冷冻保存原理-张兆旺.

2018/11/17
动物繁殖原理与技术
13
（6）渗透性休克
冷冻胚胎刚解冻时，细胞内通常所含的渗 透性保护剂浓度很高，可达2000～ 3000mOsm/L或更高，若此时将胚胎 置于渗透压为300mOsm/L的等渗溶液 中，大量水分快速进入细胞而保护剂却不 能立即渗出，细胞急剧膨胀甚至破裂，这 种现象称为渗透性休克。
动物繁殖原理与技术
11
（5）破裂损伤
液氮中保存的胚胎或卵子，解冻后常见到 透明带或部分胞质破裂。 在投入液氮冷冻前的胚胎或卵子，处于浓 缩的抗冻液中，投入液氮后溶液由液态变 为固态(详见常规冷冻法)。
2018/11/17
动物繁殖原理与技术
12
相变
在解冻过程中使固体变为液体，这种液相 和固相急速转换过程中，由于物质的膨胀 率和收缩率不同造成断裂，这种现象称作 破裂损伤。为防止这种伤害的发生，缓慢 通过液体变相温度区域(-110～-130℃) 非常重要。
2018/11/17 动物繁殖原理与技术 3
快速降温的结局
如果温度下降很快，超过了细胞膜具 有的渗透能力（这种能力与细胞种类 大小和温度等因素有关），胞内水分 就来不及外渗，而是就地结冰，冰晶 体积达到一定程度就会对细胞膜和细 胞器造成机械损伤（挤压、穿刺）， 最终导致细胞死亡，这就是冷冻情况 下的物理损伤。
2018/11/17 动物繁殖原理与技术 7
（3）低温损伤和低温打击
一些动物品种的卵子或胚胎，在10～20℃情 况下则可受到损伤。这与胞质内的脂肪颗粒的 含量有关，这种损伤称为低温损伤（chilling injury）。 猪的胚胎在孵化囊胚以前的发育阶段对低温损 伤更为敏感，故迄今猪的卵子和胚胎的冷冻保 进展缓慢。牛体内受精卵发育到致密桑葚胚前 和体外受精卵发育到致密桑葚胚阶段的胚胎， 仍可出现低温损伤现象。 但是，体内或体外的胚胎超过上述发育阶段时， 几乎不受低温损伤的影响。
2018/11/17
动物繁殖原理与技术
10
化学毒性
造成这个结果的原因是抗冻保护剂的化学 毒性。另外，化学毒性的强弱不仅与抗冻 保护剂的种类有关，同时也受温度高低的 影响。 如果使用较高浓度的抗冻液，应选择化学 毒性较低的抗冻保护剂，且在室温下对胚 胎或卵子的处理时间相对要短。
2018/11/17
2018/11/17 动物繁殖原理与技术 8
低温打击（cold shock）
家畜的精子在室温到O℃之间的温度区域 急速降温，使得活率和受精能力下降，这 种现象称为低温打击（cold shock）。 但卵子和胚胎的这种现象不常见。实验证 明，小鼠的受精卵从液氮中直接投入室温 的水中反复冻融(2～3次)，仍保持存活 率。说明哺乳动物的卵子和胚胎除对低温 敏感外，温度变化对其存活的影响不大。
2018/11/17
动物繁殖原理与技术
14
细胞对皱缩和膨胀的耐受度
卵子和胚胎不能耐受过大而突然的跨膜渗透压 差。 大鼠的合子，在生理温度下，逐渐改变其容积， 皱缩到正常体积的25%或膨胀到290%，然 后恢复到正常可不影响其继续发育。 容积变化的速度和变化时的温度较容积变化的 大小对合子的发育更重要。为避免渗透性休克 对胚胎的损害，为使抗冻保护剂尽快地脱出， 将细胞膨胀控制在最小程度，有两种方法：
2018/11/17 动物繁殖原理Βιβλιοθήκη Baidu技术 15
渗透压缓冲液
一种是选择胞内抗冻剂；一种是在解冻液 中加入胞外抗冻剂，使细胞外液与细胞内 液等渗，这样，将胚胎放入胞外抗冻剂形 成的渗透压缓冲液中，就不会因胞内含大 量的胞内抗冻剂而吸入大量水分。因胞外 无渗透性抗冻剂，它可从胞内渗出，从而 被稀释，使细胞的膨胀得到控制。常用蔗 糖等双糖溶液作为渗透压缓冲液。
冷冻保存生物材料理论与实践
张兆旺
甘肃农业大学动物科学技术学院
2018/11/17
动物繁殖原理与技术
1
1.卵母细胞和胚胎在冷冻/解冻过程中死 亡的原因
2018/11/17
动物繁殖原理与技术
2
（1）物理损伤（胞内冰晶）
温度下降到细胞悬浮液冰点时，首先使细胞外 溶液中的水结冰，细胞内此时由于原生质的作 用处于过冷却状态（低于冰点而未结冰的状 态），随着温度的进一步下降和胞外冰晶的增 长出现了一种胞外溶液渗透压逐渐高于胞内过 冷溶液的不平衡状态。 要达到平衡，要么是胞内水分外流；要么是胞 内水分就地结冰。出现哪种情况取决于温度下 降的速度。
2018/11/17 动物繁殖原理与技术 9
（4）抗冻保护剂的化学毒性
采用慢速冷冻法对胚胎或卵子进行冷冻保 存，其冷冻液中所含抗冻保护剂的浓度一 般在1.0～2.Omol/L。 添加抗冻保护剂和生理性溶液大不相同， 当胚胎或卵子移入含有抗冻保护剂溶液中 平衡，随着时间的延长和浓度的升高，生 存率下降。
2018/11/17 动物繁殖原理与技术 5
（2）化学损伤（渗透效应或溶 液效应、胞外冰晶）
降温较慢时，胞内的水分不断外流然后结 冰，即胞外冰晶。细胞外液的水分形成冰 晶后使未结冰溶液浓度升高，若盐类浓度 升高，对细胞产生离子影响(盐害)，即 高浓度的的电解质作用于细胞膜，引起脂 蛋白复合物的变性和部分类脂质的丢失， 增加了细胞膜对阳离子的通透性，在细胞 上形成一些小孔，解冻时水分大量进入细 胞造成渗透休克。
2018/11/17 动物繁殖原理与技术 6
此时胞内外渗透压在高位相近或相等，随着冷 却时间的延长，细胞外液有更多的冰晶，使水 分逐渐减少，溶液发生浓缩，对细胞的影响越 来越大，原生质变干，电解质浓度增高，酸碱 度失衡； 抗冻液的浓度升高，抗冻剂的化学毒性也随之 增大，同样导致细胞死亡，这是冷冻对细胞的 化学损伤，也称溶液效应（solution effects）。降低温度可以减少盐类和抗冻保护 剂对细胞的化学损伤。 为避免化学损伤，冷却过程中应尽快地使溶液 降至致命温度以下的低温状态。
2018/11/17 动物繁殖原理与技术 4
胞内冰晶的预防
为使细胞内部不产生冰晶，冷冻保存液中必须 添加抗冻保护剂物质。胚胎或卵子的冷冻保存 中，常采用的抗冻保护剂除丙三醇外，还有乙 二醇、丙二醇、DMSO和乙酰胺等。这些物质 的分子量不超过100道尔顿，可以自由地通过 细胞膜，所以被称作渗透性抗冻保护剂或细胞 内液抗冻保护剂。细胞内、外液的抗冻保护剂 的摩尔浓度较高的情况下，使溶液的冰点下降， 具有抑制冰晶生成的作用。