现代微生物遗传学第三章质粒详解演示文稿
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现代微生物遗传学第三章质粒详解演 示文稿
优选现代微生物遗传学第三章质粒
• 一、质粒的发现
– F质粒(1946年)，第一个被发现的质粒
– 20世纪50-70年代：抗性质粒的大量研究，以及其他 质粒的发现
– 20世纪70年代后，质粒广泛应用于遗传工程和分子 生物学研究中。
• 二、质粒的命名原则
– 最初发现的质粒由研究者根据表型、大小等特征自行 命名。(F因子、R质粒、Col质粒等)
中被淘汰
– 选择性抑制带有质粒的菌的生长。
– 2.原生质体消除法
• 使待消除质粒的菌株在一定条件下形成原生质体， 在再生后生长的菌株中可出现高频率质粒消除菌。
• 二、遗传转移
– 将质粒导入已经消除了该质粒的原宿主细胞，比较 导入前后表型性状的差异或恢复程度。
• 三、分子杂交
– 在初步确定某菌株可能含有质粒的情况下，利用已 知表型性状的基因片段作探针进行分子杂交，来检 测其菌株是否含有该种质粒。
• 1.抑制物-靶位调控
• 依赖一小段反向转录的 RNA作为抑制物，通过它 与质粒DNA复制引物或编 码Rep蛋白（复制蛋白） 的mRNA的互补结合以阻 止质粒复制的起始。
– (1) ColE1质粒复制调控 （P122图5-7）
• 四、质粒的分离、检测与纯化
– 质粒分离方法：碱变性法
• 菌体的培养和收集
• 溶菌
• 碱变性处理
• 离心分离
• 有时为了快速提取质粒DNA，可以在提取液碱变性 后，用pH4.8的醋酸钠高盐缓冲液调节pH到中性， 这时染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构， 而即使变性的质粒可以恢复到原来的构型，再通过 离心，这样可以缩短提取质粒的时间。
• pBR322质粒：pMB1的ori和rop（ROP蛋白对质粒的复
制负调控）区；pSC101的tetr；Tn3的ampr。属中等拷 贝质粒，10~30个Baidu Nhomakorabea细胞 • pUC类：高拷贝质粒（100~300个/细胞），也是pMB1
的ori，但是没有rop。
• 质粒的寄主范围和质粒的拷贝数均决定
于质粒的ori区域。
• 二、质粒的复制
– 1.质粒复制的方式(P120)
• 质粒的复制起点称 为oriV,大肠杆菌为 oriC。
• 复制主要通过型复
制和滚环复制之一
进行。其中以型复
制为主（包括单向 和双向）。
• 质粒只编码一种或 少数几种与复制有 关的蛋白质，其他 复制蛋白都来自宿 主。
– 2.复制起点区oriV的 功能和pBR322质粒 • 复制起点区oriV 功能与质粒载体 的构建、寄主范 围
– 6.致病性质粒： • 根癌土壤农杆菌的Ti质粒；以及破伤风梭菌、肉毒 梭菌和大肠杆菌等都存在致病性质粒。
– 7. 共生固氮质粒 • 根瘤菌普遍喊有该类质粒。
• 包括共生质粒和非共生质粒，非共生质粒对共生作 用可有正或负的调节作用。
– 8. 隐蔽质粒(cryptic plasmid) • 酵母的2m质粒（p171） – 长为2m的6kb的环状双链DNA分子 – 位于酵母细胞核内，50~100拷贝 – 只携带与复制和重组有关的4 个基因，无遗传表 型
– 纯化和检测方法 • 琼脂糖凝胶电泳(质粒3种构型泳动速度不同，琼 脂糖浓度，EB染色，分子量的判断) • 氯化铯-EB密度梯度离心 • 电镜观察
第四节 质粒的复制与调节
• 一、质粒的大小和拷贝数 – 1.大小测定 • 表示方式：MD或kb，1MD的双链DNA≈1.65kb。 • 测定方法：电泳、电镜、测序。 • 大小范围：1~200kb，个别800~1000。 – 2.质粒的拷贝数 • 严紧型质粒(stringent plasmid)或低拷贝质粒； • 松弛型质粒(relaxed plasmid)或高拷贝质粒。（氯霉 素可抑制细胞分离，终止染色体复制，但松弛型质 粒可持续复制，其拷贝数可达到1000~3000）。
