枯草芽孢杆菌活菌计数方法

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发酵工程实验

发酵⼯程实验发酵⼯程实验 Prepared on 24 November 2020实验⼀酸奶的制作与乳酸菌的活菌计数（5学时）实验⽬的：1、学习并掌握酸奶制作的基本原理与⽅法。

2、了解市售酸奶的⽣产⼯艺。

3、掌握乳酸菌活菌计数⽅法与操作。

实验原理：乳酸菌在乳中⽣长繁殖，发酵分解乳糖产⽣乳酸等有机酸，导致乳的pH值下降，使乳酪蛋⽩在其等电点附近发⽣凝集。

乳酸菌属于兼性厌氧微⽣物，在⽆氧条件下⽣长繁殖较好，实验室条件下利⽤混菌培养的⽅法，尽可能让乳酸菌在⽆氧条件下⽣长，每个单菌落代表⼀个微⽣物细胞。

实验内容：（⼀）酸奶制作1、10%脱脂奶粉溶解于热⽔（80℃左右）中，充分搅拌均匀，配成调制乳；2、添加蔗糖：为了缓和酸奶的酸味，改善酸奶⼝味，在调制乳中加⼈4-8％的蔗糖。

3、灭菌：⽅法有两种：将乳加热⾄90℃，保温5min；4、接种：往冷却到43-45℃灭过菌的乳中加⼊乳酸菌，接种量为2%-5%。

5、分装：酸奶受到振动，乳凝状态易被破坏，因此，不能在发酵罐容器中先发酵然后再进⾏分装，须是将含有乳酸菌的⽜乳培养基先分装到⼩容器中，加盖后送⼊恒温室培养，在⼩容器中发酵制成酸奶。

6、发酵：发酵的温度保持在40-43 ℃，⼀般发酵时间为3-6h。

发酵终点的确定有两种⽅法：1）检测发酵奶的酸度，达到65-70 T°。

2）倾斜观察，瓶内酸奶流动性差，⽽且瓶中部有细微颗粒出现。

7、冷却：发酵结束，将酸奶从发酵室取出，⽤冷风迅速将其冷印到10℃以下，⼀般2 h，使酸奶中的乳酸菌停⽌⽣长，防⽌酸奶酸度过⾼⽽影响⼝感。

8、冷藏和后熟：经冷却处理的酸奶，贮藏在2-5℃的冷藏室中保存。

9、感官指标1）⾊泽：⾊泽均匀⼀致，呈乳⽩⾊，或稍带微黄⾊。

2）组织状态：凝块稠密结实均匀细腻，⽆⽓泡，允许少量乳清析出。

3）⽓味：具有清⾹纯净的乳酸味，⽆酒精发酵味，⽆霉味和其他外来不良⽓味。

（⼆）乳酸菌活菌检测①、检测培养基：蛋⽩胨15g，⽜⾁膏5g，葡萄糖20g，氯化钠5g，碳酸钙10g，琼脂粉20g，⽔1000ml，115～121℃灭菌20min，灭菌后放置⽔浴52℃保温备⽤。

混合型饲料添加剂中枯草芽孢杆菌的检测方法

混合型饲料添加剂中枯草芽孢杆菌的检测方法
混合型饲料添加剂中枯草芽孢杆菌的检测是确保饲料添加剂的质量和安全性的重要环节。

以下是一种常用的检测方法：
1.样品准备：从混合型饲料添加剂中取得适当的样品量，确
保样品代表性。

将样品进行适当处理，如研磨或稀释等，以便后续的分析操作。

2.菌落计数：使用枯草芽孢杆菌特异性培养基（如PYG，
Plate Count Agar等），将样品接种于培养基表面，利用平板计数法进行枯草芽孢杆菌的菌落计数。

3.PCR检测：使用枯草芽孢杆菌的特异性引物和探针进行
PCR（聚合酶链式反应）检测，通过扩增枯草芽孢杆菌的DNA片段来确认其存在。

4.实时荧光定量PCR：使用荧光探针和枯草芽孢杆菌特异性
引物进行实时荧光定量PCR（qPCR），检测和定量枯草芽孢杆菌的DNA，同时可以根据标准曲线计算样品中的枯草芽孢杆菌数量。

