第十章 花药培养

花药培养应注意的问题

（1）无机盐：特别是硝态氮和铵态氮的 浓度和比值，是影响花粉愈伤组织形成 的重要因素，无论是N6还是C17、W14、 FHG等都是通过大幅度降低培养基中铵 离子浓度和调整培养基中铵态氮和硝态 氮的比值而使培养效率大大提高。
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（2）碳源：作用有三，一是碳源，二是 能量，三是渗透压。蔗糖是较好的碳源， 烟草为3%，水稻为5%，小麦为10%， 玉米为12%。在大麦的花药培养中，麦 芽糖和纤维二糖的效果明显优于蔗糖。 用过滤灭菌的方法，用葡萄糖代替蔗糖 可明显地促进小麦花粉胚的形成和植株 再生。碳源种类和浓度的改变，还有很 多工作可做。
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分步培养：将花药接种在液体培养基 （含Ficoll）上进行漂浮培养时，花粉可 以从花药中自然释放出来，散落在液体 培养基中，然后及时用吸管将花粉从液 体培养中取出，植株于琼脂培养基上， 使其处于良好的通气环境中，使得花粉 植株的诱导率大大提高。
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条件培养基：所谓“条件培养基”即指预 先培养过花药的液体培养基。用这种条件 培养基再次来进行花药的培养，则可使花 药的培养效率大大提高。用条件培养基培 养单核中期的大麦花药，可使花粉愈伤组 织的诱导率从对照组的5%提高到80～90%。
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（2）生理状态：花药供体植株的生 理状态，对花粉愈伤组织的诱导率有 直接影响。 对水稻、小麦和大麦等禾本科植物而 言，大田植株比温室植株、主茎穗比 分蘖穗花粉愈伤组织的诱导率都明显 的要高。
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不同季节接种的花药愈伤组织诱导 率也有显著变化。如烟草、小麦早 期的花药比晚期的要好，愈伤组织 诱导率高，说明供体植株的生态环 境，特别是温度和光周期可能对花 粉发育及其对离体培养的反应有重 要影响。
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6 培养方式和培养条件 （1）培养方式：琼脂固体培养、液体培养、 双层培养、分步培养等。 液体培养：不加琼脂，使接种的花药漂浮在 液面进行培养，比在琼脂上培养效果更好。 但随着愈伤组织的长大变重，容易深入底部， 造成培养物通气不良。
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为解决这一问题，可在培养基中加入 30%Ficoll，以增加培养基的密度和浮力， 便培养物浮出液面。处于良好的通气状 态。
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双层培养：密度效应在花药培养中是很常见 的现象。所谓密度效应是指在一定的花药接 种密度范围内，花药愈伤组织的形成，随接 种花药的密度增加而增加。 增加花药的密度有二种方法：一是在一定的 体积的培养基中加大花药的接种数量；二是 在花药数量一定的情况下，减少培养基的用 量。
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第十章 花药培养
杨柏云 南昌大学生命科学学院
花药培养的历史


