第七章 萃取-双水相萃取

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▪ 例子：以甲酸脱氢酶（FDH）的分步提取纯 化来进一步说明胞内酶的提取。
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2、核酸的分离及纯化
特点：盐组成的微小变化引起分配系数的急
剧变动。 有活性的DNA与无活性的DNA的分配系数差别 较大。 可通过多级逆流分配平衡将两者几乎完全分开。
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3、双水相体系形成
▪ 聚合物混合时，是分层或成一相，取决 于分子间的作用力：
分子间作用力，与分子量有关，分子 量越大，分间作用力也越大。
分子之间作用力： （1）A-A >A-B 相分离 （2）A-A<A-B 混合 （3）A-B>>A-A 凝聚复合
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4、双水相体系类型
▪两种都是非离子型高聚物（PEG / DEX、聚丙二醇
第七章 双水相萃取
萃取
以超临界流
体为萃取剂，
以液体为萃取剂，
含有目标产物原 料为液体
液液萃取
含目标 产物的
液固萃取
含有目标产
超临界 物的原料可
原料为 或浸取 流体萃取 以是液体，
固体
根据萃取剂的种类和形式的不同分为：
也可以是固 体。
有机溶剂萃取 简称溶剂萃取
双水相萃取
液膜萃取 反胶团萃取
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聚合物的多元醇或多糖结构对蛋白质有 保护作用，增加了蛋白质的稳定性，故可 在室温一操作，且一般温度变化不大。
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（5）体系中微生物的影响 影响：上下相体积、胞内蛋白的分配系数。
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三、双水相萃取工艺流程
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1、双水相系统的选择
① 相系统应易于用静置沉降或离心沉降法进 行分离。
/ DEX等）(PEG：polyethylene glycol聚乙二
醇 DEX:葡聚糖）
▪其中一种是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/葡聚 糖DEX）
▪两种都是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/羧甲基 葡聚糖钠）
▪其中一种是无机盐（磷酸盐、硫酸盐等）（ PEG
/硫酸盐）
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二、物质在两相中的分配
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（1）许多蛋白质有极强的亲水性，不溶于有机溶剂；
（2）蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。
在一定条件下，水相也可形成两相甚至多相。将水
溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另
一水相中成为可能。
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1、最早的双水相萃取现象:
▪ 1896年Be jerinck，把明胶与琼脂或把明胶 和可溶性淀粉的水溶液混合，可分为两相， 聚合物之间的“不相溶性”。
②加入料液后，再加水使整个系统的质量达到5-10g。 离心管封口后充分混合。（反复倒置或涡旋混合器）
③在1800-2000g下离心3-5min，分相。
④分别吸出上下相，测定上、下相中目标产物的浓 度或生物活性，计算分配系数。
⑤分析目标产物的收率和纯化倍数，确定最佳双水 相系统。
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2、相平衡与相分离
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3、人生长激素、β-干扰素的提取
用PEG4000 6.6%/磷酸盐14%体系从大肠杆菌 提取。
4、病毒的提取、纯化
5、生物活性物质的分析检测
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何谓双水相萃取？ 在一定条件下，水相可形以成两相。将 水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从 一个水相转移到另一水相的过程。
负电荷的卵蛋白迁移到2相，其K值减少，两者达到
较好的分离。
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（3）体系pH值的影响
蛋白质的离解度——改变蛋白质的电荷— —改变分配系数。
缓冲物质磷酸盐的离解度——改变电位 差——分配系数。
pH的微小变化会使蛋白质的分配系数改变 2-3个数量级。
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（4）体系温度的影响
温度的变化——分配率——蛋白质的生物活性。
▪ 相平衡：双水相系统的表面张力很小， 相间混合所需能量很低，通过机械搅拌 很容易分散成微小液滴，达到相平衡所 需时间很短，一般只需几秒钟。
▪ 相分离：重力沉降（静置分层）或离心 沉降法。
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3、多步萃取
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21Hale Waihona Puke Baidu
4、大规模双水相萃取
▪ 双水相放大后，溶质的分配系数和相体积比保持不 变，溶质的浓度随匀浆液的加入量线性增大。
主要内容
一、概述 二、物质在两相中的分配 三、双水相萃取工艺流程 四、双水相萃取技术的应用 五、思考题
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一、概述
过滤和离心技术（取决于分离颗粒的尺寸或密度差 异）难于进行收集微生物的细胞器、分离除去细胞碎片、 提取和浓缩胞内物质的操作。
萃取已广泛用于液液分离，但一般的有机溶剂萃取难 于分离蛋白质?
② 对胞内蛋白萃取，使碎片分配于下相中， 来增大两相的密度差，达到快速分离，降 低操作成本和操作时间。
③ 根据目标蛋白质和共存杂质的表面疏水性、 相对分子质量、等电点和表面电荷等性质 的差别，来选择萃取目标产物。如调pH、 添加盐、提高成相系统的浓度（系线长度）
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双水相萃取过程放大较容易，一般10mL刻度离 心管内结果即可直接放大到产业化规模。具体的实 验步骤： ①配制一系列不同浓度、pH值及离子强度的双水相， 每个双水相改变一个参数。
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四、双水相萃取技术的应用
目前广泛应用于蛋白质的分离与纯化。 1、胞内酶提取： 一般是破碎细胞（匀浆液粘度大，碎片很小）—— ▪ 离心分离（能耗大，且碎片不易清除干净） ▪ 双水相萃取（易除去碎片，同时使酶得到精制） 目前应用最多的是PEG/盐体系。
酶主要分配在上相，碎片在下相或界面上，收率 能达到90%；料液中湿细胞浓度可达30%，分配系 数在3-20之间。如下表
多种不相溶的聚 合物可得到多相 体系
原因？
聚合物的空间阻 碍作用，相互间 无法渗透。
聚合物还可以与无机盐可形成聚合物-盐双
水相。
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2、优势
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(1) 条件温和，保留产物活性 (2) 含水量高，表面张力低，耗能少 (3) 大分子及小分子（红霉素、氨基酸
等）都可萃取 (4) 易于放大
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2、影响分配的因素
(1)双水相中聚合物（组成和浓度）的影响 分子量的影响
如在PEG/Dex双水相体系中，PEG分子量的减 少，会使蛋白质在两相中的分配系数明显增大。
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（2）体系中无机盐离子的影响
▪ 无机盐离子在两相中的分配不同，会导致两 上中的电位差。
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如图，当pH6.9时，溶菌酶带正电，卵蛋白带负电， 对照上表知，KCl->KNa+，有电位差，U2-U1>0，导 致带正电荷的溶菌酶迁移到1相，其K值增大，而带