下的形态变化。
- 拍照记录细胞形态。
4. 细胞活力检测：- 使用MTT法检测细胞活力。
- 将细胞接种于96孔板中，培养24小时后，加入MTT溶液，继续培养4小时。
- 使用酶标仪检测吸光度值。
5. 细胞增殖实验：- 将细胞接种于培养皿中，培养不同时间后，收集细胞，进行细胞计数。
- 计算细胞增殖率。
四、实验结果1. 细胞形态观察：- 初始接种的细胞呈梭形，细胞间连接紧密。
- 随着培养时间的延长，细胞逐渐增多，细胞间连接变稀疏，部分细胞出现变圆、萎缩等现象。
2. 细胞活力检测：- 细胞活力随培养时间的延长而降低。
3. 细胞增殖实验：- 细胞增殖率随培养时间的延长而降低。
五、实验讨论本实验成功培养了HEK293细胞，并通过观察细胞形态、细胞活力和细胞增殖实验，初步了解了细胞在不同条件下的生物学特性。
细胞培养技术在生物学研究中具有重要意义，可以用于研究细胞生物学、分子生物学、药理学等领域。
六、实验结论1. 体外细胞培养技术可以成功培养HEK293细胞。
2. 细胞在不同培养条件下表现出不同的生物学特性。
体外细胞刺激实验报告
一、实验背景随着现代生物技术的快速发展，体外细胞刺激实验在生物学研究、药物筛选、疾病诊断和治疗等领域发挥着越来越重要的作用。
本实验旨在探讨不同刺激条件下细胞生物学行为的改变，为相关研究提供实验依据。
二、实验目的1. 观察不同刺激条件下细胞形态、生长和增殖的变化；2. 分析细胞在刺激条件下的基因表达和信号转导变化；3. 为后续相关研究提供实验参考。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 细胞：人胚肾细胞系HEK293；- 刺激物：表皮生长因子（EGF）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、佛波酯（PMA）；- 药品与试剂：DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液、抗细胞周期蛋白抗体、抗磷酸化细胞周期蛋白抗体、RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、细胞计数试剂盒、流式细胞仪等。
2. 实验仪器：- 倒置显微镜；- 酶标仪；- 实时荧光定量PCR仪；- 流式细胞仪。
四、实验方法1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于6孔板，置于细胞培养箱中培养至对数生长期。
2. 刺激处理：将细胞分为对照组、EGF组、TNF-α组和PMA组，分别加入相应浓度的刺激物处理细胞。
3. 观察细胞形态：使用倒置显微镜观察细胞形态变化。
4. 细胞计数：使用细胞计数试剂盒检测细胞生长和增殖情况。
5. 细胞周期分析：使用流式细胞仪检测细胞周期分布。
6. 基因表达分析：- RNA提取：使用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA；- 逆转录：使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA；- 实时荧光定量PCR：使用实时荧光定量PCR试剂盒检测目的基因的表达水平。
五、实验结果1. 细胞形态：与对照组相比，EGF组、TNF-α组和PMA组细胞形态发生明显变化，细胞变得扁平，部分细胞出现突起。
2. 细胞计数：与对照组相比，EGF组、TNF-α组和PMA组细胞数量明显增加，细胞增殖加快。
3. 细胞周期分析：与对照组相比，EGF组、TNF-α组和PMA组细胞周期分布发生改变，S期细胞比例增加。
小鼠的体外实验报告