5.基因测序：对样品进行基因测序，通过分析样品的DNA
序列来确认枯草芽孢杆菌的存在和鉴定特定菌株的种属。

需要注意的是，枯草芽孢杆菌的检测方法可以根据实际需要进行选择，并结合相关标准和法规要求。

同时，实验室应该有足够的设备和技术来执行这些检测方法，并参考相关的操作指南和质量控制要求，以确保检测的准确性和可靠性。

枯草芽孢杆菌活菌计数方法

枯草芽孢杆菌活菌计数法
1.实验器材
培养箱,超净台,灭菌锅
90mm培养皿,玻璃涂布棒,三角瓶,5ml、1ml、100μl移液枪及枪头,试管架,
试管,无菌水(器具耗材均需提前高温高压灭菌)。

2.实验方法
1)配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
蛋白胨1%
牛肉膏0.3%
氯化钠0.5%
葡萄糖1%
琼脂2%
121℃高压灭菌20分钟。

2)接种
a)将已灭菌的营养琼脂培养基倒入已干灭好的培养皿中,约25mL/90mm培养皿,待凝固后备用。

b)以准确称取检样0.1g(或1.00mL)放入含有100mL无菌水的玻璃三角瓶中,
充分溶解,即配制成1:1000的稀释液。

c)取0.1mL 1:1000的稀释液注入含有9.9mL无菌水离心管中,涡旋混匀,此为10-5的稀释液。

d)按上述操作顺序做10倍递增稀释液,每稀释一次,换用一个1mL无菌吸头,根据对样品菌落生长情况的预实验,选择合适的稀释
度,最终选择10-7,10-8,10-9 三个稀释梯度。

e)吸取0.25mL稀释液于营养琼脂平板上,用涂布器将菌液涂布均匀,每个稀释度做3个平皿,倒置于30℃恒温培养箱中,培养24h 后取出,计算平板内枯草芽孢杆菌总数目,乘以稀释倍数,即得每克试样所含枯草芽孢杆菌总数。

