qPCR之HRM技术原理及应用
QPCR原理及应用
QPCR原理及应用QPCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）即定量聚合酶链式反应，是一种可以对DNA进行定量检测的分子生物学技术。
通过测定DNA模版的初始数量，能够准确地对靶DNA在样品中的量进行定量分析。
QPCR技术已经广泛应用于医学、农业、环境科学等众多领域，并且在疾病诊断、基因表达研究、生物安全监测等方面具有重要意义。
QPCR的原理：QPCR主要基于DNA聚合酶链式反应（PCR）的原理。
PCR技术通过DNA聚合酶，利用DNA引物和酶切的DNA模板来扩增特定DNA序列。
在PCR的每一个循环中，DNA模板会被酶切成两段，然后引物结合到目标DNA上并扩增。
然后，扩增的DNA产物作为下一个PCR循环的模板，以此循环反复扩增。
在QPCR中，扩增的DNA产物通过酶的同步检测来实时监测。
QPCR使用一种荧光探针，在引物结合区域的扩增过程中释放出荧光信号。
荧光信号的强度与扩增DNA的数量呈正比。
通过检测荧光信号的强度，可以确定DNA的初始数量。
QPCR的应用：1.疾病诊断：QPCR可以快速、准确地检测疾病相关基因的表达水平，从而帮助进行疾病的早期诊断和病情监测。
比如，QPCR可以检测癌症相关基因的表达水平，辅助肿瘤的早期诊断和治疗。
2.基因表达研究：QPCR能够定量检测基因的表达水平，从而帮助研究基因在细胞和组织中的功能调控机制。
比如，研究在药物处理、细胞因子刺激等条件下，特定基因的表达水平的变化。
3.遗传病筛查：QPCR可以对遗传病相关基因进行定量检测，从而帮助进行遗传病的筛查。
通过检测特定基因的突变和表达水平，可以早期发现遗传病，并进行相应的干预和治疗。
4.放射性污染监测：QPCR可以快速、敏感地检测放射性物质污染的程度和范围。
比如，监测环境中的放射性同位素污染，以保护公众健康。
5.植物基因改良：QPCR可以帮助筛选目标基因在转基因植物中的表达水平。
通过检测基因的表达水平，可以确定转基因植物是否具有目标特性，从而加速植物基因改良的进程。
qPCR
完善中的基因变异分析简介 - 基因变异研究的重要性基因变异分析方法概述检测已知突变1.基本方法：终点法基因分型2.高级方法：基于熔解曲线的基因分型3.基本方法和高级方法的利弊HRM 法检测未知突变1.基于高分辨率熔解曲线基因扫描的原理和定义2.HRM 测定优化3.HRM 高级应用和下游技术参考文献及更多推荐目录1244567781315简介 – 基因变异研究的重要性人类在不同层次的个体基因组上存在差异：DNA序列在较长或较短重复单元的拷贝数中可能带有单核苷酸多态性（SNP）的插入、缺失或变异。
此外还包括DNA的共价键修饰方式的改变，比如通过CpG岛甲基化。
实时PCR提供不同的方法来检测此类不同类型的变异。
造成人类个体差异的基因序列变异90%以上属于单核苷酸多态性（SNP）。
虽然有许多SNP对细胞功能无影响，但科学家们认为其他一些SNP可能增加人类患病的可能性或影响他们对药物的吸收。
近年来，SNP基因分型成为动植物取证、育种等领域基因研究的重要部分，特别是在药物基因组学上。
定义SNP及其分类单核苷酸多态性，即SNP（发音为“snips”），是基因组序列中的单核苷酸（A，T，C或G）发生变化时产生的DNA序列变异（见表1）。
被视为SNP的变异必定发生于至少1%的人群中。
SNP约占所有人基因变异的90%，发生于共300万个碱基人基因组中的每100－300个碱基。
SNP可发生于基因组的编码（基因）和非编码区。
根据广泛使用的定义，SNP可被分为以下4级：1级 SNP包括C/T和G/A转换，由此生成C::G和A::T同质双链以及C::A和T::G异源双链。
2级SNP（C/A和G/T）包括生成C::T和A::G异源双链的颠换。
3级SNP（C/G）生成带有C::C和G::G异源双链的C::G同质双链。
4级SNP（A/T）生成带有A::A和T::T异源双链的A::T同质双链。
在可能存在的单碱基多态性中，A突变成T的 4级SNP是最难解决的，因为纯合基因型在其TM中的差异最小（通常仅约为0.2°C）（有关在LightCycler® 480实时PCR系统上成功检测4级SNP的示例请参见参考文献3,6）。
HRM
Applied Biosystems7500荧光定量PCR新应用HRM(高分辨率溶解曲线)的高通量基因突变扫描Enid M.ZhaoApplications Specialistcnmcbsupport@Contents●HRM应用的3个特点:●与常规SYBR Green溶解曲线功能相比,HRM的特点:原理熔解曲线7500Software v2.0●New look for the7500and7500Fast Systems with new,moreuser-friendly v2.0software andHRM*capability●Improvements to existing SDSv1.4workflows●Additional features includinggene expression study package ●Versatile interfaces to suitexperienced customers and new users*HRM–High Resolution Melting饱和性染料例如LC Green®Spectra vsSYBR®Green化学:纯荧光谱FAM dye Saturating Dye1 ROX dye SYBR Green dye2.