• 一、质粒消除（理化因子和生物学方法） – 理化因子消除法 • 消除剂：吖啶类，EB，某些抗生素，高温，UV等 • 如何判断某一遗传性状的丧失是质粒消除的结果还 是染色体基因突变的结果呢？
– 回复突变情况 – 突变率 • 理化因子消除质粒的作用机制： – 对质粒本身的复制和分离产生抑制作用，在生长
– 1976年Novick提出了质粒命名原则： • 质粒名称一般由三个英文字母及编号组成； • 第一个字母一律小写p表示（plasmid）
• 后两个字母要大写，可以采用发现者人名、实验室 名称、表型性状或其他特征的英文缩写。
• 编号为阿拉伯数字，用于区分同一类型的不同质粒。 (pUC18, pUC19等)
– 质粒上有两个600bp长的IR，被一个2.7kb区域和 一个2.3kb小区域所间隔
– 两个IR上都有一个专一重组位点(FRT)，经过重 组，可使质粒互变异构成A型和B型。
第三节 质粒的检测
• 检测质粒的方法主要根据质粒的（遗传学特性）和 （分子结构特性）。 – 遗传特性：独特的表型、转移、人为消除等。 – 分子结构：cccDNA和染色体相比对理化因子有更 强的抗性。
第二节 质粒编码的遗传表型
• 大多数质粒均控制着宿主细胞的一种或几种特殊性状， 具有一定的表型，质粒可依据其表型不同可划分为以 下几类： – 1.致育质粒 – 2.抗药性质粒 • 组成：转移区和抗性决定子 • 抗药的机制：改变抗生素作用的靶点；修饰抗生 素；组织抗生素进入；产生一种酶能代替宿主细 胞中被抗生素作用的靶点。
三、质粒复制的调控
• 质粒的调控一般采用直接或间接的负调控机制。 • 负调控因子可是蛋白质、RNA或DNA重复序列。 • 调控类型可分两类：
– 抑制物-靶位调控(inhibitor-target regulation) – 重复子-竞争结合调控(iteron-binding regulation)
– 3.产生抗生素的质粒
• 细菌素：细菌产生的一般只能抑制或杀死种内不同 亚种或菌株中敏感细菌的特殊多肽类代谢产物。
• Col质粒：10种，有非接合型和接合型之分。 – 4.产生毒性的质粒(BT) – 5.降解质粒：
• 假单胞菌属是一类能广泛利用有机化合物进行生长 的细菌。其体内含有大量的降解质粒。
优选现代微生物遗传学第三章质粒
• 一、质粒的发现
– F质粒(1946年)，第一个被发现的质粒
– 20世纪50-70年代：抗性质粒的大量研究，以及其他 质粒的发现
– 20世纪70年代后，质粒广泛应用于遗传工程和分子 生物学研究中。
• 二、质粒的命名原则
– 最初发现的质粒由研究者根据表型、大小等特征自行 命名。(F因子、R质粒、Col质粒等)
中被淘汰
– 选择性抑制带有质粒的菌的生长。
– 2.原生质体消除法
• 使待消除质粒的菌株在一定条件下形成原生质体， 在再生后生长的菌株中可出现高频率质粒消除菌。
• 二、遗传转移
– 将质粒导入已经消除了该质粒的原宿主细胞，比较 导入前后表型性状的差异或恢复程度。
• 三、分子杂交
– 在初步确定某菌株可能含有质粒的情况下，利用已 知表型性状的基因片段作探针进行分子杂交，来检 测其菌株是否含有该种质粒。
• 1.抑制物-靶位调控
• 依赖一小段反向转录的 RNA作为抑制物，通过它 与质粒DNA复制引物或编 码Rep蛋白（复制蛋白） 的mRNA的互补结合以阻 止质粒复制的起始。
– (1) ColE1质粒复制调控 （P122图5-7）
• 四、质粒的分离、检测与纯化
– 质粒分离方法：碱变性法
• 菌体的培养和收集
• 溶菌
• 碱变性处理
• 离心分离
• 有时为了快速提取质粒DNA，可以在提取液碱变性 后，用pH4.8的醋酸钠高盐缓冲液调节pH到中性， 这时染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构， 而即使变性的质粒可以恢复到原来的构型，再通过 离心，这样可以缩短提取质粒的时间。
• pBR322质粒：pMB1的ori和rop（ROP蛋白对质粒的复
制负调控）区；pSC101的tetr；Tn3的ampr。属中等拷 贝质粒，10~30个Baidu Nhomakorabea细胞 • pUC类：高拷贝质粒（100~300个/细胞），也是pMB1
