第七章 萃取-双水相萃取
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双水相萃取解析
➢ 一般采用室温操作： 成相系统聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋 白质不会发生变性； 常温下溶液粘度较低， 容易相分离； 常温操作节省冷却费用。
4.双水相萃取技术的发展
（1）历史：
➢ 早在1896年，Beijerinck发现，当明胶与琼脂或明胶与 可溶性淀粉溶液相混时，得到一个混浊不透明的溶液，随 之分为两相，上相富含明胶，下相富含琼脂（或淀粉）， 这种现象被称为聚合物的不相溶性（incompatibility）； ➢ 20世纪60年代，瑞典Lund大学的Albertsson P A及同事 最先提出了双水相萃取技术； ➢ 1979年，西德的Kula M R等人首次将ATPE应用于生物产 品分离；
➢大量研究表明：生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统 间的各种相互作用，主要有静电作用、疏水作用和亲和作用等， 其分配系数可为各种相互作用之和。
ln m ln me ln mh ln ml
①静电作用：两相系统中若有带电溶质存在，会ห้องสมุดไป่ตู้大分子在两 相间的分配系数产生影响。（图5-15） Donnan Potential:当大分子或粒子带有静电荷时，在带有电荷 分配不相等时，就会在两相间产生电位差，称为道南电位。 ②疏水作用：某些大分子物质表面具有疏水区，溶质的表面疏 水性会对其在两相间的分配系数产生影响。
3.影响双水相分配的主要因素
高聚物的相对分子质量 高聚物的浓度 盐的种类和浓度 PH值 温度
（1）高聚物的相对分子质量：
➢在高聚物浓度保持不变的前提下，降低该高聚物的相对分子质 量，被分配的可溶性生物大分子如蛋白质或核酸，或颗粒如细 胞或细胞碎片和细胞器，将更多地分配于该相。
以PEG-Dextran体系为例，↓Dextran→K↓ ↓PEG→K↑（表5-4）
7双水相
这是因为成相聚合物的 疏水性对酶等亲水性物质的 分配产生较大的影响。
二、体系中无机盐离子的影响
无机盐离子在两相中也有不同的分配，因此在两相间形 成电位差。由于各相要保持电中性，使得带电生物大分子， 如蛋白质和核酸等分别向两相移动分配。
水相pH6.9时, （碱性） 溶菌酶带正电荷 （酸性） 卵蛋白带负电荷
双水相在细胞碎片分离中的应用：
细胞碎片的分布行为图
双水相组分表：
从图中可以看出，随着液相中无机盐浓度的 增加，细胞逐渐由下层向上层分配；先进入双 水相，最后完全进入上相。
从清除细胞碎片的角度考虑，在刚形成双水 相时细胞碎片的沉淀最完全，上清液最清，也 最有利于离心分离。
思考题： 1、双水相是怎样形成的？ 2、图7-2中，T、B各表示什么，BM、TM表示什么？ 3、结合图7-10、7-11，说明为什么细胞浓度对分配系
顺便提一下： 菌体细胞一般带负电荷，
指的是：中性水。但在 pH < 4.0以下，则带正电荷。
关键是要了解它的pI。
3、体系pH的影响
pH会影响蛋白质中可离 解基团的离解度，因而改变 蛋白质所带电荷和分配系数； 另外，pH还影响系统缓冲物 质磷酸盐的离解程度，影响 相间电位差，从而影响分配 系数。
根据这一原则测定蛋白质 等电点pI的方法，称为交错 分配法
当正负电荷完全中和时，即形成沉淀。 （5区）
（二）、双水相体系的相体积比：
对萃取分离体系而言，相体积比是影响萃取分 离效率的重要因素，正、负离子表面活性剂的配 比及总浓度对双水相体积比有很大影响：
1、正、负离子表面活性剂配比对相体积比的影响：
固定表面活性剂的总浓度为0.18mol/L，从图中 可看出，在能够形成双水相的两个浓度区间，随 着CTAB配比的增加，上相体积呈增加的趋势。这 主要是由于CTAB的极性较大，能够争夺更多的水 分子。
二、体系中无机盐离子的影响
无机盐离子在两相中也有不同的分配，因此在两相间形 成电位差。由于各相要保持电中性，使得带电生物大分子， 如蛋白质和核酸等分别向两相移动分配。
水相pH6.9时, （碱性） 溶菌酶带正电荷 （酸性） 卵蛋白带负电荷
双水相在细胞碎片分离中的应用：
细胞碎片的分布行为图
双水相组分表：
从图中可以看出，随着液相中无机盐浓度的 增加，细胞逐渐由下层向上层分配；先进入双 水相，最后完全进入上相。
从清除细胞碎片的角度考虑，在刚形成双水 相时细胞碎片的沉淀最完全，上清液最清，也 最有利于离心分离。
思考题： 1、双水相是怎样形成的？ 2、图7-2中，T、B各表示什么，BM、TM表示什么？ 3、结合图7-10、7-11，说明为什么细胞浓度对分配系
顺便提一下： 菌体细胞一般带负电荷，
指的是：中性水。但在 pH < 4.0以下，则带正电荷。
关键是要了解它的pI。
3、体系pH的影响
pH会影响蛋白质中可离 解基团的离解度，因而改变 蛋白质所带电荷和分配系数； 另外，pH还影响系统缓冲物 质磷酸盐的离解程度，影响 相间电位差，从而影响分配 系数。
根据这一原则测定蛋白质 等电点pI的方法，称为交错 分配法
当正负电荷完全中和时，即形成沉淀。 （5区）
（二）、双水相体系的相体积比：
对萃取分离体系而言，相体积比是影响萃取分 离效率的重要因素，正、负离子表面活性剂的配 比及总浓度对双水相体积比有很大影响：