利用离休培养花药的方法，诱导花粉形成单 倍体植株的工作始于1964年（Guha et al. ,1964）。 单倍体植物的主要特点是其孢子体细胞的染 色体数目和配子体细胞染色体数目一致，对 单倍体植物进行染色体人工加倍之后，即可 得到同质结合的纯系，使育成的杂种不再分 离，缩短育种年限，加快育种速度。
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用冷处理可以增加诱导频率，其原因是： 冷处理抑制纺锤体的形成，冷处理不能 诱导花药的发育，但它有助于培养花粉 的存活。并且阻止配子体分化，导致较 高频率的花粉发育。冷处理的作用是间 接的，因此不是离体花药成功培养的先 决条件。
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3 材料的表面灭菌 对花药表面灭菌的方法很多，常用的方 法有：用市售漂白粉饱和液浸泡10～15 分钟；用8～10%安替福民水溶液浸泡 5～10分钟；用0.1%升汞浸泡10分钟。 如果小花或花蕾包封严密，只须用70% 酒精进行仔细擦拭即可。
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4 获得花粉植株的一般程序 禾本科植物花粉植株的诱导，一般分二 步进行。先是将花药接种到含2,4－D1～ 2mg/l的诱导培养基上，形成愈伤组织。 后是在花粉愈伤组织产生后的10～15天， 长到直径1～2mm时，及时将其转移到分 化培养基上进行植株分化。转移太迟会 降低成苗率。
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（3）植物激素：烟草可不用任何激素也 能产生再生植株。但禾本科植物花药培养 中，一般要加1～3mg/l的2,4－D，但在玉 米和燕麦的花药培养中，2,4－D反而会产 生抑制作用。细胞分裂素类物质（KT、BA） 可促进茄科植物的花粉植物的形成，但对 禾本科植物花粉的培养不是必要条件。一 般认为在诱导培养中加入KT有利于增强愈 伤组织的胚胎发生能力。
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而花药“竖放”时，只有一个药爿接触 培养基，上部的一个药爿完全曝露于空 气中，使其中的花粉处于良好的通气环 境中。当花药“竖放”时，不但绝大多 数的花粉愈伤组织都发生在上部药爿的 两个药室中，而且这种愈伤组织的质量 好，有较强的胚胎的发生能力。
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（2）培养条件：包括温度、湿度和光照 温度：离体培养的花药对温度很敏感。 早期的培养温度一般为25～28度，最近 发现较高的温度有利于愈伤组织的诱导 和绿苗的分化，一般在30～32度之间。 诱导愈伤的温度要比分化时的温度要高 点好。
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（4）氨基酸和其他有机附加物：专为花 药培养而设计的培养基如N6、C17、 W14等都含有甘氨酸，这可能源于MS、 Miller和White等常用培养基。此外，附 加谷氨酰胺、丝氨酸、脯氨酸、精氨酸、 天冬氨酸和丙氨酸可以显著提高花粉胚 及植株的获得率。酪蛋白水解物（LH） 和乳蛋白水解物（CH）对花粉愈伤组织 的形成和苗的分化表现出有利的作用。
花药培养的历史

在我国花药培养和单倍体育种方面做了 大量的工作，如培养基的研制，雄核发 育机理，培育新品种等。由于花药培养 的方法日趋完善，培养效率也逐年提高， 使这一技术开始被广泛应用于常规杂交 育种，逐渐成为作物改良和新品种培育 的一个重要手段。
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1 材料的选择 用作花药培养的亲本植株的基因型、 生长情况以及接种时花粉所处的发 育时期，对花粉植株的诱导频率都 有直接的影响。
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条件培养基的制作方法如下：将培养过 的培养基离心，收集上清液，即为“条 件培养基”。条件培养基不存在种的特 异性。用培养过小麦花药的培养基对大 麦同样有好的效应。
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花药座位：花药接种在培养基的座位（方 向），对培养效率也有明显的影响。花药 “竖放”（即一个药爿接触培养基）比 “平放”（即二个药爿接触培养基）效果 更好。这可能是由于“平放”时两个药爿 都接触培养基，造成通气不良所致。

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不同材料对处理温度的高低有不同的要 求，一般耐寒植物比喜温可耐受较低的 温度。低温处理时间视使用的温度而定， 较低的温度处理时间要短，反之则长。 烟草7～9度下处理7～14天，水稻7～10 度下处理10～15天，大麦3～7度下处理 7～14天，都可显著提高花药的出愈率。 但低温处理对小麦的效果不稳定。
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（4）花粉均等分裂途径 花粉进行均等分裂形成两个均等的子核， 以后二核间产生壁，形成两个子细胞， 由两个子细胞形成多细胞团，迅速生长， 穿破药壁而形成胚状体或愈伤组织。