一、实验目的本实验旨在通过体外培养小鼠细胞，观察细胞在不同条件下的生长情况，分析细胞增殖、分化及凋亡等相关生物学行为，为进一步研究小鼠细胞生物学特性提供实验依据。
二、实验材料1. 小鼠胚胎成纤维细胞（CRL-1658）；2. DMEM培养基（高糖）；3. 胎牛血清；4. 0.25%胰蛋白酶；5. PBS缓冲液；6. CO2培养箱；7. 倒置显微镜；8. 流式细胞仪；9. 试剂盒及相关仪器。
三、实验方法1. 细胞培养：将小鼠胚胎成纤维细胞接种于6孔板，每孔加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM 培养基，置于CO2培养箱中，37℃、5%CO2条件下培养。
2. 细胞传代：当细胞贴壁生长至约80%时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，按1:3比例传代。
3. 实验分组：将细胞分为实验组和对照组，实验组给予不同浓度的实验药物处理，对照组给予等体积的溶剂处理。
4. 细胞形态观察：利用倒置显微镜观察细胞在不同处理条件下的形态变化。
5. 细胞增殖检测：采用CCK-8法检测细胞增殖情况，每组设3个复孔。
6. 细胞凋亡检测：采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况，每组设3个复孔。
7. 细胞周期分析：采用PI染色法检测细胞周期分布，每组设3个复孔。
8. 流式细胞仪检测：对细胞进行流式细胞仪检测，分析细胞增殖、凋亡及周期分布情况。
四、实验结果1. 细胞形态观察：实验组细胞在给予不同浓度实验药物处理后，细胞形态发生明显变化，与对照组相比，细胞生长速度减慢，细胞皱缩、变圆，部分细胞出现凋亡现象。
2. 细胞增殖检测：CCK-8法结果显示，实验组细胞增殖明显低于对照组，且随着实验药物浓度增加，细胞增殖抑制作用增强。
3. 细胞凋亡检测：Annexin V-FITC/PI双染法结果显示，实验组细胞凋亡率明显高于对照组，且随着实验药物浓度增加，细胞凋亡率升高。
4. 细胞周期分析：PI染色法结果显示，实验组细胞周期分布发生改变，S期细胞比例降低，G2/M 期细胞比例升高，说明实验药物处理可抑制细胞增殖，促进细胞周期阻滞。
体外抗药肿瘤细胞模型的建立实验的具体步骤及方法
体外抗药肿瘤细胞模型的建立实验的具体步骤及方法体外抗药肿瘤细胞模型的建立实验采取长时间药物处理、诱导抗性，最终筛选出具有
一定抗性的细胞克隆。
培养条件
一、
用含10%小牛血清的DMEM培养液，5%CO2，37℃培养。
实验步骤
二、
1. 将CHO细胞培养在含10%血清的DMEM培养液中，先用DOX（阿霉素）0.01
ug/ml 诱导培养CHO细胞3个月。
2. 然后在3个月内逐步增倍DOX的浓度达0.1 ul/ml，接着进行DOX低浓度的筛选。
3. 随后用无菌钢圈套取抗性倍数较高的克隆RC1作CHO和RC1对DOX的剂量-反应
曲线，求CHO和RC1的IC50值。
4. 抗性倍数即为RC1的IC50与CHO的IC50。
三、注意事项
1. 要具备培养细胞的实验室条件，谨防污染。
2. 通过实验计算出敏感细胞对该药物的IC50值，以确定其实诱导浓度。
3. 采用长期增量的培养法可产生稳定的抗药性细胞株，对阿霉素等产生抗性的细胞株，
往往对其他天然来源的抗肿瘤药亦可产生抗药性。
体外b细胞激活实验原理
体外b细胞激活实验原理体外B细胞激活实验是一种常用的实验技术，用于研究B细胞的活化和免疫应答过程。
在这个实验中，研究人员通常会使用刺激物质来刺激B细胞，观察其活化程度和产生的免疫反应。
本文将介绍体外B细胞激活实验的原理及其应用。
体外B细胞激活实验的原理基于B细胞的特性和免疫激活机制。
B细胞是免疫系统中的一种关键细胞类型，负责产生和分泌抗体，参与体液免疫应答。