仪器:HRM在溶解曲线阶段要求高捕获率Regular Dissociation High Resolution Dissociation Capture rate~0.2-0.5°C Capture rate~0.1-0.02°C3.HRM数据分析–荧光标准化和生成等位基因特定曲线的温度变化数据工作原理?杂合子样本融解曲线读取高分辨率溶解曲线标准溶解曲线●每个孔扩增产物有一个Tm值HRM图形HRM的发展特点和优势应用应用应用HRM on7500fastHRM on7500fast简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程7500fast HRM应用举例7500fast HRM应用举例Thanks for your attention cnmcbsupport@ 。
HRM技术
最新SNP检测方法！无与伦比！！SNP, 无与伦比, 检测高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法——HRM技术应用HRM介绍高分辨熔解曲线分析（high-resolution melting analysis，HR）技术是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
基于高效稳健的PCR 技术，HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM 技术受到普遍关注。
HRM原理HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。
随着高精度PCR仪（LightCycler® 480和Rotor-Gene 6000）和饱和染料（LC Green、Eva Green等）的出现，HRM技术的普及使用成为可能。
HRM应用1.SNP（单核苷酸多态性）的筛查。
2.基因突变扫描，包括缺失、重复、点突变。
3.新突变的筛查。
4.甲基化的筛查。
5.遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。
6.HLA基因组配型、等位基因频率分析、物种鉴定、品种鉴定、甲基化研究。
7.法医学鉴定、亲子鉴定。
8.动植物品质相关多态性位点的研究等。
植物抗逆性，突变与性状关联性研究。
HRM特点高通量：1次可同时检测10-384样本，适合大样本、多SNP、多突变位点及多位点甲基化的扫描。
高敏度：肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1%的突变样品基因突变，即检测到1000个正常细胞中1个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中突变检测。
检测灵敏性远高于“PCR+测序”的25%，即100个正常细胞中至少有25个突变细胞，测序仅适用手术组织。
HRM 技术优势与应用范围
HRM技术比较与适用领域目前突变/SNP的研究手段大致有三大类：1、以荧光共振能量传递为基础的检测方法，简单的说就是以定量PCR为基础的，比如我们很熟悉的Taqman探针法，以及经常提到的分子信标（Molecular beacon）和FRET（HybProbe），应用这一类方法时需要我们对突变位点或是多态性位点的背景很清楚，针对特定的突变位点或多态性位点设计并合成序列/位点特异性探针。
2、以分子杂交技术为基础的检测方法，如寡核苷酸连接分析（OLA）和动态等位基因特异性杂交（DASH），这几种方法也均涉及到序列特异性探针，合成荧光标记探针的费用昂贵，一般每个荧光标记探针价格为2000－3000人民币之间。
3、是基于PCR技术与其它方法相结合的检测方法，如变性-高效液相色谱（DHPLC）、SSCP（单链构象多态性）、DGGE（变性梯度凝胶电泳），这几种方法在PCR扩增的基础上对产物过柱分析，或电泳分析，无需合成序列特异性探针；第三类方法中还包括测序、Pyrosequencing和Ecotilling等技术。
此外还有芯片等技术可用于SNP分析。
第一类方法中最常用的技术为Taqman探针法，用于对特定位点SNP的检测，其显著特点是速度快，通量大。
第二类方法由于方法的可操作性及其它一些原因，一直没有得到普遍的应用。
第三类方法的显著特点是不受位点的局限，可对已知和未知突变/SNP 进行操作，但DHPLC仪器昂贵，使用成本高，SSCP和DGGE通量相对较小、操作繁琐、成本高、速度慢；测序是所有突变/SNP检测的金标准，但测序的成本相当可观；Pyrosequencing技术的突出优势在于Pooling，特别适用于大规模的等位基因频率分析，但需要特殊的仪器，硬件成本高；Ecotilling是一种在目标区段内筛查SNP的高通量、低成本的方法，但由于需要合成特定的红外引物，所以在样本量少、研究区段多的情况下就无法体现其优势。
人力资源知识高通量低成本SNP突变或甲基化检测方法—HRM技术应用