的ori，但是没有rop。
• 质粒的寄主范围和质粒的拷贝数均决定
于质粒的ori区域。
• 二、质粒的复制
– 1.质粒复制的方式(P120)
• 质粒的复制起点称 为oriV,大肠杆菌为 oriC。
• 复制主要通过型复
制和滚环复制之一
进行。其中以型复
制为主（包括单向 和双向）。
• 质粒只编码一种或 少数几种与复制有 关的蛋白质，其他 复制蛋白都来自宿 主。
– 2.复制起点区oriV的 功能和pBR322质粒 • 复制起点区oriV 功能与质粒载体 的构建、寄主范 围
– 6.致病性质粒： • 根癌土壤农杆菌的Ti质粒；以及破伤风梭菌、肉毒 梭菌和大肠杆菌等都存在致病性质粒。
– 7. 共生固氮质粒 • 根瘤菌普遍喊有该类质粒。
• 包括共生质粒和非共生质粒，非共生质粒对共生作 用可有正或负的调节作用。
– 8. 隐蔽质粒(cryptic plasmid) • 酵母的2m质粒（p171） – 长为2m的6kb的环状双链DNA分子 – 位于酵母细胞核内，50~100拷贝 – 只携带与复制和重组有关的4 个基因，无遗传表 型
– 纯化和检测方法 • 琼脂糖凝胶电泳(质粒3种构型泳动速度不同，琼 脂糖浓度，EB染色，分子量的判断) • 氯化铯-EB密度梯度离心 • 电镜观察
第四节 质粒的复制与调节
• 一、质粒的大小和拷贝数 – 1.大小测定 • 表示方式：MD或kb，1MD的双链DNA≈1.65kb。 • 测定方法：电泳、电镜、测序。 • 大小范围：1~200kb，个别800~1000。 – 2.质粒的拷贝数 • 严紧型质粒(stringent plasmid)或低拷贝质粒； • 松弛型质粒(relaxed plasmid)或高拷贝质粒。（氯霉 素可抑制细胞分离，终止染色体复制，但松弛型质 粒可持续复制，其拷贝数可达到1000~3000）。
• 一、质粒消除（理化因子和生物学方法） – 理化因子消除法 • 消除剂：吖啶类，EB，某些抗生素，高温，UV等 • 如何判断某一遗传性状的丧失是质粒消除的结果还 是染色体基因突变的结果呢？
– 回复突变情况 – 突变率 • 理化因子消除质粒的作用机制： – 对质粒本身的复制和分离产生抑制作用，在生长
– 1976年Novick提出了质粒命名原则： • 质粒名称一般由三个英文字母及编号组成； • 第一个字母一律小写p表示（plasmid）
• 后两个字母要大写，可以采用发现者人名、实验室 名称、表型性状或其他特征的英文缩写。
• 编号为阿拉伯数字，用于区分同一类型的不同质粒。 (pUC18, pUC19等)
– 质粒上有两个600bp长的IR，被一个2.7kb区域和 一个2.3kb小区域所间隔
– 两个IR上都有一个专一重组位点(FRT)，经过重 组，可使质粒互变异构成A型和B型。
第三节 质粒的检测
• 检测质粒的方法主要根据质粒的（遗传学特性）和 （分子结构特性）。 – 遗传特性：独特的表型、转移、人为消除等。 – 分子结构：cccDNA和染色体相比对理化因子有更 强的抗性。
第二节 质粒编码的遗传表型
• 大多数质粒均控制着宿主细胞的一种或几种特殊性状， 具有一定的表型，质粒可依据其表型不同可划分为以 下几类： – 1.致育质粒 – 2.抗药性质粒 • 组成：转移区和抗性决定子 • 抗药的机制：改变抗生素作用的靶点；修饰抗生 素；组织抗生素进入；产生一种酶能代替宿主细 胞中被抗生素作用的靶点。
三、质粒复制的调控
• 质粒的调控一般采用直接或间接的负调控机制。 • 负调控因子可是蛋白质、RNA或DNA重复序列。 • 调控类型可分两类：
– 抑制物-靶位调控(inhibitor-target regulation) – 重复子-竞争结合调控(iteron-binding regulation)
– 3.产生抗生素的质粒
• 细菌素：细菌产生的一般只能抑制或杀死种内不同 亚种或菌株中敏感细菌的特殊多肽类代谢产物。
• Col质粒：10种，有非接合型和接合型之分。 – 4.产生毒性的质粒(BT) – 5.降解质粒：
• 假单胞菌属是一类能广泛利用有机化合物进行生长 的细菌。其体内含有大量的降解质粒。