在免疫激活过程中，B细胞通过受体的识别和刺激，进而活化并产生抗体。
在体外B细胞激活实验中，研究人员通常会使用多种刺激物质，如抗体、细胞因子、细菌产物等，来模拟体内的免疫激活环境。
这些刺激物质可以与B细胞表面的受体结合，触发一系列信号传导通路，最终导致B细胞的活化和免疫反应的发生。
具体而言，体外B细胞激活实验的过程通常包括以下几个步骤：1. 准备B细胞：从动物或人体中分离出B细胞，可以通过细胞分离方法，如密度梯度离心或磁珠分离等。
2. 刺激B细胞：将分离得到的B细胞与刺激物质一起培养，以模拟体内的免疫激活过程。
常用的刺激物质包括抗体、细胞因子等，可以直接添加到培养基中，或者通过刺激细胞表面受体来触发信号通路。
3. 观察细胞活化：通过多种方法来判断B细胞的活化程度，如细胞增殖检测、细胞表面标记物的表达检测等。
细胞增殖检测可以使用MTT法、BrdU法等，而细胞表面标记物的表达检测可以使用流式细胞术等。
4. 检测免疫反应：观察B细胞是否产生抗体等免疫反应。
可以通过ELISA法、免疫荧光法等来检测分泌的抗体的浓度和特异性。
体外B细胞激活实验的应用非常广泛，可以用于研究B细胞活化和免疫应答的机制，评估某些疾病的免疫功能，筛选和评价新型药物的免疫调节活性等。
例如，研究人员可以利用体外B细胞激活实验来研究自身免疫疾病的发病机制，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等。
同时，这种实验技术也可以用于评估免疫疫苗的效果，研究疫苗接种后产生的免疫应答。
总之，体外B细胞激活实验是一种重要的实验技术，通过模拟体内的免疫激活过程，研究B细胞的活化和免疫应答。
γδT细胞 体外培养实验方案
γδT细胞体外培养实验方案一、前言γδT细胞是一群兼有固有免疫和特异性免疫双重特征T细胞，具有杀伤与调节的双重功能，在维持局部免疫稳态中发挥不可替代的作用[1]。
主要分布于黏膜（肠粘膜、蜕膜）和上皮组织（人宫颈上皮），在外周血中占CD3＋T细胞的1％～5％，在抗微生物感染、调节免疫应答和抗肿瘤免疫方面发挥着重要的作用[2]。
按T细胞受体（T cell receptor ，TCR）类型不同，可将T细胞分为αβT细胞和γδT 细胞。
γδT细胞培养时，易混杂较多αβT细胞，为分离γδT细胞带来困难。
文献报道妊娠期，γδT细胞是母一胎界面重要的T淋巴细胞。
人类妊娠早期蜕膜富含活化的完全分化的和促炎性的γδ细胞[3]。
正常妊娠的人类和小鼠的外周血与蜕膜局部γδT 细胞数量均明显增多，且蜕膜γδT细胞比例较外周血明显上升[4]。
蜕膜γδT细胞有利于维持母-胎免疫耐受状态，正常妊娠妇女的蜕膜γδT细胞数量明显高于未妊娠或妊娠失败的妇女；而且蜕膜γδT 细胞有利于蜕膜局部IL-10及TGF-β等细胞因子的合成[5]。
人的胎盘由羊膜、叶状绒毛膜（又称丛密绒毛膜）和底蜕膜（又称基蜕膜）组成[6]。
二、γδT细胞特点1.量少，与αβT细胞共存。
2.γδT细胞呈悬浮生长。
3.黏膜组织（肠粘膜、蜕膜）、上皮组织（人宫颈上皮）、支气管肺泡、外周血含量较丰富。
三、实验组织来源1.蜕膜组织取自医院流产术的正常妊娠妇女，来源多且不涉及伦理问题。
2.底蜕膜来源于胎盘组织，不涉及伦理问题。
四、培养方法1.单个核细胞加入诱导因子（IL-2、IL-7、唑来膦酸）分化14-21天。
（诱导因子浓度1µmol/L唑来膦酸，400 IU/mL IL-2）2.直接分选γδT细胞，进行增殖培养。
五、从组织提取细胞方法1.组织切碎，胶原蛋白酶消化，过筛。
缺点：步骤较多易导致细胞死亡，活性细胞数量下降，细胞表面蛋白选择性丢失。
2.机械分解优点：可避免选择性细胞死亡或表面蛋白的选择性丢失。
体外细胞因子释放实验流程