1、正、负离子表面活性剂配比对相体积比的影响：
固定表面活性剂的总浓度为0.18mol/L，从图中 可看出，在能够形成双水相的两个浓度区间，随 着CTAB配比的增加，上相体积呈增加的趋势。这 主要是由于CTAB的极性较大，能够争夺更多的水 分子。
5.7双水相萃取
酵母菌存在下
肺炎克雷氏菌存在下
图5 细胞物质浓度对酶分配的影响
3、盐和缓冲液的影响
水溶液中存在的离子会影响溶质在两 相间的分配。因为阴阳离子的不均匀分配 会产生相界面电位，影响蛋白质、核酸等 荷电大分子的分配。通常增加盐浓度可提 高酶的分配系数。
图6 聚乙二醇4000/硫酸铵系统中，支链淀 粉酶的分配系数与硫酸铵总浓度的关系
葡聚糖本质上是一种几乎不能形成偶 极现象的球形分子，而PEG是一种具有共 享电子对的高密度直链聚合物。各个聚合 物分子都倾向于在其周围有相同形状、大 小和极性的分子，同时，由于不同类型分 子间的斥力大于同它们的亲水性有关的相 互吸引力，因此聚合物发生分离，形成二 个不同的相，这就是所谓的“聚合物不相 溶性”。
层析技术可分离蛋白质、核酸以及细胞混
合物。
食品工业中用来从酸水解产物中提取风味
物质：
二肽、氨基酸、核苷酸等
八、双水相萃取的工艺流程
目的产物的萃取
PEG的循环
无机盐的循环
连续错流萃取回收酶的流程图
九、成相聚合物的回收
膜处理
沉淀
离子交换和吸附
电泳或亲和分配和双水相萃取相结合
蛋白质分配在盐相：盐可用错流操作方式
系统聚合物组成
系统物化性质
盐及缓冲液 温度
1、双水相中聚合物组成的影响 当两种不同聚合物的溶液混合时，可能存 在三种情况：
完全混溶性（匀相溶液）； 物理的不相溶性（相分离）； 复杂的凝聚（相分离）。
eg. 离子和非离子型聚合物都可使用在双水 相系统的构成上，但当这两种聚合物是离 子化合物并带有相反电荷时，它们相互吸 引并发生复杂的凝聚。
细胞色素 牛血清蛋白
乳酸脱氢酶 过氧化氢酶
双水相萃取(精选双水相萃取PPT,超级有用)
基本流程
3.2.1 目的产物的萃取
原料匀浆液与PEG和无机盐在萃取器中混合，然 后进入分离器分相。 通过选择合适的双水相组成，一般使目标蛋白质 分配到上相（PEG相），而细胞碎片、核酸、多 糖和杂蛋白等分配到下相（富盐相）。 第二步萃取是将目标蛋白质转入富盐相，方法是 在上相中加入盐，形成新的双水相体系，从而将 蛋白质与PEG分离，以利于使用超滤或透析将 PEG回收利用和目的产物进一步加工处理。
K= ct/ cb
其中ct 、cb 分别代表溶质在上相、下相中的浓度
基本原理
系统固定时, 分配系数为一常数, 与 溶质的浓度无关。当目标物质进入双水 相体系后, 在上相和下相间进行选择性 分配, 这种分配关系与常规的萃取分配 关系相比, 表现出更大或更小的分配系 数。如各种类型的细胞粒子、噬菌体的 分配系数都大于100或者小于0101, 因此 为物质分离提供了可能[7]。
[7] 严希康,俞俊棠. 生化分离工程[M]. 北京: 化学工业出版社, 2001.1692187.
三、双水相萃系分类
双水相体系主要有以下几种： （1）高聚物/高聚物双水相体系 （2）高聚物/无机盐双水相体系 （3）低分子有机物/无机盐双水相体系 （4）表面活性剂双水相体系
发展历程 Kula教授研究小组对双水相的应用，工艺流程、 操作参数、工程设备、成本分析等进行了大量研 究，在应用上获得成功。1978年首先将双水相萃 取技术用于酶的大规模分离纯化，建成了一套工 业装置，达到20Kg/h的处理能力，分离纯化了几 十种酶，也应用于基因工程产品的分离[3,4]。 双水相萃取可分离多肽，蛋白质、酶、核酸、病 毒、细胞、细胞器、细胞组织、以及重金属离子 等，近年来，还应用于一些小分子，如抗生素， 氨基酸和植物的有效成分等的分离纯化。
第七章双水相解析
F——法拉第常数 T——温度
进一步可证明： ZiF(U2-U1) RT
InKi*= InKi+
Ki*——i组分带电时在体系中的分配系数 Ki——i组分不带电时在体系中的分配系数 Zi——i组分的离子价
意义：
A 荷电溶质的分配系数的对数与 溶质的净电荷数成正比. B 由于同一双水相系统中添加不 同的盐产生的不同,故k与Zi的 关系因盐而异。
盐离子在两相中有不同的分配，因而在两相间形成电位差，由 于各相要保持电中性，因此对于带电荷的蛋白质等物质的萃取 来说 ,盐的存在就会使系统的电荷状态改变 ,从而对分配产生显 著影响。 （P137） 盐的种类对双水相萃取也有一定的影响 ,因此变换盐的种类和 添加其他种类的盐有助于提高选择性。 在不同的双水相体系中盐的作用也不相同。在 PEG/磷酸盐 /水 中加入氯化钠可以使万古霉素的分配系数由 4提高到 1 2 0 ,而 在 PEG/DeX/水体系中只从 1 . 55提高到 5。
同种类的盐时，由于相间电 位不同， lnk–pH 关系曲线也 不一样。但在 pI 处， k 应相 同，即两条关系曲线交于一 点。所以 , 通过测定不同盐 类存在下 lnk–pH曲线的交点 , 可测定蛋白质 / 细胞器以及 微粒的pI。
血清蛋白
(4)体系温度的影响
一般地，临界点附近，温度对分配率的影响较大，远离临界 点时，影响较小。 大规模操作一般在室温下进行,不需冷却。这是基于： (1) 成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用,常温下蛋白质 不会发生变性; (2) 常温下溶液粘度较低,容易相分离; (3) 常温操作节省冷却费用。