3 计数
计算平板内枯草芽孢杆菌总数目,乘以稀释倍数,即得每克试样所含枯草芽孢杆菌总数。

【doc】枯草芽孢杆菌发酵培养基优化培养实验

枯草芽孢杆菌发酵培养基优化培养实验枯草芽孢杆菌发酵培养基优化培养实验吴俊罡张秉胜刘吉华秦贵江王梅雪张红霞庚涛(大连翔大生物技术研究中心有限公司)摘要本文从生产实际出发,针对生产用菌种,通过对培养基碳源,氮源等的选择及配比的正交实验,得出最适培养基.关键词:枯草芽孢杆菌芽孢率活菌数培养基前言枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一.其已被越来越多地研制成饲用微生态制剂.因其制剂是无毒,无残留,无污染的"绿色"添加剂,故具有广阔的发展前景,并已在畜牧业,饲料行业广泛应用,显示了巨大的社会效益和生态效益.枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白酶,脂肪酶,淀粉酶等活性,能产生抗菌素,在动物肠道内具有较强生物夺氧能力.这些特性对促进动物营养的消化吸收,提高动物的饲料转化率和防病促进生长起到重要作用.现阶段的工业化生产中,常存在着发酵周期长,芽孢形成率低,成本高等问题,对此我们对发酵培养基进行了优化实验,以提高枯草芽孢杆菌的产量并降低生产成本.材料与方法材料菌种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),翔大生物技术研究中心有限公司保存.主要试剂牛肉膏,蛋白胨,氯化钠,葡萄糖,淀粉,硫酸锰,葡萄糖等.主要设备P270普通摇床,303AB一3隔水式培养箱,1600倍微生物显微镜,PHS一25G型酸度计,50升高级发酵罐,电热干燥箱等.检测方法活菌计数采用平皿活菌计数法,芽孢率采用芽孢染色后显微镜下计数比较.检测培养基:牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,葡萄糖1%,氯化钠0.5%,琼脂2%菌种处理安培管菌种活化:用无菌吸管吸取0.3--0.5毫升无菌水滴入安培管,轻轻震荡使冻干菌体溶解成悬浮状,取0.1--0.2毫升菌悬液涂于上肉汤培养基平皿上,37℃培养36小时.菌种筛选:挑取少许活化后菌落划线于促芽孢形成培养基(土壤浸出液1000毫升,牛肉膏6可克, 蛋白胨5克,琼脂20克,pH7.0～7.2)平皿上,37℃培养20小时左右取出,选大菌落挑到装有4.5毫升无菌水的试管中,震荡均匀后置120oC干燥箱中加热20分钟,再涂布于促芽孢形成培养基的平皿上培养,反复多次.最后选取平皿上的大菌落转接到促芽孢培养基的试管斜面上,37℃培养箱培养l3～15 小时拿出放入4~C冰箱保存备用.筛选前后种子作对比:从冰箱中拿出筛选前后的种子斜面各1支,分别接入装有肉汤培养基的三角瓶中,在37℃,每分钟195转的摇床上振动培养,每3小时涂片观察一次,培养36小时记录活菌数和芽孢率. 此过程重复3次.培养基选择首先选择四种不同培养基进行摇瓶培养比较,观察菌数和芽孢形成情况.培养基的配制:①号培养基:淀粉0.15%+葡萄糖0.5%+尿素0.1%+磷酸氢二钾0.3%+磷酸二氢钾0.15%+硫酸镁0.05%+酵母膏0.02%+氯化铁0.01%+碳酸钙0.01%+大豆粕1%;②号培养基:淀粉0.15%+葡萄糖0.5%+尿素0.1%+磷酸氢二钾0.3%+磷酸二氢钾0.15%+硫酸镁0.05%+酵母膏0.02%+氯化铁0.01%国外畜牧学——猪与禽第23卷第3期2003年5月?31'+碳酸钙0.01%+大豆粕1%+淀粉0.3%+3.08%浓度的硫酸锰溶液0.1%.③号培养基:牛肉膏0.3%+蛋白胨1%+葡萄糖1%+氯化钠0.5%;④号培养基:牛肉膏0.3%+蛋白胨1%+葡萄糖1%+氯化钠0.5%+淀粉0.3%+3.08%浓度的硫酸锰溶液0.1%;以上所有各种培养基的pH均调为7.0～7.2.以上每种培基各做三瓶,装液量100毫升/500毫升三角瓶,用四层纱布和牛皮纸包扎置立式压力蒸汽消毒器中于121℃灭菌20分钟,取出备用.摇瓶种子制备:将在冰箱保存的种子在无菌室内接入肉汤培养基中,在37℃,每分钟195转的摇床上振荡培养12小时.