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体外细胞培养的基本方法和技术
能够进行克隆培养的细胞一般只是一些活 力强、增殖能力强、对体外生长环境适应 性强的细胞。
八、微载体细胞培养法
微载体细胞培养法是一种是用于培养贴壁 依赖性细胞的大规模培养技术。
这种培养技术是在培养容器内加入培养液 及一种用对细胞无害的材料制成的颗粒 （微载体），使细胞在微载体表面覆着和 生长，通过不断的搅拌使微载体保持悬浮 状态的培养方法。
培养液中大量的微载体为细胞提供了极大 的生长表面，从而在培养容器体积不很大 的情况下，可培养大量的细胞。
第二节 原代培养
原代培养：从直接取自生物体细胞、组织 或器官开始的培养。 原代培养也叫初代培养，是从供体取得细 胞后在体外进行的第一次培养。 原代培养是建立各种细胞系的第一步，是 从事组织培养工作人员应熟悉和掌握的最 基增殖而产生一个子细胞群的过程。
克隆培养法也可以称作为单细胞分离培养法， 就是从细胞悬浮液中获得的单个细胞用于培 养，使之分裂增殖而产生一个细胞群的方法。
克隆培养不同于普通的原代培养或传代培 养，他强调培养产物的单一性而排除异质 性，所获得的培养产物为遗传特性几乎完 全相同的纯细胞系即细胞株。
所谓旋转管培养法，就是将所培养的组织 细胞接种在一管状培养器皿，再将旋转管 固定在一个可旋转的装置上边旋转边培养 的一种培养方法。
旋转管培养法的最大优点，随着旋转管的 转动，所培养的组织细胞浆交替接触到培 养液和气体环境。有利于培养物的生长。
五、培养板培养法
培养板培养法过去曾被称为微量培养法，是 现代体外培养技术中最为普遍应用的常规培 养方法之一。
二倍体细胞培养法并不是一种专门的培养技术
实验八、卵母细胞的体外培养
实验八、卵母细胞的体外培养一、实验目的了解卵母细胞体外培养操作要领，掌握卵母细胞体外培养的方法。
二、实验材料1、卵巢、冷冻精液、M199培养液、血清、促性腺激素、雌激素、石蜡油、A23187、1%BSA、Tyrode’s改良液。
2、器械：培养皿、15ml试管、胶塞、注射针头、培养箱、吸管、离心管。
三、实验内容（一）卵母细胞的获得从屠宰场废弃卵巢中抽取卵母细胞已为大多研究者所接受。
真空泵法是一种有效的猪卵母细胞采集方法。
手动抽吸法在卵母细胞的成熟率方面优于真空泵法。
应用乙醚、乌拉糖、846麻醉药（耳静脉注射只）等麻醉后，再按外科手术要求打开腹腔。
将母兔背朝下方固定于兔手术台上。
在兔腹部最后两对乳头的腹中线部剪毛，用沾满肥皂液的纱布清洗局部，再用剃须刀片刮毛，先后用碘酒和酒精棉球由内向外进行消毒。
然后盖上创巾并固定。
用手术刀在腹部正中线处皮肤切开2～3cm长的术口，再在腹壁肌白线上切一小口，用中指垫着以手术剪来扩大剪口。
打开腹腔后，沿着子宫轻轻引出输卵管及卵巢。
与卵巢下脂肪组织处，用长夹夹住以固定卵巢。
仔细观察卵巢的变化。
记录排卵点（卵巢排过卵后的小红点）。
先在卵巢上找到卵泡，用手指固定卵巢，用10ml注射器配上9号针头，吸一些冲卵液（也可用生理盐水代替）,把针头插入卵泡中吸去取卵母细胞。
从卵巢中获得的卵母细胞为什么通常是未成熟：因为卵细胞形成过程中的减数第二次分裂是在精卵结合过程中完成的，所以只有完成受精后卵细胞才是成熟的，当然也已经完成受精了。
人工获取的卵细胞一般都是只完成了减数第一次分裂。
卵母细胞受精过程卵母细胞(oocyte)：在卵子发生过程中进行减数分裂的卵原细胞。
分为初级卵母细胞、次级卵母细胞和成熟的卵母细胞，它们分别是卵原细胞分化和DNA复制分裂后产生、第一次减数分裂和第二次减数分裂的产物。
（二）卵母细胞的体外培养1、培养液的准备用于卵母细胞体外成熟的基础培养液应用最广泛的是M199。