(5)体系中微生物的影响。
1）表面自由能的影响
λ=γp2－ γp1
7双水相
结论：正、负离子表面活性剂在水溶液中能形成 双水相体系，缺点是双水相区域较狭窄，正、负 离子的配比有较严格的要求。
双水相在细胞碎片分离中的应用：
细胞碎片的分布行为图 双水相组分表： 从图中可以看出，随着液相中无机盐浓度的 增加，细胞逐渐由下层向上层分配；先进入双 水相，最后完全进入上相。 从清除细胞碎片的角度考虑，在刚形成双水 相时细胞碎片的沉淀最完全，上清液最清，也 最有利于离心分离。
一些水溶性有机溶剂和无机盐能够形成双水相， 但是，有些双水相体系和有机溶剂萃取一样，仍然 很容易使生物活性物质失活。
研究表明，正、负离子表面活性剂在特定的浓度区域也
会形成双水相。这种双水相具有三个特点： （1）两相中表面活性剂浓度很稀，为生物活性物质的分离提 供了良好的分离环境。 （2）由于表面活性剂的加入，使体系的表面张力更低，物质 传递速率更快，萃取可在短时间内完成。 （3）表面活性剂来源广，价格便宜。
称为
道南电位
U 2 U1 RT (Z Z )F
_
ln
K BZ K AZ
当KAZ＋ ≠ KBZ-时，U2 - U1 ≠ 0
ln K i* ln K i
Ki* 带电荷
Z i F (U 2 U1 ) RT
U2 U1 2相和1相电位 Z 盐的离子价 KB KA 盐离子分配系数 Ki i 组分分配系数 F 法拉第常数
VT VB
=
BM MT
下标表示： T：上相 B：下相
双节线的位置和形状 与聚合物的分子量有关。
聚合物Dex的分子量 越高，相分离所需的浓度 越低。 两种聚合物分子量相 差越大，双节线的形状越 不对称。
三、物质在两相中的分配
和溶剂萃取法一样，物质在两水相 中的分配用分配系数 K 表示。
第七章 双水相萃取技术
双水相萃取
双水相萃取：利用 物质在互不相溶的 两水相之间分配系 数的差异，进行萃 取的方法。
第一节 双水相分离理论
一、双水相的形成
当两种聚合物混合时，究竟是否分层或混合成一相， 取决于两种因素：
体系熵的增加：与分子数量有关，与分子大小无关。
分子间作用力：主要表现为分子中各个基团间的相互 作用力。分子量越大，分子间的作用力也越大。 对于大分子间的混合，分子间作用力决定是否分层。
双水相萃取技术的应用
要成功地运用双水相萃取方法，应满足一些要求：
（1）欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的相中；
（2）酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比 时，经过一次萃取，就能得到较高的收率； （3）两相用离心机很容易分离。
胞内酶连续双水相萃取工艺流程
第三节 双水相萃取技术的发展
lnK = -ΔE/(kT) 式中：ΔE — 溶质从相2转移到相1所需的功
k — 波尔兹曼常数(J/K)
T — 温度(K)
表面自由能的影响
lnK = -ΔE/(kT)
假设溶质分子或粒子为球形，它在两相中的表面 能分别为：4πR2γS1、4πR2γS2 ΔE = 4πR2γS1- 4πR2γS2 = 4πR2(γS1-γS2) 式中：R — 溶质分子或粒子半径 γS1 、γS2 — 溶质与相1间、相2间的表面张力 lnK = -4πR2(γS1-γS2)/(kT)
分配系数与pH的关系
影响分配平衡的参数
— 温度
影响分配平衡的参数
— 微生物
对于同一种双水相 体系，微生物影响 体系上下相的比例 以及胞内蛋白在体 系的分配系数。
双水相萃取详细资料(ppt 44页)
两种亲水性聚合物混合
1 混合熵的增加 —自发进行—分子的数目 2 分子间作用力 —分子间各基团相互作用之
和——分子的大小 • 对大分子而言，由于相对分子质量较大，
分子间作用力与熵增加相比占主导地位。
➢ 作用力为斥力：形成两个水相，两种高聚物分 别富集于上、下两相。
➢ 作用力为引力：也形成两个水相，但两种高聚 物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。
A、双水相体系同生物转化相结合：
B、双水相萃取同膜分离技术相结合： C、双水相萃取同亲和层析相结合——亲和
萃取（亲和分配）：
亲和分
配 蛋白质在两水相系统中的分配系数一般不是很大，为了提高分
配系数和萃取效率，可将亲和层析与两水相萃取结合起来，成 为亲和萃取或亲和分配，即把一种配基与一种成相聚合物以共 价相结合，使该配基随成相聚合物分配在某一相中。配基可也 是酶的底物，抑制剂，抗体，受体或染料等，对目标蛋白质有 很强的生物亲和力，因而使后者倾向于分配在配基—聚合物的 相中。 通常选择在PEG上接上配基，当配基—PEG的浓度增加时，蛋 白质的分配系数也增加。当蛋白质的结合位点都为配基所占据 时，即达到饱和，蛋白质的分配系数达到极大值。
结论：加入适当的 盐类，会大大促进 带相反电荷的生物 大分子的分离。
pH
pH值对分配的影响源于两个方面的原因： （一）pH值会影响蛋白质中可以解离基团
的解离度，因而改变蛋白质所带的电荷和 分配系数。
lnKlnK0R FT Z
（二）pH值会影响磷酸盐的解离程度， 改变H2PO4-和HPO42-之间的比例， 而影响分配系数。