接种和培养:培养好的种子液以10%接种量分别接入四种不同培养基中37℃振荡培养,每隔12小时检测一次,36小时结束培养.此过程重复3 次.正交实验:我们将上述摇瓶结果相对较好的②号培养基作为基本培养基,设计了四个因素,三个水平的正交实验,以进一步优化培养基配比(培养36 小时测活菌数).正交实验设计见表1(所用培养基中其它营养成分不变).表1正交实验设计简表发酵罐实验以摇床正交实验得出的最佳培养基进行50升发酵罐培养,并与肉汤培养基进行对比.发酵罐培养的有关条件如下:定容30升,加消泡剂3‰,用NaOH溶液调pH值到7.5～8.0(注:因为灭菌后pH约下降0.5～1.0),培养121'112灭菌20分钟,培养温度37'112,搅拌转速200转/分钟,起始气流量比1:0.5.当芽孢率达到80%以上时,发酵结束.此实验重复两次.结果和讨论菌种处理结果从菌种优化的三次结果看:经优化后在相同的培养时间内(36小时)芽孢形成率由原先的约38% 提高到约96%,活菌数也由17.7亿/毫升提高到28.6亿/毫升.菌种处理结果见图1.处理前芽孢形成率(%)菌种处理结果处理后臼活菌数(亿/毫升)摇床实验的结果摇床实验所确定的四种培养配方依据是:①号培养基为普遍应用于培养细菌的培养基配方,③号培养基为经验配方,②号和④号培养基配方是在①,③号培养基的基础上分别添加0.3%的淀粉和添加30.8ppm浓度的硫酸锰而成.通过本试验证明锰离子,淀粉对芽孢形成有促进作用.②号培养基配比要明显优于其它三种培养基配比,培养到36小时芽孢率可达到95%以上,活菌数可达到27亿/毫升,故我们选择②号培养基作为基本培养基进行正交实验.摇床实验的结果见表2.表2摇床实验的结果培养基和检测项目培养时间(小时)122436培养基①芽孢率(%)活菌数(亿魔升)培养基②芽孢率(%)活菌数(亿魔升)培养基③芽孢率(%)活菌数(亿魔升)培养基④芽孢率(%)活菌数(亿魔升)个别芽孢约40约8026.2518.615.4个别芽孢约50约10027.1528.4526.2个别芽孢约50约8015.7519.112.25个别芽孢个别芽孢约2514.3619.2511.75正交实验结果表3显示了正交实验的结果.由表可见,影响因素为:MnSO4>豆粕>淀粉>葡萄糖;适宜条件为:葡萄糖1.5%,淀粉0.2%,豆粕3%,Mn-SO40.1%,磷酸氢二钾0.3%,磷酸二氢钾0.15%,.32.国外畜牧学——猪与禽第23卷第3期2003年5月∞∞∞∞加0目硫酸镁0.05%,酵母膏0.02%,氯化铁0.01%,碳酸钙0.01%.表3正交实验的结果发酵罐实验结果以摇床正交实验得出的最佳培养基进行50升发酵罐培养,与肉汤培养基培养的两次比较实验,结果基本稳定.采用优化培养基的培养结果比肉汤培养基有很大提高,主要体现在:①发酵周期缩短了24～26小时,在发酵生产中降低了能耗,且可提高年产量;②最终活菌数提高了约54.7%.芽孢形成比率高,菌体死亡率较优化前低24.7%.图2显示了两种培养基两次培养结果的对比.结论适合该菌株发酵的培养基配比为:葡萄糖1.5%,淀粉0.2%,豆粕3%,MnS040.1%,磷酸氢二钾0.3%,磷酸二氢钾0.15%,硫酸镁0.05%,酵母膏0.02%,氯化铁0.01%,碳酸钙0.01%.(参考文献7篇略)一◆l:了||I::||l:||.一-.一一./'一■——一一'———◆..-,一t一▲v..一.一二'.一一一.～.?:::!::,6l014182226303438424648培养时间,时)注:芽孢率1,活茵数1,芽孢率2,活茵数2代表两次肉汤培养基配方发酵培养结果;芽孢率3,活茵数3,芽孢率4,活茵数4代表优化的培养基配方发酵培养结果.图2两种培养基培养结果的对比代邮:257000鲁东营IZl区河滨路东营力大王农畜产公司于勇510000广州天河广汕路高唐科技产业园廖益平我们已将你们买的书寄出,但被邮局退回了,原因是"原写地址不详",希望你们见此通知后速与《国外畜牧学——猪与禽》编辑部联系.谢谢!国外畜牧学——猪与禽第23卷第3期2003年5月?33?∞舳∞∞∞∞加m0晕。