体外细胞实验方法
细胞株在适当的培养基中保持10% FBS。
从Addgene(质粒)购买HA-FLAG-UCHL3。
#22564，然后再克隆到pGEX-4T-2载体(Clontech)中。
UCHL3C94A和S75A突变体由位点定向突变层积产生)。
抗uchl3抗体购自ProteinTech公司(12384 - 1 - ap)。
抗ub (P4D1)、抗rpa32 (9H8)、抗brca1 (D9)抗体购自Santa Cruz Biotechnology。
抗rad51 (N1C2)是从GeneTex购买的。
反γH2AX(05 - 636),anti-BRCA2(OP95)和anti-MDC1(05 - 1572)从微孔被购买。
Anti-BRCA2(推上a303国道- 435 a)和anti-γH2AX架a300型(- 081 a)从Bethyl购买实验室。
抗53bp1 (NB100-304)购自Novus Biologicals。
Anti-Flag(m2)、anti-HA anti-β-actin抗体购买的σ。
反磷（血清/thr）atm/atr衬底抗体（2851）是从细胞信号技术中购买的。
CRISPR / Cas9敲除(sgRNAs)使用:sgUCHL3-1(5′-GCCGCTGGAGGCCAATCCCGAGG-3′)和sgUCHL3-2(5′-GCCCCGAAGCGCGCCCACCTCGG-3′)。
gRNA序列被克隆到载体中。
LentiCRISPR-V2-puro。
细胞被慢病毒感染sgRNA-puro随后与2μg /毫升嘌呤霉素广泛的选择,和单一的克隆是通过连续稀释和放大。
通过免疫印迹鉴定克隆抗uchl3抗体，并通过DNA测序验证。
重组蛋白表达和下拉试验。
构建表达His-RAD51和GSTUCHL3蛋白的质粒，构建RAD51和UCHL3的编码序列被亚克隆为pET-32a和pGEX-4T-2。
为了产生重组蛋白，每个表达结构都转化为大肠杆菌BL21 (DE3)。
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告
肿瘤细胞增殖是肿瘤发展过程中的重要特征，对于研究肿瘤的生物学特性以及寻找抑制肿瘤细胞增殖的治疗方法具有重要意义。
体外检测肿瘤细胞增殖的实验方法有多种，本文对其中的几种常见方法进行综述和分析。
一、MTT法
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)法是一种常用的测定细胞活力和细胞增殖的方法。
该方法通过将MTT重链亚甲蓝溶液添加到培养皿中，MTT会被活细胞内还原为紫色的甲蓝晶体。
晶体可被有机溶剂溶解，测定溶液的吸光度即可得到细胞的增殖情况。
二、细胞计数
细胞计数是一种直接测量细胞数目的方法，可以通过显微镜计数室或细胞计数仪来进行。
方法简单、直观，但由于需要高倍显微镜观察和手工计数，准确性较差，且操作繁琐。
三、焦磷酸酶检测
焦磷酸酶检测通过检测细胞中的磷酸化焦磷酸酶来间接估计细胞增殖情况。
细胞中的焦磷酸酶水平与细胞增殖密切相关，因此可以作为评价细胞增殖的指标。
四、流式细胞术
流式细胞术是一种高通量、高灵敏度的细胞分析技术，可以测定细胞免疫表型、细胞周期以及检测细胞增殖。
通过细胞标记物（如细胞融合素、DNA染料等）与流式仪相结合，可以对细胞增殖情况进行定量分析。
选择合适的体外检测肿瘤细胞增殖的方法需要综合考虑实验的目的、所需灵敏度、成本以及实验室的设备和技术水平。
不同的方法可以互补使用，以提高结果的准确性和可靠性。
未来，随着技术的不断进步和发展，体外检测肿瘤细胞增殖的方法将会更加完善、快速和准确。
体外抗体形成细胞检查法(溶血空斑实验 PFC)(Plaque forming ce