第一种方法容易造成污染，所以多采用第二种 方法，即减少每个培养皿中的培养基至最少程 度。如，在一个35mm×10mm的培养皿内只 注入0.5ml的培养基。但由于张力原因，培养 基在培养皿内不易展平，再加上培养时间稍长， 易干涸，影响培养效果。为克服这一缺点，可 采用双层培养系统，即固体－液体双层培养基。 在培养皿中先加一层1mm琼脂培养基，凝固 后再加0.5ml液体培养基。
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7.花药培养中的花粉发育过程 （1）营养细胞发育途径 在花药离体培养中，花粉第一次有丝分裂形 成不均等的营养核和生殖核。生殖核较小，一 般不分裂或只分裂1-2次，就逐步退化。而体积 大的营养核经多次分裂且形成了细胞壁，最后 变成了多细胞团，迅速生长，很快突破细胞壁， 细胞团不断分裂，穿破药壁，可以产生胚状体 或愈伤组织。
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可见不同植物的花粉对离体培养有其特 定的、最敏感的发育时期。然而，对大 多数植物来说，单核期的花粉比较容易 培养成功。 检查和确定花粉的发育时期，通常将花 粉用醋酸洋红涂片观察，但对水稻和玉 米却用KI－I染色较好。
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2 预处理
为了获得最好的培养效果，在花药培养之前， 可先对其进行预处理。 最常用的方法是低温冷藏。具体做法是将带 有叶鞘的穗子或花蕾用湿纱布包裹后再用塑 料袋套起，放在冰箱中冷藏。
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适合烟草的H培养基（1967）；适合于 禾谷类的N6培养基（1975）；适合小麦 的C17培养基（1986）、W14培养基 （1988）和马铃薯－II培养基（1978）； 适合水稻的合5培养基（1978）、通用培 养基（1980）和SK3培养基（1978）； 适合玉米培养的正14培养基和玉培培养 基（1978）；适合大麦的FHG培养基 （1988）等。
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（3）花粉发育时期：不是任何发育时期的花粉 都可在离体培养时诱导产生愈伤组织或胚状体， 只有那些发育到特定时期的花粉，对离体刺激才 最敏感。 实验证明，烟草、曼陀罗和水稻的花粉从单核中 期到双核早期都可离体诱导产生愈伤组织。 小麦和玉米处于单核中期的花粉培养效果最好。 天竺葵和番茄分别为四分体和中期I的培养效果 最好。
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（1）基因型：实验证明，供体植株的遗传 背景对花药培养成败关系甚大。如水稻中 粳稻比籼稻容易培养，前者花粉愈伤组织 的诱导率平均可达10%，而后者只有1～ 2%。对各种基因型水稻的测试说明，花药 培养力（愈伤组织诱导率和绿苗分化率） 的顺序为糯型＞（粳×籼）杂种＞粳型＞ 籼型杂交稻＞籼型。可见基因型在花药培 养中起着关键的作用。
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（2）生殖细胞发育途径 在这种途径下，ຫໍສະໝຸດ Baidu养核只分裂1-2次就 退化了，而生殖核经多次分裂发育成多 细胞团。
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（3）营养细胞和生殖细胞同时发育的途径 花粉第一次有丝分裂形成的营养核和生殖核 同时进行多次分裂，因此最后形成的多细胞团 包括两部分，一部分细胞较大的是营养细胞分 裂而来；另一部分细胞较小的是由生殖细胞分 裂而来。
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分化培养基为去除2,4－D，加入NAA或 KT。在分化培养基是，愈伤组织会出现 绿点，最后发育成绿色植株。此外，在 禾本科植物的花药培养中，常会出现白 化苗，目前还没有有效的控制方法。
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5 培养基成分
培养基成分包括无机盐、碳源、氨基酸、维 生素和植物激素等。它们对花药的培养的成 功率有明显的作用。先前是用已有的培养基， 如MS、Miller和Nitsch等，后来研制出适合不 同植物的专用培养基。
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光照：离体花药对光照的反应在烟草和 曼陀罗上是不同的，连续光照可明显增 加烟草花粉胚的产量，但却强烈抑制曼 陀罗的花粉胚胎的发生。对禾本科植物 来说，一般主张愈伤组织的诱导期间进 行暗培养或给以弱光或散射光处理效果 较好。
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愈伤组织的分化原则上都应在光照下进行， 但光照长度和给光时间不同植物要求不同。 “先暗后光”是常用的方法之一，即愈伤组 织转入分化培养基之后，先在暗中培养3～5 天，在愈伤组织适应天低生长素、高细胞分 裂素的分化培养，并开始增长之后，再给每 天14小时1000～2000lx的光照。
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（5）活性炭：在花药培养中常使用活性 炭。实验证明，活性炭主要通过吸附而 发生作用，这种吸附作用是无选择的。 因此，对那些离体花药不需要外源激素 的植物（如烟草和燕麦），加入活性炭 效果特别显著。而那些对外源激素有较 强依赖的植物（如水稻和小麦），加入 活性炭反而有不利影响。