• 操作简便，经济省时，易于放大.由于很容易达到 平衡，用商业上的离心机能使相分离完全，分配 系数的值重演性很好，故可直接放大
1 混合熵的增加 —自发进行—分子的数目 2 分子间作用力 —分子间各基团相互作用之
和——分子的大小 • 对大分子而言，由于相对分子质量较大，
分子间作用力与熵增加相比占主导地位。
➢ 作用力为斥力：形成两个水相，两种高聚物分 别富集于上、下两相。
➢ 作用力为引力：也形成两个水相，但两种高聚 物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。
A、双水相体系同生物转化相结合：
B、双水相萃取同膜分离技术相结合： C、双水相萃取同亲和层析相结合——亲和
萃取（亲和分配）：
亲和分
配 蛋白质在两水相系统中的分配系数一般不是很大，为了提高分
配系数和萃取效率，可将亲和层析与两水相萃取结合起来，成 为亲和萃取或亲和分配，即把一种配基与一种成相聚合物以共 价相结合，使该配基随成相聚合物分配在某一相中。配基可也 是酶的底物，抑制剂，抗体，受体或染料等，对目标蛋白质有 很强的生物亲和力，因而使后者倾向于分配在配基—聚合物的 相中。 通常选择在PEG上接上配基，当配基—PEG的浓度增加时，蛋 白质的分配系数也增加。当蛋白质的结合位点都为配基所占据 时，即达到饱和，蛋白质的分配系数达到极大值。
结论：加入适当的 盐类，会大大促进 带相反电荷的生物 大分子的分离。
pH
pH值对分配的影响源于两个方面的原因： （一）pH值会影响蛋白质中可以解离基团
的解离度，因而改变蛋白质所带的电荷和 分配系数。
lnKlnK0R FT Z
（二）pH值会影响磷酸盐的解离程度， 改变H2PO4-和HPO42-之间的比例， 而影响分配系数。
• 操作简便，经济省时，易于放大.由于很容易达到 平衡，用商业上的离心机能使相分离完全，分配 系数的值重演性很好，故可直接放大
生物分离工程 第7章-萃取1
浸取的影响因素
1．相平衡 浸取过程中的相平衡用分配系数KD表示 KD ＝y / x
y——达到平衡时溶质在液相中的浓度 x——平衡时溶质在固相中的浓度 2．溶剂的选择
KD大且对目的物质的选择性高，溶剂的价格应低廉，无腐蚀性， 无毒，闪点高，无爆炸性，产品中易去除,容易回收。 3．增溶作用
原先不溶或难溶性的生物大分子物质向可溶性的、分子量较小的 生物物质转变，但不能过度。也有向不溶性转变的。 4．固体原料的预处理： 如粉碎、干燥等。
适用于脂肪酸、植物碱、醚类、 酮类、甘油酯、芳香成分等物质 的萃取分离。
第一节 液-固萃取
液-固萃取又叫浸取或浸出，是将固相物质萃 取到溶剂相中，在许多行业中得到应用。
产物
咖啡 果汁 药酒 大豆蛋白表2 浸取的应用举例 Nhomakorabea固体
溶质
粗烤咖啡 水果
中药材 豆粉
咖啡溶质 果汁
药用成分 蛋白质
溶剂
水 水 酒 NaOH溶液
萃取洗涤反萃取萃取剂稀释剂料液待分离物质杂质萃取液待分离物质少量杂质洗涤剂萃残液杂质杂质少量待萃物质产物待萃物质待返回使用萃取剂稀释剂反萃剂待萃物质溶剂萃取的操作流程废水溶剂溶质水溶质溶剂溶质溶剂废水蒸汽液液萃取过程图萃取器溶剂溶质塔汽提塔冷凝器分离器热交换器萃取过程具有选择性
第七章 萃取 （Extraction）
11、可加入机介面触控书面，直接在中央控制室操控。 12、配合振动过滤，液渣分离及过滤效果非常好。 13、自动排液（第一次萃取）排料（第二次萃取）。 14、排出的药渣可经过挤压机，将残留的萃取液在挤出。 15、挤压后的药渣可经输送带输送至室外。 16、工作环境，温度较低及干净。 17、完全密闭合乎安全卫生要求。 18、附冷凝器，可在大气压力下完全密闭操作，使香气及酒
生物分离工程工艺原理6
• 2.温度的影响 • 不同温度条件下，制得的相图略有 差别。在临界点附近温度对两相系 统的形成比较敏感。 • 3.时间的影响 • 两相的形成需要有一定的时间。 • 4.低分子物质能调节系统的平衡。
• • • •
五、影响分配的因素 1.盐类的影响 （1）种类 加入适当的盐类,会大大促进带相反电荷的 两种蛋白质的分离。 • （2）浓度 • 当盐类浓度很大时（1-5M，NaCl），则由 于盐析作用，蛋白质易分配于上相，logK几 乎随NaCl浓度增大，而线性地增大。 • 2.聚合物的影响
• 二、双水相萃取技术同其他分离技术结 合，提高分离效率。 • 1.双水相体系同生物转化相结合 • 可解决在许多生物转化中存在的两个问 题： • （1）是由于双水相体系对菌体及酶没 有毒性，同时又可将产物萃入上相，所 以可消除产物抑制效应； • （2）是使分布在下相的细胞（酶）循 环使用从而为固定化细胞及酶的应用开 辟了新路。 • 2.双水相萃取同膜分离技术结合 • 3.双水相萃取同亲和层析相结合-亲和 双水相
• 第一节 双水相分离理论 • 一、双水相的形成 • 当两种聚合物溶液互相混合时，究竟是否 分层或混合成一相，决定于两种因素：
• 一为体系熵的增加；另一为分子间作 用力。两种物质混合时熵的增加与涉 及的分子数目有关。因而，如以摩尔 计算，则小分子间与大分子间的混合， 熵的增加是相同的。但分子间的作用 力，可看作分子中各基团间相互作用 力之和，分子越大，当然作用力也越 大。因此，对大分子而言，如以摩尔 为单位，则分子间的作用力与分子间 的混合熵相比占主要地位，因而主要 由前者决定混合的结果。 •