（人力资源知识）高通量低成本SNP突变或甲基化检测方法—HRM技术应用高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法—HRM技术应用HRM介绍HRM技术是high-resolutionmeltinganalysis即高分辨熔解曲线分析技术，是近年国外兴起的壹种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
基于高效稳健的PCR技术，HRM不受突变碱基位点和类型局限，无需序列特异性探针，于PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-S NP、甲基化、HLA配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM 技术受到普遍关注。
HRM原理HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均壹性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。
随着高精度PCR仪（LightCycler®480和Rotor-Gene6000）和饱和染料（LCGreen、EvaGreen等）的出现，HRM技术的普及使用成为可能。
HRM应用•SNP（单核苷酸多态性）的筛查。
•基因突变扫描，包括缺失、重复、点突变。
•新突变的筛查。
•甲基化的筛查。
•遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。
•HLA基因组配型、等位基因频率分析、物种鉴定、品种鉴定、甲基化研究。
•法医学鉴定、亲子鉴定。
•动植物品质关联多态性位点的研究等。
植物抗逆性，突变和性状关联性研究。
HRM特点•高通量：1次可同时检测10-384样本，适合大样本、多SNP、多突变位点及多位点甲基化的扫描。
•高敏度：肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1%的突变样品基因突变，即检测到1000个正常细胞中1个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中突变检测。
检测灵敏性远高于“PCR+测序”的25%，即100个正常细胞中至少有25个突变细胞，测序仅适用手术组织。
高分辨率熔解HRM简介
高分辨率熔解HRM简介早在上世纪六十年代，双链DNA的熔解靠吸光度监测，数微克的DNA样品以每分钟0.1-1.0℃的速度缓缓加热，待直至数小时后完成熔解。
随后出现的利用荧光检测互补双链DNA是一个更灵敏的方法，这种方法需要先进行PCR富集DNA产物，它的流行得益于1997年问世的实时定量PCR仪Light- Cycler®。
毛细管进样和小样品体积保证了良好的温控效果，使得熔解速率大大加速到每秒钟0.1-1.0℃。
高分辨率熔解分析High Resolution Melting (HRM)于2003年发明，是一项近年来备受关注的创新的技术，实现了通过研究PCR产物依赖于序列的熔解温度而对PCR产物进行鉴定。
可用于检测样品中存在的双链DNA的单核苷酸多态性（SNPs）基因变异（Mutation）、多态性（Polymorphisms）和表观遗传学（Epigenetic）差异。
HRM分析技术的神奇之处在于它是基于对核酸双链高温熔解行为的实时监测，仅仅是在普通荧光PCR之后加一步闭管的熔解步骤，操作简便，样品可随着其本身的序列、长度、GC 含量及双链互补程度不同而被区分开。
因此，甚至是单个碱基如SNPs也可轻易被鉴定出。
原则上来说，HRM分析技术的发展得益于三项技术上的进步：1. 1. 发现了新一代的对DNA无抑制作用的饱和染料（如LC Green Plus，Resolight等）；2. 2. 高度精密的荧光监控光学系统的问世；3. 3. 发明了能够对熔解状况进行细致分析的新算法。
高分辨率熔解分析最重要的应用是基因扫描，相比传统基因分型技术，HRM具有许多优势：1. 1. 省钱—相比较测序和Taqman® SNP分型技术，HRM更适合于大规模基因分型项目；2. 2. 快速—能够在更短时间内精确分型；3. 3. 简单—易上手操作，可在高分辨率的荧光PCR仪上方便实现。
由于突变导致的突变样本熔解曲线相对于参考样本的变化是可以明显识别出来的。
qpcr的原理与应用
qPCR的原理与应用一、引言qPCR（quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种能够实时监测PCR反应的分子生物学技术。
通过测量PCR反应过程中特定DNA序列的荧光信号，可以定量分析初始DNA模板的含量。
由于其高灵敏度、高准确性和快速分析能力，qPCR广泛应用于基因表达分析、疾病诊断、细菌检测等领域。
二、qPCR的原理qPCR的原理是通过PCR反应扩增目标DNA序列，并利用荧光探针或SYBR Green等荧光染料实时监测PCR反应的过程。
qPCR分为两种常用的检测方法：荧光探针法和SYBR Green法。
2.1 荧光探针法在荧光探针法中，PCR反应体系中有一对互补的引物和一种与引物具有互补序列的特定荧光探针。
该荧光探针包含一个荧光物质和一个荧光淬灭物质，并且在荧光探针未与目标DNA序列结合之前，荧光物质和荧光淬灭物质之间存在着耦合作用。
在PCR扩增过程中，引物结合到模板DNA上，荧光探针与DNA序列结合并被5’-3’外切酶降解，使荧光物质与荧光淬灭物质分离，从而荧光信号得以释放。