菌种测定方法

附录 A（规范性附录）枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌的计数和杂菌率的测定A.1 原理每个活菌在适宜的培养基和良好的生长条件下，经过合适的培养时间可繁殖成一个肉眼可见的菌落，通过对菌落数量的统计，便可计算出相应样品的单位活菌数。

A.2 培养基除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T 6682规定的三级水或相当纯度的水。

按本标准规定的方法配制培养基或购买商品化的产品。

A.2.1 枯草芽孢杆菌培养基A.2.1.1 成分营养琼脂 33g；蒸馏水 1000mL。

A.2.1.2 制法将33g营养琼脂溶解于蒸馏水中，定容至1000mL；121℃灭菌20min。

A.2.2 酿酒酵母菌培养基A.2.2.1 成分孟加拉红培养基 36.6g；蒸馏水 1000mL。

A.2.2.2 制法将36.6g孟加拉红培养基溶解于蒸馏水中，定容至1000mL；121℃灭菌20min。

A.2.3 植物乳杆菌培养基A.2.3.1 成分蛋白胨 10g；牛肉膏 10g；酵母提取物 5g；磷酸氢二钾 2g；柠檬酸三铵 2g；乙酸钠 5g；葡萄糖 20g；吐温-80 1mL；七水硫酸镁 0.58g；四水硫酸锰 0.25g；琼脂粉 20g；灭菌碳酸钙 3g；蒸馏水 1000mL。

A.2.3.2 制法将上述试剂依次溶解于蒸馏水中，七水硫酸镁和四水硫酸锰单独用蒸馏水溶解后混入前述溶液中，最后加入琼脂粉，定容至1000mL；121℃灭菌20min。

A.2.4 麦康凯培养基A.2.4.1 成分蛋白胨 17g；脙胨 3g；猪胆盐（或牛、羊胆盐） 5g；氯化钠 5g；琼脂 17g；蒸馏水 1000mL；0.01%结晶紫水溶液 10mL；0.5%中性红水溶液 5mL。

A.2.4.2 制法A.将蛋白胨、脙胨、胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正pH7.2。

将琼脂加入600mL蒸馏水中，加热溶解。

将两液合并，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用。

枯草芽孢杆菌使用说明

枯草芽孢杆菌(活菌数200亿/400亿)一、枯草杆菌概述：枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种。

单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。

无荚膜，周生鞭毛，能运动。

革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。

需氧菌。

可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。

在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。

广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。

二、枯草芽孢杆菌的作用机理：枯草芽孢杆菌大量应用于生物肥料。

当作用于作物或土壤时．能够在作物根际或体内定殖，并起到特定肥料效应。

目前，微生物肥料在培肥地力，提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化和修复土壤，降低农作物病害发生，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用．保护环境。

以及提高农作物产品品质和食品安全等方面表现出了不可替代的作用。

三、枯草芽孢杆菌的使用说明：特点：1.肠道定殖能力强。

2.耐氧化、耐高温、耐酸碱、耐挤压和耐温度变化，满足不同的肥料生产需求。

3.绿色、安全、高效、较少抗生素药物的使用。

成分含量：枯草芽胞杆菌有效活菌数大于200亿/克用法用量：贮藏：阴凉、干燥处密封保存。

保质期：密封保存不少于18个月。

四、枯草芽孢杆菌的应用范围：枯草芽孢杆菌不仅在肥料中应用比较广泛，在污水处理及生物肥发酵或发酵床制作中应用也相当广泛，是一种多功能的微生物。

1、市政和工业污水处理，工业循环水处理，腐化槽、化粪池等处理，畜牧养殖动物废料、臭味处理，粪便处理系统，垃圾、粪坑、粪池等处理；2、畜牧、家禽、特种动物及宠物养殖，水产养殖；3、可以与多种菌种混配，在农业生产中具有重要作用。