Separation engineering of Biotechnology
E-mail: 刘树中 Liushuzhong@
双水相萃取
操作步骤
一、重点 双水相萃取放大容易：一般10ml离心管的实验结果可直接放大到工业规模。具体实验步骤： 1、配制一系列不同浓度、pH及离子强度的双水相，每个双水相改变一个参数。 2、加入料液，再加水使整个系统质量达到5~10g。离心管封口后充分混合。 3、1800－2000g下离心3－5min，使两相完全分离。 4、用吸管或移液管将上相和下相分别吸出，测定上、下相中目标产物的浓度或生物活性，计算分配系数。 5、上、下两相中目标产物的总量应与加入量对比，以检验是否存在沉淀或界面吸附现象，并可确认浓度或活 性测定中产生的系统误差。 6、分析目标产物的收率和纯化倍数，确定最佳双水相系统。 二、特点： 1、含水量高（70%～90%），适宜提取水溶性的蛋白质、酶等生物活性物质，且不易引起蛋白质的变性失活。 2、不存在有机溶剂残留问题。3、易于放大，各种参数可按比例放大而产物收率并不降低。
可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）,聚丙二醇/聚乙二醇，甲基纤维素/ 葡聚糖。双水相萃取中采用的双聚合物系统是PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。另外，聚合物与 无机盐的混合溶液也可以形成双水相，例如，PEG/磷酸钾（KPi）、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于双水相萃 取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG,下相富含无机盐。
原理
某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成 双水相系统（aqueous two-phase system,ATPS）。利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质， Albertsson于20世纪50年代后期开发了双水相萃取法（aqueous two-phase extraction），又称双水相分配法。 20世纪70年代,科学家又发展了双水相萃取在生物分离过程中的应用，为蛋白质特别是胞内蛋白质的分离和纯化 开辟了新的途径。
双水相萃取全解
双水相体系的双结线模型
a 系线 两相区
双节线 均相区
b
双节线 均相区
两相区 系线
临界点
二、双水相萃取工艺流程操作
工艺流程主要由三部分组成：
• 目标产物的萃取 • 聚合物（PEG)的循环 • 无机盐的循环
双水相萃取工艺流程图
萃取液 相似相溶原理
上相
PEG
ATPE
无机盐
相体系回收示意图
PEG的循环
2）聚合物及其相对分子质量
不同聚合物的水相系统，疏水性不同； 同一聚合物，疏水性随分子量增加而增加， 其大小的选择取决于萃取过程的目的和方 法，在PEG/Dex体系中，PEG分子量的 减少，会使萃取液在两相中的分配系数增 大，当PEG的分子量增加时，在质量浓度 不变的情况下，亲水性蛋白质不再向富含 PEG相中聚集而转向另一相。
R=Vt／Vb，K=Ct／Cb，G=1/RK， Y=（1+1／RK）-1 ×100％
式中：R－相比；Vb－下相体积，mL；
Vt－上相体积，mL； K－分配系数； Cb－下相溶质的质量浓度，g／mL； Ct －上相溶质的质量浓度，g／mL； G－上、下相溶质的质量比； Y－萃取率，％。
(3) 双水相相图制作
综合利用以上因素，可通过实验确定最佳双 水相萃取系统。以PEG/硫酸铵双水相体系萃取 一种蛋白质为例： （1）固定硫酸铵为某一浓度，用梯度浓度的 聚乙二椁与其形成一系列双水相体系，萃取分 离蛋白质，分别测量上、下相蛋白质的含量， 确定PEG的最佳浓度。 （2）选取（1）中的最佳PEG浓度，在此浓度 下与梯度浓度的硫酸铵形成双水相体系，进行 蛋白质的萃取分离，测定上、下相中蛋白质的 含量，确定出最佳的硫酸铵浓度。
双水相体系的双结线模型
双水相萃取法
非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影响，利用相平衡 热力学理论可推导下述分配系数表达式：
lnm=-Mλ/RT
m-分配系数；M-溶质的相对分子质量；λ-与溶质表面性质和 成相系统有关的常数; R-气体常数，J/(mo1．K)；T-绝对温度， K。
因此，溶质的分配系数的对数与相对分子质量之 间呈线性关系，在同一个双水相系统中，若λ>0，不 同溶质的分配系数随相对分子质量的增大而减小。同 一溶质的分配系数随双水相系统的不同而改变，这是 因为式中的λ随双水相系统而异。
图a和b分别为PEG/Dx和PEG/KPi系统的典型相图 a
系线 两相区 双节线 双节线
b
两相区 系线
均相区
均相区
均相区
临界点
在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而 体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即
上下相组成分别为T和B,