通过检测荧光信号的强度，可以实时监测PCR反应的进行，并计算出目标DNA序列的初始模板含量。
2.2 SYBR Green法SYBR Green法是另一种常用的qPCR检测方法。
SYBR Green是一种荧光染料，它可以与双链DNA结合并发出荧光信号。
在SYBR Green法中，PCR反应体系中只包含一对互补的引物和SYBR Green染料。
在PCR扩增过程中，引物结合到目标DNA序列上，并通过扩增产生双链DNA。
SYBR Green染料进入双链DNA内部，结合并发出荧光信号。
荧光信号的强度与扩增产物的量成正比，通过检测荧光信号的强度，可以实时监测PCR反应的进行，并计算出目标DNA序列的初始模板含量。
三、qPCR的应用qPCR技术在许多领域都有广泛的应用。
以下列举了一些主要领域中的应用：3.1 基因表达分析qPCR技术可以用于定量检测特定基因的表达水平。
HRM技术发展和应用
HRM技术发展和应用作者：马自俭来源：《畜牧兽医科学》 2018年第3期摘要：高分辨率溶解曲线技术( HRM)是将饱和荧光染料，荧光探针和实时荧光定量PCR技术的优点进行整合而产生的一种用于检测基因突变位点和进行基因分型的新技术。
高分辨率溶解曲线技术以其成本低，通量高，简便快捷，高灵敏度和高特异性著称。
本文主要介绍HRM技术的研究进展和应用，以期为应用该技术的爱好者做理论参考。
关键词：高分辨率溶解曲线技术(HRM)；原理；发展中图分类号：Q754 文献标识码：B doi：10. 3969/j. issn. 2096-3637. 2018. 03.0251HRM的发展史HRM技术是近几年来新兴起的一种用于检测单核苷酸多态性的诊断技术。
HRM检测技术除了具有高通量、低成本、灵敏性和特异性高之外，真正实现了闭管操作，因此，HRM检测技术深受国内外科研人员的关注并得到广泛的应用。
已经商品化的用于HRM检测的仪器是LightScanner，它是由美国Idaho公司生产的专门用于单核苷酸多态性位点的检测的仪器，可以在5min的时间里检测96或者384个样品进行突变位点的检测。
此外，市场上其他公司的荧光定量PCR仪器也可以完成对突变位点的检测，如伯乐公司和罗氏公司生产的荧光定量PCR仪可以完成对反应产物的突变位点的检测和基因分型。
目前，常用的应用于基因分型的比较准确的方法之一是探针法，但是探针的合成成本比较高，因此，其临床应用也受到极大的限制。
而本文所介绍的HRM技术不会受到碱基的位点或者碱基的类型限制，也不需要合成价格较高的探针，只需要在反应结束后对反应产物进行一步溶解，再用仪器对溶解曲线进行分析，完成基因分型和突变位点的扫描。
2高分辨率溶解曲线技术的原理高分辨率溶解曲线技术的原理非常简单，就是在PCR扩增结束后，另设置一个解链的步骤。
在温度逐渐上升的阶段，DNA双链由于受到热力作用，碱基之间的氢键会逐步打开，在碱基双链解开到一半的时候，会产生一个解链加剧的点，这个关键点的温度就是DNA双链的Tm温度，在DNA双链逐渐打开的过程叫做溶解。
qpcr原理及应用
qpcr原理及应用
qPCR（quantitative polymerase chain reaction）是一种用于定量检测DNA或RNA分子的技术。
它基于传统的聚合酶链反应（PCR）技术，并添加了定量的元素，使其能够精确测量起始模板的数量。
qPCR的原理如下：首先，从待检测的DNA或RNA样品中提取目标分子，如基因或RNA转录产物。
然后，通过逆转录反应将RNA转化为互补的DNA（cDNA）。
接下来，在PCR试剂中加入引物（针对目标分子的特定序列）和荧光探针。
引物与目标序列特异性结合，PCR反应开始时，酶将引物与目标序列进行延伸。
同时，荧光探针被酶的活性降解，在PCR进行过程中释放出荧光信号。
荧光信号的强度与每个循环中的DNA产生的数量成正比。
最后，根据荧光信号的强度，可以通过标准曲线或一些数学算法计算出起始模板的数量。
qPCR广泛应用于许多领域，包括：
1. 遗传疾病诊断：通过检测DNA中的特定基因突变或缺失，可以早期诊断和筛查遗传疾病。
2. 病原体检测：qPCR可以用于检测病原体如细菌、病毒或寄生虫等，对于疾病的快速诊断和流行病学研究非常有用。
3. 分子生物学研究：qPCR可以用于对基因表达进行研究，例如通过检测mRNA的数量来研究特定基因的转录水平。
4. 食品检测：qPCR可以用于检测食品中的致病微生物，确保食品的安全性。
5. 环境监测：qPCR可以用于检测环境中的微生物，例如污水处理厂中的细菌，以评估环境的健康状况。
总的来说，qPCR是一种快速、准确且灵敏的分子生物学技术，被广泛应用于医学诊断、基因表达研究以及环境和食品检测等多个领域。
hrm高分辨率溶解曲线
hrm高分辨率溶解曲线
HRM高分辨率溶解曲线是一种用于分析DNA序列变异的技术。
它通过在PCR反应中加入特异性引物和荧光染料，对PCR产物进行实时监测，从而获得高分辨率的溶解曲线。
HRM高分辨率溶解曲线具有高灵敏度、高分辨率和高通量等优点，可以用于检测DNA序列的变异、基因多态性、SNP等。
它不仅可以用于科研领域，还可以应用于临床诊断、生物信息学等领域。
HRM高分辨率溶解曲线的原理是利用PCR产物在变性过程中，双链DNA会逐渐解离成单链DNA，这个过程伴随着温度升高。
当温度升高到一定程度时，引物和模板之间的结合力会减弱，导致引物和模板之间的解离。
这个过程可以通过实时监测PCR产物的荧光信号变化来获得溶解曲线。