体外抗体形成细胞检查法（溶血空斑实验 PFC）(Plaque forming cePFC测定技术又称溶血空斑试验。
是一种体外检测单个抗体形成细胞（浆细胞）的方法。
自从1963年 Jerne和Nordin首先建立PFC测定技术以来,使免疫学方法得到很大的发展。
特别是间接溶血空斑测定法的建立，更扩大了本实验的应用范围。
它不仅可以测定产生 IgM 类的抗体产生细胞，而且还可以检测产生其他各类免疫蛋白及其亚类的抗体形成细胞。
它不仅可以作为免疫基本理论研究的有力工具，而且还可以作为临床筛检抗肿瘤新药以及研究中药对机体免疫功能的影响（免疫增强剂和免疫抑制剂）的特异指标。
溶血空斑试验分直接溶血空斑试验和间接溶血空斑试验。
前者是为测定产生 IgM 型抗体的细胞。
因为活化补体的能力强，可以不必另加抗Ig 试剂（显斑剂），也就是只加细胞和补体即可出现空斑，故称直接溶血空斑测定。
至于产生其他类型抗体的（如 IgG 或 IgA 等）细胞检测，就需要在试验系统中另加显斑剂（因为这些类别的抗体活化补体的能力弱）也就是加靶细胞和抗各类 Ig 高纯度的抗血清（系指用高浓度的抗原制备的抗血清）再加补体才能出现可见的空斑，故称间接溶血空斑测定。
小鼠脾PFC测定方法，经多次改进使本法的敏感度不断提高。
目前所用的方法分为：琼脂固相法和小室液相法。
其基本原理是将经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞（靶细胞）混合，在补体参与下，使抗体形成细胞周围结合了抗体分子的羊红细胞溶解形成肉眼可见的溶血空斑。
一琼脂固相法[实验材料]（1）玻璃器皿（7X1.5 厘米）（2）1毫升注射器和青霉素小瓶（3）水浴(47-49℃ )（4）Hanks'液（5）胎牛血清(56℃30分钟灭活,并经羊红细胞吸收)（6）琼脂或琼脂糖(表层基0.7%;底层基1.4%;用Hanks'液配制 ) （7）右旋糖酐(DEAE-dxtran分子量50万,用蒸馏水配置10毫克/毫升). （8）抗-Ig血清(测定间接空斑用)（9）20%绵羊红细胞悬液(Hanks'液配制)（10）补体:新鲜豚鼠血清(用前经绵羊红细胞吸收)[试验方法]（1）将溶化的底层琼脂倾注平皿形成一薄层, 将其凝固,备用。
浆细胞体外共培养方法
浆细胞体外共培养方法
1. 细胞来源，浆细胞可以从外周血、骨髓或淋巴组织中获得。
外周血浆细胞通常是最常用的来源，因为它们相对易于获取。
2. 细胞分离和纯化，从细胞来源中获得的混合细胞群需要进行
分离和纯化，以获得纯度较高的浆细胞。
这可以通过密度梯度离心、免疫磁珠分选等方法实现。
3. 细胞培养基和条件，浆细胞在体外培养时需要适当的培养基
和条件。
典型的培养基包括RPMI-1640等，通常还需要添加生长因子、细胞因子和补体等。
4. 激活和增殖，浆细胞在体外共培养前可能需要被激活，以增
加其分泌抗体的能力。
这可以通过给予细胞特定的刺激物质（如细
胞因子或抗原）来实现。
5. 共培养系统，浆细胞可以与其他细胞类型共同培养，如T细胞、B细胞或树突状细胞等，以模拟体内免疫反应的情况。
6. 数据采集和分析，在体外共培养结束后，需要对培养细胞进
行数据采集和分析，如测定细胞数量、细胞表面标记物的表达、细
胞分泌的抗体水平等。
综上所述，浆细胞体外共培养方法涉及到细胞来源、分离纯化、培养条件、激活增殖、共培养系统以及数据采集分析等多个方面。
这些步骤需要严格控制和操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。
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细胞株在适当的培养基中保持10% FBS。