系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长， 两相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时， 即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中的 分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。
在生物分子回收和纯化以后，怎样从含有目标产物残余物的 水溶液中回收聚合物或盐就成为一个重要的问题。例如从 1000kg面包酵母中萃取反丁烯二酸酶需要用680kgPEG-1550和 533kgK3PO4，若不回收利用，化学品的消耗会使生产成本大幅 度上升。如果产品是蛋白质，并且分配在盐相，则盐可以在 错流过程操作方法下，用超滤或渗析膜过滤回收。如果蛋白 质积聚在聚乙二酵中，可以通过加入盐来精制，加入的盐导 致蛋白质在盐相中重新分配。PEG的分离同样可以用膜分离来 实现，即用选择性孔径大小的半透膜来截留蛋白质，同时排 除PEG进行回收。 另一种力法是通过盐析或使用水-可混溶性 的溶剂来沉淀蛋白质，但是固体(产物)的去除被存在的PEG阻 碍。也可使用离子交换和吸附，它们是通过蛋白质与基质的 选择性相互作用进行的。然而，当黏性聚合物溶液通过柱被 处理的时候，会出现高的压力降。在上述的三种方法中，膜 分离是分离和浓缩被纯化的蛋白质并同步去除聚合物的最佳 方法。
lnm=-Mλ/RT
m-分配系数；M-溶质的相对分子质量；λ-与溶质表面性质和 成相系统有关的常数; R-气体常数，J/(mo1．K)；T-绝对温度， K。
因此，溶质的分配系数的对数与相对分子质量之 间呈线性关系，在同一个双水相系统中，若λ>0，不 同溶质的分配系数随相对分子质量的增大而减小。同 一溶质的分配系数随双水相系统的不同而改变，这是 因为式中的λ随双水相系统而异。
图a和b分别为PEG/Dx和PEG/KPi系统的典型相图 a
系线 两相区 双节线 双节线
b
两相区 系线
均相区
均相区
均相区
临界点
在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而 体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即
上下相组成分别为T和B,
系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长， 两相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时， 即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中的 分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。
在生物分子回收和纯化以后，怎样从含有目标产物残余物的 水溶液中回收聚合物或盐就成为一个重要的问题。例如从 1000kg面包酵母中萃取反丁烯二酸酶需要用680kgPEG-1550和 533kgK3PO4，若不回收利用，化学品的消耗会使生产成本大幅 度上升。如果产品是蛋白质，并且分配在盐相，则盐可以在 错流过程操作方法下，用超滤或渗析膜过滤回收。如果蛋白 质积聚在聚乙二酵中，可以通过加入盐来精制，加入的盐导 致蛋白质在盐相中重新分配。PEG的分离同样可以用膜分离来 实现，即用选择性孔径大小的半透膜来截留蛋白质，同时排 除PEG进行回收。 另一种力法是通过盐析或使用水-可混溶性 的溶剂来沉淀蛋白质，但是固体(产物)的去除被存在的PEG阻 碍。也可使用离子交换和吸附，它们是通过蛋白质与基质的 选择性相互作用进行的。然而，当黏性聚合物溶液通过柱被 处理的时候，会出现高的压力降。在上述的三种方法中，膜 分离是分离和浓缩被纯化的蛋白质并同步去除聚合物的最佳 方法。
第七节 双水相萃取法总结
（二）分配系数 影响分配系数的因素包括很多，如粒子大小、 疏水性、表面电荷、粒子或大分子的构象等， 这些因素微小的变化可导致分配系数较大的变 化，因而双水相萃取有较好的选择性。
三、影响双水相萃取的因素
（一）、成相高聚物的分子量
一般原则:对于给定的相系统，如果一种高聚物被低分子量的同种高 聚物所代替，被萃取的大分子物质,如蛋白质、核酸、细胞粒子等，将 有利于在低分子量高聚物一侧分配.
四、影响因素
1、 表面活性剂的种类：早期用一种表面活性剂,现在混合体系的研究较多
2、水相pH值：决定蛋白质表面带电基团的离子化状态,与表面活性剂的头 部基团有相互作用 3、温度：提高温度可使反胶束排斥水,起浓缩作用 4、离子强度：降低带电蛋白与反胶束极性基团的相互作用,并导致高离子 强度下反胶束颗粒变小 5、亲和反胶束萃取：导入亲合配基,提高萃取率和选择性
α-淀粉酶和蛋白酶 用 PEG/(NH4)2SO4 双水相体系 , 经一次萃取从α- 淀粉 酶发酵液中分离提取α-淀粉酶和蛋白酶,萃取最适宜 条件为PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%)pH=8.
红霉素的提取
系统分别为AKM(马来酸酐和环氧乙烷共聚物)/磷酸盐,PEG/磷酸盐和 PEG/葡聚糖,考察了pH和添加中性盐的影响。当pH>6时,AKM/磷酸盐 对红霉素的分配更为有效,当添加中性盐(NaCl、Na2SO4)时,红霉素的 分配系数迅速增大.