HRM高分辨率溶解曲线的应用非常广泛，例如在遗传疾病诊断、基因多态性分析、SNP筛查等领域都有应用。
在遗传疾病诊断中，HRM高分辨率溶解曲线可以用于检测基因突变或缺失，帮助医生更准确地诊断疾病。
在基因多态性分析中，HRM高分辨率溶解曲线可以用于研究不同人群或种群之间的基因变异情况。
在SNP筛查中，HRM高分辨率溶解曲线可以用于快速检测大量的SNP位点，帮助研究人员更全面地了解基因变异情况。
总之，HRM高分辨率溶解曲线是一种非常有用的技术，可以用于分析DNA序列变
异、基因多态性、SNP等。
它的应用非常广泛，可以为科研、临床诊断、生物信息学等领域提供有力的支持。
hrm高分辨率溶解曲线
hrm高分辨率溶解曲线高分辨率溶解曲线（High-resolution Melting，简称HRM）是一种基于PCR技术的高灵敏度、快速检测和基因分型等应用的新兴方法。
它通过对PCR产物进行高温梯度退火，利用DNA序列中的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，简称SNP）或突变等，可以对不同的DNA样本进行鉴别和分类。
HRM技术的原理是利用DNA双链在高温梯度环境下的失配特性。
在PCR反应中，经过一定的循环扩增过程，得到目标序列的大量复制品。
然后，通过控制扩增产物的温度、缓慢升温，逐渐增加其中的失配碱基数目，最终使DNA双链断裂解离。
同时，加入一种特定的DNA染料（例如SYBR Green），该染料能够与双链DNA结合并发光。
当溶解曲线进行扫描时，溶解温度越高，样品中的双链DNA越容易解离，染料释放的荧光信号越强。
而当双链DNA中存在SNP或突变时，会引起其中某一个区域的碱基配对发生改变，导致产物的熔解曲线发生改变。
根据熔解曲线的形状、峰型、峰面积等特征，可以判断样品中的SNP型态或突变类型，并进行分类鉴别。
HRM技术具有多个优点。
首先，HRM技术不需要引入特异性的探针或标记物，减少了实验操作的复杂性和成本。
其次，HRM技术具有高度灵敏性和准确性，能够鉴别并区分出少量变异的DNA样品，并且对于SNP的鉴定准确度高。
此外，HRM技术具有高通量、快速、操作简单等特点，适用于大规模基因分型和突变检测等实验。
HRM技术在药物研发、医学诊断和遗传学研究等领域有着广泛的应用。
例如，在药物研发中，可以通过HRM技术对候选靶点进行筛选，评估药物的安全性和有效性。
在医学诊断中，HRM技术可以应用于肿瘤的分型和突变检测，早期发现和预测疾病的风险。
在遗传学研究中，HRM技术可以用于亲子鉴定、人群遗传学调查和基因组学研究等方面。
尽管HRM技术具有许多优点和应用前景，但也存在一些局限性。
HRM技术详解
HRM技术高分辨率熔解曲线分析技术（ High Resolution Melting ），简称HRM，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。
HRM 技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。
主要的研究方向集中在：1、基因未知突变以及SNP的扫描；2、已知突变及SNP的基因分型；3、动植物、微生物等物种的物种鉴定以及品种鉴定；4、法医鉴定、亲子鉴定；5、HLA的配型；6、甲基化的研究等。
一、HRM 技术的基本原理：HRM技术主要是基于核酸分子物理性质的不同。
不同核酸分子的片段长短、GC含量、GC分布等是不同的，任何双链DNA分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。
HRM 技术的基本原理就是在PCR反应之前加入饱和染料，在PCR反应之后进行升温变性，采集荧光信号，根据熔解曲线的不同即Tm值的不同来对样品来进行区分。
以二倍体细胞为例，当纯和子样品通过PCR扩增，经过变性复性后，仍然是纯合子；而杂合子 PCR 扩增完，经过变性复性后，样品中会形成部分的含有非沃森 - 克里克配对的双链分子存在（图一）。
杂合子样品扩增后，经变性复性，会有非配对碱基的形成，而纯合子样品没有。
这样，杂合子样品相对纯合子样品来说，双链不够稳定，表现在解链温度上就会有微小的差别。
如果采用高分辨率的仪器进行检测，并用专门的软件进行分析，微小的差别就会被检测出来，从而成功的筛选出纯合子与杂合子。
下图是杂合子样品熔解曲线的的示意图：图一：杂合子样品的熔解曲线为四种不同双链的熔解曲线的叠加的结果。
以二倍体细胞为例，杂合子扩增后通过变性复性会形成二种同源双链和两种异源双链的混合物，在熔解过程中四种链会形成一条独特的溶解曲线，从而与纯合子的熔解曲线区分出来。
二、HRM 技术的必备条件：HRM 技术走向实践应用主要基于两种技术的改进 :1、双链DNA嵌入型饱和荧光染料 LC-Green 的开发；采用饱和的荧光染料是进行HRM分析的必备条件之一。
高分辨溶解(HRM)分析
一、原理
PCR扩增产物的熔解曲线完全取决于DNA碱基序 列。序列中如有一个碱基发生了突变，都会改变DNA 链的解链温度。但是这个差异极小，只有零点几摄氏 度，如果仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。 HRM分析采用高精密仪器，在拥有饱和染料和高 分辨率仪器之后，对 PCR的扩增子进行加热，温度从 50°C逐渐上升到95°C。在此过程中，扩增子逐渐 解链，在到达熔解温度（Tm）时，DNA链分开，荧 光强度迅速降低。在HRM分析的初期，荧光强度很高， 随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度也就下 降了。HRM仪器通过照相机，记录下荧光变化的整个 过程。通过对数据的作图，就生成了熔解曲线。