从Addgene(质粒)购买HA-FLAG-UCHL3。
#22564，然后再克隆到pGEX-4T-2载体(Clontech)中。
UCHL3C94A和S75A突变体由位点定向突变层积产生)。
抗uchl3抗体购自ProteinTech公司
(12384 - 1 - ap)。
抗ub (P4D1)、抗rpa32 (9H8)、抗brca1 (D9)抗体购自Santa Cruz Biotechnology。
抗rad51 (N1C2)是从GeneTex购买的。
反
γH2AX(05 - 636),anti-BRCA2(OP95)和anti-MDC1(05 - 1572)
从微孔被购买。
Anti-BRCA2(推上a303国道- 435 a)和
anti-γH2AX架a300型(- 081 a)从Bethyl购买实验室。
抗53bp1 (NB100-304)购自Novus Biologicals。
Anti-Flag(m2)、anti-HA anti-β-actin抗体
购买的σ。
反磷（血清/thr）atm/atr衬底抗体（2851）是从细胞信号技术中购买的。
CRISPR / Cas9敲除
(sgRNAs)使用:sgUCHL3-1(5′-GCCGCTGGAGGCCAAT
CCCGAGG-3′)和sgUCHL3-2(5′-GCCCCGAAGCGCGCCC
ACCTCGG-3′)。
gRNA序列被克隆到载体中。
LentiCRISPR-V2-puro。
细胞被慢病毒感染
sgRNA-puro随后与2μg /毫升嘌呤霉素广泛的选择,和单一的克隆是通过连续稀释和放大。
通过免疫印迹鉴定克隆
抗uchl3抗体，并通过DNA测序验证。
重组蛋白表达和下拉试验。
构建表达His-RAD51和GSTUCHL3蛋白的质粒，构建RAD51和UCHL3的编码序列
被亚克隆为pET-32a和pGEX-4T-2。
为了产生重组蛋白，每个表达结构都转化为大肠杆菌BL21 (DE3)。
总之,在LB培养基培养细菌在37°C到1.2(OD600)和冷却30分钟在冰上。
然后细胞连续培养15 h在18°C添加0.8毫米isopropyl-b-D-hiogalactopyranoside之后(IPTG)。
细胞
然后用超声波提取和裂解。
细胞溶解产物
用16000g离心30min，得到的上清液与他的Mag Sepharose Ni (GE Healthcare)孵育，纯化His- rad51蛋白和GSH珠(Promega)，纯化
分别是GST和GST- uchl3蛋白。
体外GST-UCHL3拉试验,50µg重组GST和GST-UCHL3蛋白质绑定到谷胱甘肽珠子被5% BSA 在4°C 2 h其次是孵化与50µg His-UCHL3额外2 h在4°C。
然后用不同盐浓度的NETN缓冲液冲洗5次。
结合蛋白被筛选了1×SDSPAGE缓冲与加热10分钟在95°C。
用单克隆抗his 抗体检测His-RAD51，用Coomassie blue染色GST-UCHL3
体内变性去泛素化实验和体外脱泛素化实验
对于体内去泛素化实验，控制U2OS细胞，UCHL3敲除U2OS细胞，或UCHL3敲除U2OS细胞稳定表达HA-UCHL3野生型和突变Cys95阿拉巴马州(CA突变)在120年被细胞溶解μL 62.5
毫米Tris-HCl(pH值6.8),2% SDS、10%甘油,20毫米NEM,1毫米碘乙酰胺;煮15分钟;用含有蛋白酶抑制剂的NETN缓冲液、20mm NEM和1mm碘乙酰胺进行测定10次;然后离心分离细胞碎片。
细胞提取物的免疫沉淀与指示抗体和涂抹抗ub抗体。
为了制备大量泛素化蛋白作
为体外脱泛素实验的底物，HEK293T细胞与Myc-RAD51和His-Ubexpression载体一起转染。