双水相萃取技术(two-aqueous phaseextraction) : 利用不同的高分子溶液相互混合可产生两相或多相系 统，静置平衡后，分成互不相溶的两个水相，利用物质在 互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法， 称为双水相萃取法。
双水相萃取
（2）双水相体系形成的原因：
聚合物的不相溶性（空间位阻）
聚合物的不相溶性：各个聚合物分子，都倾向于在其
周围有形状、大小和极性相同的分子，同时，由于不同
类型分子间的斥力大于同它们的亲水性有关的相互吸引 力，因此聚合物发生分离，形成两个不同的相。
对于某些聚合物溶液与一些无机盐溶液相混时，只要
浓度达到一定范围时，体系形成双水相的机理尚不清楚。
这种影响与蛋白质相对分子质量也存在关系，相对分子质量越
大，影响也随之增大。
（2）高聚物的浓度：
成相物质的总浓度越高，蛋白质越容易分配于其中的某一相；
而对于细胞等颗粒来说，在临界点附近细胞大多分配于其中的
某一相。
（3）盐的种类和浓度：
盐的种类和浓度对分配系数的影响，主要反映在相间电位和
蛋白质的疏水性差异上，这是由于当双水相系统中存在这些
加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收 PEG；B)将 PEG
相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去 PEG，再洗出蛋 白质。 无机盐的循环：将含无机盐相冷却，结晶，然后用离 心机分离收集。除此之外还可用电渗析法、膜分离法回
收盐类或除去 PEG相的盐。
（3）双水相萃取在药物分离中的应用
①细胞匀浆液中 蛋白质的纯化
液膜萃取
反胶团萃取
内容提纲：
1.双水相体系 2.双水相萃取的基本原理 3.影响双水相分配的主要因素
4.双水相萃取技术的发展
5.双水相萃取操作及应用
1.双水相体系
（1）双水相系统：一定浓度的两种水溶性高聚物或一
种高聚物与盐类在水中能形成两层互不相溶的匀相水溶液， 这样的水相系统称为双水相系统。
5%PEG6000 上层组成：2%Dextran500 93%水 3%PEG6000 下层组成：7%Dextran500 90%水
第七章-双水相萃取和反胶团萃取
两相分离则比较困难, 这是由于两相密度差低 和当处理匀浆液时, 粘度较大。由于粘度较 高PE会G/引盐更起适阻合塞用重, 力可沉采降用；自PE动G/D排eX渣多的用离喷心嘴机分。 离 机。
2.两水相反应器
在两水相系统中进行转化翻译功能, 如酶促反应, 可 以把产物移入另一相中, 消除产物抑制, 因而提高了产率。 这实际上是一种反应和分离耦合的过程, 有时也称为萃 取生物转化；如果发生的是一种发酵过程, 则也称为萃 取发酵, 因而此时也可以把两水相系统称为两水相反应 器。
在另一相中；要有合适的相比。如产物分配 在上相中，则相比要大，反之则相比要小。
这些条件不可能同时满足, 分配理论也不完 善, 常需要根据试验选择最优系统和操作条件。
三、双水相萃取技术的发展
1. PEG衍生物: 在PEG上引入亲和基团或离 子基团；
2. 采用多级萃取。
反胶团萃取
发展历史
1977 年瑞典伦德大学Albertsson 首先提出 反胶团萃取分离蛋白质 20世纪80年代生物学家们开始认识到反胶团 萃取的重要性 国内自20世纪80年代起也开展了反胶团萃取白质时,用以形成反胶团的 表面活性剂起着关键作用。
现在多数研究者采用AOT(阴离子型)为表面活性 剂。AOT是琥珀酸二(2-乙基己基)酯磺酸钠 或丁二酸二异辛酯磺酸钠(Aerosol OT)。
溶剂则常用异辛烷 (2,2,4-二甲基戊烷)。
2.反胶团的形状和大小
形状: 通常为球形，也有的为椭圆形或棒形。 大小: 半径一般为10nm，取决于反胶团的含水量W0。
➢ 设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问 题。
一、双水相分离理论
1.双水相的形成
❖ 熵增——混合——自发 ❖ 分子间作用力------随着Mr的增加而增大
2.两水相反应器
在两水相系统中进行转化翻译功能, 如酶促反应, 可 以把产物移入另一相中, 消除产物抑制, 因而提高了产率。 这实际上是一种反应和分离耦合的过程, 有时也称为萃 取生物转化；如果发生的是一种发酵过程, 则也称为萃 取发酵, 因而此时也可以把两水相系统称为两水相反应 器。
在另一相中；要有合适的相比。如产物分配 在上相中，则相比要大，反之则相比要小。
这些条件不可能同时满足, 分配理论也不完 善, 常需要根据试验选择最优系统和操作条件。
三、双水相萃取技术的发展
1. PEG衍生物: 在PEG上引入亲和基团或离 子基团；
2. 采用多级萃取。
反胶团萃取
发展历史
1977 年瑞典伦德大学Albertsson 首先提出 反胶团萃取分离蛋白质 20世纪80年代生物学家们开始认识到反胶团 萃取的重要性 国内自20世纪80年代起也开展了反胶团萃取白质时,用以形成反胶团的 表面活性剂起着关键作用。
现在多数研究者采用AOT(阴离子型)为表面活性 剂。AOT是琥珀酸二(2-乙基己基)酯磺酸钠 或丁二酸二异辛酯磺酸钠(Aerosol OT)。
溶剂则常用异辛烷 (2,2,4-二甲基戊烷)。
2.反胶团的形状和大小
形状: 通常为球形，也有的为椭圆形或棒形。 大小: 半径一般为10nm，取决于反胶团的含水量W0。
➢ 设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问 题。
一、双水相分离理论
1.双水相的形成
❖ 熵增——混合——自发 ❖ 分子间作用力------随着Mr的增加而增大
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主要内容
一、概述 二、物质在两相中的分配 三、双水相萃取工艺流程 四、双水相萃取技术的应用 五、思考题
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一、 异）难于进行收集微生物的细胞器、分离除去细胞碎片、 提取和浓缩胞内物质的操作。
萃取已广泛用于液液分离，但一般的有机溶剂萃取难 于分离蛋白质?