HRM 的应用领域
1 、基因的突变扫描：检测杂合子 SNP 、区段 / 碱基缺 基因的突变扫描： 前后重复、杂合子缺失。 失、前后重复、杂合子缺失。 相关研究方向： 1 ） 样本中特定突变位点（ SNP ）的筛查，包括一 个片段中多个位点的复合杂合突变的Genotyping。 2 ） 疾病相关基因（癌基因）特定区段突变位点的 扫描，新突变的发现。 3 ） 遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。 4 ） 植物抗逆性，突变与性状关联性的研究。 5 ） 动植物品质相关多态性位点的研究等。
6 ．法医学鉴定、亲子鉴定。 法医学鉴定、亲子鉴定。 检测单核苷酸多态性 SNP 鉴定，插入 / 缺 失多态性 DIP 鉴定等 将 HRM 用于法医学 SNP 、 DIP 鉴定，协 助犯罪鉴定，亲子鉴定。相对于传统鉴定方法， HRM 是一种简单、便宜、高通量的二等位基 因分子标记鉴定的方法
高分辨溶解（ 第二课 高分辨溶解（HRM）分析 ）
hnxide@
高分辨率熔解（High-resolution melting，简 称HRM）分析是一门新兴的技术。它仅仅通 过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR 片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、 序列配对和基因分型等多个方面
HRM实验指导
高分辨熔解曲线分析技术高分辨熔解曲线分析技术，high resolution melting，简称HRM，是近几年来在国内外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。
它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、基因分型等分析。
HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。
同许多荧光PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。
实验前准备在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂，如：PCR检测用到的罗氏的LightCycler® 480 Control Kit和High Resolution Melting Master等。
High Resolution Melting Master中含有2× Master Mix(包含热启动Taq DNA Polymerase反应缓冲液，dNTP mix，高分辨率染料),25mM MgCl2，PCR级别的H2O，用于调整反应的最终体系。
本次实验所涉及到的仪器和耗材有：赛默飞公司提供的单道移液器、QSP 盒装吸头、冰盒，罗氏的LightCycler® 480，还有常规的离心机、水浴锅等。
HRM 体系配制实验中用到的HRM试剂盒需要对MgCl2溶液进行最近的浓度确认，以一管DNA样品为例展开实验。
先加入1号管的2× Master Mix 165μl，再加入9号管的primer mix 33μl，最后加8号管的mutation突变体33μl，混匀，瞬时离心，分装到相对应的管中。
qpcr的原理和应用
qpcr的原理和应用1. 原理qPCR（quantitative polymerase chain reaction）是一种高灵敏度的DNA定量分析技术，广泛应用于科研、医学诊断、农业等领域。
其原理基于PCR技术，通过测定DNA扩增产物的实时累积量来定量DNA分子的起始数量。
1.1 PCR基本原理PCR是一种通过体外扩增DNA的技术，采用DNA聚合酶酶链反应的方法，在短时间内快速合成大量复制DNA分子。
PCR反应主要包括三个步骤：变性（denaturation）、引物结合（annealing）和延伸（extension）。
在变性步骤中，PCR反应体系中的DNA双链被加热使之解链，形成两条单链模板；在引物结合步骤中，引物与目标序列互补配对；在延伸步骤中，DNA聚合酶以引物为模板合成DNA链，得到两条与原始模板相同的DNA 链。
一次PCR循环完成后，每个目标序列均被扩增一倍，多次循环后，DNA的扩增呈指数增长。
1.2 实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR是在PCR反应中加入荧光染料，通过检测反应体系中的荧光信号来实时监测DNA扩增过程。
根据荧光信号的增加量和循环数的关系，可以计算出起始样品中模板的起始数量。
实时荧光定量PCR通常使用两种类型的探针：SYBR Green探针和TaqMan探针。
SYBR Green探针是一种非特异性结合DNA的荧光染料，可以与PCR产物结合并发出荧光信号。
TaqMan探针是一种特异性与目标序列结合的引物，其在PCR 反应中被降解，释放出一个荧光信号。
根据荧光信号的变化可以确定DNA扩增的进程。
2. 应用qPCR技术在许多领域都有广泛的应用，在以下几个方面有较为突出的应用。