在变性条件下，用他的珠子从细胞提取物中纯化泛素蛋白。
接下来，用Ub-RAD51蛋白从细胞提取物中纯化抗myc -琼脂糖颗粒在裂解缓冲液(50mm Tris-HCl pH)中7.8, 137毫米NaCl, 10毫米NaF, 1毫米EDTA, 1% Triton X-1000.2%萨科齐，1mm DTT, 10%甘油，新鲜蛋白酶抑制剂)。
重组GST-UCHL3和UCHL3 CA在BL21细胞中表达，按照标准方案纯化。
deubiquitination测定体外,ubiquitinated蛋白质是孵化与重组UCHL3 eubiquitination 缓冲区(50毫米Tris-HCl pH值8.0,50 mM氯化钠,EDTA 1毫米,10毫米德勤,5%甘油)4 h
30°C。
芯片
通过转染I-SceI表达质粒，在U2OS DR-GFP细胞中诱导单个DSB。
转染后24小时，细胞在室温下用1%甲醛固定10分钟，将蛋白质与DNA交联。
加入甘氨酸(0.125 M) 5分钟，停止交联。
细胞被收获,颗粒在细胞裂解缓冲resuspended(5毫米管道(KOH)在pH值8.0,85毫米
氯化钾,0.5% NP-40)亮抑酶肽1μg /毫升,1μg /毫升抑肽酶,1
毫米PMSF。
核在2000克的离心作用下，5分钟内被离心分离，然后在核溶解缓冲中重新悬浮（50 mM Tris在pH.1，10毫米EDTA，1%SDS，1 g/mL，1 g/mL aprotinin，1毫米PMSF），并将染色质切成平均大小为0.6 kb的染色质。
用三文鱼精子DNA/蛋白-琼脂糖浆液预先清除裂解物。
每个上清液的10%作为输入控制，并通过交联反转步骤进行处理。
其余的上层清
液与5μg孵化表示抗体在一夜之间在4°C。
珠被洗了四次:一次在高盐缓冲(50毫米Tris-HCl
pH值8.0,500毫米氯化钠,0.1% SDS、脱氧胆酸盐0.5%,1% NP-40,1毫米EDTA),在氯化锂缓冲区(50毫米Tris-HCl pH值8.0,250毫米氯化锂,NP-40 1%,0.5%脱氧胆酸盐,1毫米EDTA),和两次TE缓冲(10毫米Tris-HCl pH值8.0,1毫米EDTA,pH值8.0)。
然后在洗脱缓冲液(1% SDS, 0.1 M NaHCO3)中重新悬浮，在室温下旋转20分钟。
洗脱样品孵育0.2 M
氯化钠一夜之间在65°C到反向交联。
样本
孵化与核糖核酸酶为30分钟37°C其次是蛋白酶K 1 h在37°C。
然后使用PCR清理试剂盒对DNA进行纯化，并用于定量PCR分析。
芯片的PCR引物,∼220个碱基对远离I-SceI削减网站如下:向前,5′-GAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3′;和反向5′-CCGTAGGTCAGGGTGGTCAC-3′。
HR分析
我们使用来自Maria Jasin博士(纪念斯隆凯特琳癌症中心)的U2OS DR-GFP细胞，通过CRISPR系统产生控制或UCHL3敲除U2OS DR-GFP细胞系。
将ISceI表达载体(pCBA-I-SceI)转染到细胞中。
在I-SceI转染后2 d采集细胞，并使用流式细胞术检测I-SceI消化诱导的重组。
采用pEGFP-C1平行转染法对转染效率进行归一化处理。
统计数据
对于细胞存活试验和HR试验，数据提出了均值±SEM的三个独立的实验。
对于焦点形成分析，提出了数据作为三个独立的均值±SEM。
每项实验计数超过200个细胞。
统计分析采用t检验、方差分析或log-rank检验。
图中有1个星号表示P < 0.05, 2个星号表示P < 0.01。
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