② 对胞内蛋白萃取，使碎片分配于下相中， 来增大两相的密度差，达到快速分离，降 低操作成本和操作时间。
③ 根据目标蛋白质和共存杂质的表面疏水性、 相对分子质量、等电点和表面电荷等性质 的差别，来选择萃取目标产物。如调pH、 添加盐、提高成相系统的浓度（系线长度）
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双水相萃取过程放大较容易，一般10mL刻度离 心管内结果即可直接放大到产业化规模。具体的实 验步骤： ①配制一系列不同浓度、pH值及离子强度的双水相， 每个双水相改变一个参数。
②加入料液后，再加水使整个系统的质量达到5-10g。 离心管封口后充分混合。（反复倒置或涡旋混合器）
③在1800-2000g下离心3-5min，分相。
④分别吸出上下相，测定上、下相中目标产物的浓 度或生物活性，计算分配系数。
⑤分析目标产物的收率和纯化倍数，确定最佳双水 相系统。
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2、相平衡与相分离
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3、人生长激素、β-干扰素的提取
用PEG4000 6.6%/磷酸盐14%体系从大肠杆菌 提取。
4、病毒的提取、纯化
5、生物活性物质的分析检测
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何谓双水相萃取？ 在一定条件下，水相可形以成两相。将 水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从 一个水相转移到另一水相的过程。
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2、影响分配的因素
(1)双水相中聚合物（组成和浓度）的影响 分子量的影响
如在PEG/Dex双水相体系中，PEG分子量的减 少，会使蛋白质在两相中的分配系数明显增大。
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（2）体系中无机盐离子的影响
▪ 无机盐离子在两相中的分配不同，会导致两 上中的电位差。
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如图，当pH6.9时，溶菌酶带正电，卵蛋白带负电， 对照上表知，KCl->KNa+，有电位差，U2-U1>0，导 致带正电荷的溶菌酶迁移到1相，其K值增大，而带
▪ 相平衡：双水相系统的表面张力很小， 相间混合所需能量很低，通过机械搅拌 很容易分散成微小液滴，达到相平衡所 需时间很短，一般只需几秒钟。
▪ 相分离：重力沉降（静置分层）或离心 沉降法。
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3、多步萃取
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4、大规模双水相萃取
▪ 双水相放大后，溶质的分配系数和相体积比保持不 变，溶质的浓度随匀浆液的加入量线性增大。
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四、双水相萃取技术的应用
目前广泛应用于蛋白质的分离与纯化。 1、胞内酶提取： 一般是破碎细胞（匀浆液粘度大，碎片很小）—— ▪ 离心分离（能耗大，且碎片不易清除干净） ▪ 双水相萃取（易除去碎片，同时使酶得到精制） 目前应用最多的是PEG/盐体系。
酶主要分配在上相，碎片在下相或界面上，收率 能达到90%；料液中湿细胞浓度可达30%，分配系 数在3-20之间。如下表
负电荷的卵蛋白迁移到2相，其K值减少，两者达到
较好的分离。
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（3）体系pH值的影响
蛋白质的离解度——改变蛋白质的电荷— —改变分配系数。
缓冲物质磷酸盐的离解度——改变电位 差——分配系数。
pH的微小变化会使蛋白质的分配系数改变 2-3个数量级。
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（4）体系温度的影响
温度的变化——分配率——蛋白质的生物活性。
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▪ 例子：以甲酸脱氢酶（FDH）的分步提取纯 化来进一步说明胞内酶的提取。
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2、核酸的分离及纯化
特点：盐组成的微小变化引起分配系数的急
剧变动。 有活性的DNA与无活性的DNA的分配系数差别 较大。 可通过多级逆流分配平衡将两者几乎完全分开。
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/ DEX等）(PEG：polyethylene glycol聚乙二
醇 DEX:葡聚糖）
▪其中一种是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/葡聚 糖DEX）
▪两种都是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/羧甲基 葡聚糖钠）
▪其中一种是无机盐（磷酸盐、硫酸盐等）（ PEG
/硫酸盐）
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二、物质在两相中的分配
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（1）许多蛋白质有极强的亲水性，不溶于有机溶剂；
（2）蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。
在一定条件下，水相也可形成两相甚至多相。将水
溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另
一水相中成为可能。
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4
1、最早的双水相萃取现象:
▪ 1896年Be jerinck，把明胶与琼脂或把明胶 和可溶性淀粉的水溶液混合，可分为两相， 聚合物之间的“不相溶性”。
7
3、双水相体系形成
▪ 聚合物混合时，是分层或成一相，取决 于分子间的作用力：
分子间作用力，与分子量有关，分子 量越大，分间作用力也越大。
分子之间作用力： （1）A-A >A-B 相分离 （2）A-A<A-B 混合 （3）A-B>>A-A 凝聚复合
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4、双水相体系类型
▪两种都是非离子型高聚物（PEG / DEX、聚丙二醇
聚合物的多元醇或多糖结构对蛋白质有 保护作用，增加了蛋白质的稳定性，故可 在室温一操作，且一般温度变化不大。
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（5）体系中微生物的影响 影响：上下相体积、胞内蛋白的分配系数。
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三、双水相萃取工艺流程
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1、双水相系统的选择
① 相系统应易于用静置沉降或离心沉降法进 行分离。
第七章 双水相萃取
萃取
以超临界流
体为萃取剂，
以液体为萃取剂，
含有目标产物原 料为液体
液液萃取
含目标 产物的
液固萃取
含有目标产
超临界 物的原料可
原料为 或浸取 流体萃取 以是液体，
固体
根据萃取剂的种类和形式的不同分为：
也可以是固 体。
有机溶剂萃取 简称溶剂萃取
双水相萃取
液膜萃取 反胶团萃取
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2
多种不相溶的聚 合物可得到多相 体系
原因？
聚合物的空间阻 碍作用，相互间 无法渗透。
聚合物还可以与无机盐可形成聚合物-盐双
水相。
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5
2、优势
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6
(1) 条件温和，保留产物活性 (2) 含水量高，表面张力低，耗能少 (3) 大分子及小分子（红霉素、氨基酸
等）都可萃取 (4) 易于放大
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