2.1 基因表达分析qPCR技术可以用于研究基因的表达水平，通过检测特定基因的mRNA量来确定基因的表达情况。
相比于传统的Northern blot和RNA测序技术，qPCR具有高灵敏度、高特异性和高准确性的优势。
hrm高分辨率溶解曲线
hrm高分辨率溶解曲线在战略管理中，高分辨率溶解曲线（High Resolution Melting Curve，HRM）是一项重要的技术，它用于检测DNA样本中的序列变异。
HRM技术通过监测DNA双链解旋和融合的过程中释放的荧光信号，能够快速、准确地分析DNA序列的变异情况。
本文将详细介绍HRM技术的原理、应用以及在人力资源管理中的潜在价值。
一、HRM技术的原理HRM技术基于PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）扩增的基础上，结合特定的荧光染料和曲线分析软件，实现对DNA序列变异的检测和分析。
在PCR扩增过程中，引物与DNA靶标序列结合，通过高温将DNA双链解旋成为两条单链，然后通过降温使引物与DNA靶标序列结合并生成新的双链，这个过程称为融合。
同时，荧光染料会与DNA结合，并放出荧光信号。
在HRM分析中，荧光信号会被连续监测并记录下来。
当DNA序列存在变异时，由于突变的序列结构和碱基成分的改变，其解旋和融合的过程会产生不同的热力学特性，从而导致荧光信号的变化。
通过分析荧光信号曲线的形状、峰值和面积等参数，可以准确地判断DNA序列是否存在变异。
二、HRM技术的应用领域1. 疾病诊断与预测HRM技术可用于检测与疾病相关的基因突变，例如肿瘤标志物、遗传性疾病、感染性疾病等。
与传统的测序方法相比，HRM技术具有快速、高通量、高灵敏度和低成本等优势，因此在疾病诊断与预测方面具有潜在的应用前景。
2. 品种鉴定与遗传分析在农业领域，HRM技术可用于鉴别农作物品种、检测动植物基因突变、分析遗传多样性等。
通过快速、准确地判断DNA序列的差异，可以帮助农业科学家提高品种鉴定的准确性，加速新品种的培育进程。
3. 药物研发与剂量调控HRM技术在药物研发中的应用主要包括药物基因敏感性筛选、药物代谢酶基因多态性检测等。
通过分析患者的基因型和药物反应之间的关系，可以优化药物疗效，减少药物副作用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
qPCR之HRM技术原理和应用
黄宝福
HRM
•High resolution melting curve高分辨率熔解曲线
•HRM的主要原理是根据DNA序列的长度、
GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。
•高通量
一次可同时检测多个样本
•高灵敏度
HRM可以检测SNP
•重复性好
PCR产物无需后续处理，实现闭管操作，避免交叉污染
•操作简便
只需设计PCR引物，进行PCR反应，无需特异性探针和荧光标记，不受突变碱基位点与类型限制
•成本低
相比传统SNP/突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，降低了使用成本
•适用范围广
可用于各种领域和不同标本
•其它
只检测PCR样品中的荧光强度变化，不消耗任何PCR样品，无污染，PCR产物可以用于下游分析，非常适合于测序前的SNP预扫描筛查
•基因的突变扫描
检测杂合子SNP
区段/碱基缺失
前后重复
杂合子缺失
•HLA基因组配型
器官移植HLA配型
同胞之间HLA基因型确定
•等位基因频率分析
SNP频率分析
•物种、品种鉴定
微生物品种
物种快速鉴定
动植物品种鉴定
•甲基化研究
甲基化位点筛查，甲基化程度分析•法医学鉴定
法医学SNP、DIP鉴定
基因突变-HRM检测
•基因突变是指由于DNA碱基对的置换、增添或缺失而引起的基因结构的变化
•基因突变是普遍存在的，是生物变异的主要
原因，是生物进化的主要因素
•但大多数基因突变对生物体是有害的
如绝大多数人类遗传病（人的色盲、糖尿病、白化病等）都是突变性状，是由基因突
变造成
基因突变-传统检测技术
•荧光共振能量传递为基础的检测方法Taqman探针
分子信标(Molecular Beacon)
FRET（Hybprobe)
•分子杂交
寡核苷酸连接分析（OLA）
动态等位基因特异杂交（DASH）•PCR技术与其它方法结合
变性-高效液相色谱（DHPLC）
测序
芯片
基因突变-HRM检测原理
•在一定温度范围内将PCR扩增产物进行变性并实时检测荧光信号,荧光值随温度变化即熔解曲线•每一段DNA都有其独特序列，因而也有其独特的熔解曲线形状，如同DNA指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性
•KRAS基因（K-ras,p21）检测是目前医生了解大肠癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法，通过检测不仅可以深入了解癌基因的情况，更重要的是筛选出针对抗表皮生长因子受体靶向药物治疗有效的大肠癌患者，帮助医生选择对肿瘤病人最有效的治疗方法
KRAS
Emma Borràs et al., BMC Cancer 2011, 11:406
•MYH基因相关性息肉病(MAP)归属于家族性腺瘤性息肉病(FAP),是一种与MYH基因突变有关的常染色体隐性遗传病。
MAP以多发性结直肠腺瘤性息肉和高危险性的结直肠癌为主要临床特点,因此早期诊断和及早防治,对于结直肠癌的早期发现及预防具有重要意义。
•确诊为MAP的患者可进行外科手术治疗、结肠镜下切除息肉或药物治疗
MUTYH-associated polyposis (MAP)
Isabel López-Villar et al., BMC Cancer. 2010; 10: 408
•CHEK2是一个重要的乳腺癌易感基因。
同时，CHEK2基因突变与乳腺癌患者的病理特征及预后有一定关系。
•对CHEK2基因突变的检测可能对乳腺癌的治疗具有一定的指导作用
Nguyen-Dumont et al. BMC Medical Genomics 2011, 4:39
DNA甲基化-HRM检测
•DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一，它可以在转录水平抑制基因的表达。
具体的过程是在胞嘧啶－鸟嘧啶（CpG二核苷酸）的5位碳原子上添加了一个额外的甲基团，形成5－甲基胞嘧啶。
CpG二核苷酸密度较高的区域在人体基因组中呈非随机分布于，优先分布于基因的启动子区，并被称为CpG岛
•启动子超甲基化可导致有关肿瘤演进的重要基因再次沉默，例如那些有关DNA修复、细胞周期调控和凋亡的基因。
因此，可以认为DNA甲基化与肿瘤的发生密切相关
DNA甲基化-HRM检测原理
•重亚硫酸盐处理DNA模板可以使胞嘧啶转化为尿嘧啶，而5－甲基胞嘧啶保持不变，随后通过PCR扩增
•在饱和的DNA结合染料存在的情况下进行
PCR反应，在扩增后进行高分辨熔解曲线分析，HRM分析的特点为可以区分扩增产物中少至1个碱基变化的序列差异，从而通过尿嘧啶/胞嘧啶的差异判断扩增子来源于甲基化还是非甲基化的初始模板变异体
Heterogeneous DNA methylation
Ida L.M. Candiloro, Thomas Mikeska，and Alexander Dobrovic，Epigenetics 6:4; 500-507; April 2011
•单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs），指单个核苷酸碱基的改变，包括置换、颠换、缺失和插入，导致的核酸序列的多态性
•在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，就是SNP。
•SNP在人类基因组中数量较多，发生频率较高，被认为是继微卫星之后的新一代遗传学标记。
•SNPs作为第三代遗传标记（已知性、可遗传性、可检测性），用于疾病基因的定位、克隆和鉴定
•SNP可直接影响个体间对疾病的易感性、外源物质的代谢差异和药物不良反应表现因此对SNP的研究在个体化用药、个体化治疗中具有重要的指导作用
SNP-检测方法
•单链构象多态性（SSCP）分析•变性梯度凝胶电泳法（DGGE）•变性高效液相色谱分析（DHPLC）•Taqman探针
•基因芯片
•DNA测序
SNP-检测
理想的检测SNPs的方法
——发现未知的SNPs，或检测已知的SNPs
(1) 灵敏度和准确度的要求
(2) 快速、简便、高通量
(3) 费用相对低廉
•在一定温度范围内将PCR扩增产物进行变性并实时检测荧光信号，荧光值随温度变化即熔解曲线
•每一段DNA都有其独特序列，因而也有其独特的熔解曲线形状，如同DNA指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性
•根据曲线可以准确区分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子
•作为新一代的遗传扫描工具，HRM技术是一种低成本、高通量、快速，且不受位点局限的检测方法，是SNP筛查的最佳选择
SNP-HRM检测
Maria Eralil, Karl V. Voelkerding, Carl T. Wittwer, Exp
Mol Pathol. 2008 August; 85(1):50-58
•肥厚型心肌病（Hypertrophic cardiomyopathy, HCM）
•常染色体显性遗传
•患病率1:500
•年轻群体猝死的常见病因之一
Hypertrophic cardiomyopathy
Centro de Metabolismo e Endocrinologia et al. Rev Port Cardiol 2011; 30 (01): 7-18
物种鉴定-HRM检测
Vezenegho, S. B., C. Bass, et al. (2009). "Development of multiplex real-time PCR assays for identification of members of the Anopheles funestus species group." Malar J 8: 282
HRM仪器
•Light Cycler 480 (Roche)•Roter-Gene 6000 (Qiagen)•7500 Fast/7900HT Fast (ABI)•Light Scanner (Idaho)•FTC-3000H (Funglyn)
HRM实验要求
•饱和染料：LC-Green,Eva-Green,Super Green
•温度:升温和信号采集，温度均一性
谢谢！。