如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！。

枯草芽孢杆菌平板法菌落计数操作记录

3、培养：将涂布好的平皿倒置℃的生化培养箱中培养，培养时间自年月日时分开始。月日时分结束。
三、培养的平皿计数
稀释倍数
菌落数（CFU/皿）
芽孢菌落数（CFU/皿）
芽孢率
（%）
备注
1#
2#
3#
平均
1#
2#
3#
平均
四、结果计算与结论
样品中枯草芽孢杆菌数量（CFU/ml）＝菌落数×稀释倍数÷加液体积＝
结果：样品平板法菌落计数结果为：CFU/ml。
二、操作步骤
1、样品稀释：精密吸取ml已充分混匀的菌液，加至ml的试管中（或三角瓶），然后在振荡器上振荡秒，为倍稀释。
再吸取ml已充分混匀的稀释液，加至ml的试管中（或三角瓶），然后在振荡器上振荡秒，为倍稀释。
重复进行次，最后得到最小浓度为的稀释菌液。
2、涂布：选择最低浓度的3个稀释度，分别为，，分别从低深度至高浓度依次加入平行的无菌平皿中，每个平皿加ml，用无菌玻璃涂布棒将菌液涂布均匀，平放实验台上min。
SOP-QC001F001
R00/2011
潍坊欧普诺生物科技有限公司
枯草芽孢杆菌平板法菌落计数操作记录
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样品名称
样品编号/批号
样品来源
送样日期
年月日
培养基批号
配置时间
年月日
一、准备工作
1、操作间是否已清洁、紫外消毒。□符合要求□不符合要求
2、容器具、试管、吸量管等是否已清洁灭菌。□已清洁灭菌□未清洁灭菌
结论：符合□不符合□
日期：年月日操作人：复核人

QBHHS JC009-2013 枯草芽孢杆菌活菌计数办法

1检测方法
平板菌落计数法
2
准备材料2.1普通肉汤培养基：试剂名称
添加数量试剂名称添加数量蛋白胨
10克琼脂15g 牛肉膏
5克蒸馏水1000毫升
NaCl 5克配好后高压灭菌倒平板，37℃培养箱置16h（无菌检查），备用。

2.2
0.05％的琼脂生理盐水，高压灭菌2.3
1ml 枪头，高压灭菌2.4
0.2ml 枪头，高压灭菌2.5灭菌的试管
3
试验步骤3.1
向各灭菌试管中加入4.5ml 琼脂生理盐水，每个样品准备至少7支试管；3.2无菌称取0.5g 混匀的新鲜样品，加入到第1支试管，充分混匀后，吸取0.5ml 至第2支试管，同样处理，直到第后一管；
注意：每支试管一定要充分混匀，这是试验成功与否的关键！
3.3分别从最后3管用移液器吸出20μl，再分别滴种到普通肉汤培养基上，每个梯度做三个重复；
注意：一定要从后向前做！
3.4将滴好的平板正置放置30min，使其充分干燥后，再将其拿出置37℃培养箱好氧培养约12h，即可观察结果；
4计数
培养结束后，取出平板，计数每个平板每滴的细菌数量，计算三个重复的平均数，再乘以相应的稀释倍数，即得原样品中的活菌数。

检测技术规范与标准方法
编号：QB/HHS JC009-2013修订：第1版第1次修改枯草芽孢杆菌活菌计数方法起草：赵丽霞
审核：刘永垒
批准：
执行日期：2013年6月15日。

一种枯草芽孢杆菌的计数方法

一种枯草芽孢杆菌的计数方法作者：王梅卢宗梅陈影周勇邴狄祥刘利利郭世堂徐晓然来源：《当代化工》2020年第09期摘要：为了对一株高度黏连的产多种酶的枯草芽孢杆菌进行有效的活菌计数，试验采用普通培养基，蛋白胨添加质量分数1%、0.5%，牛肉粉和牛肉膏添加质量分数0.3%，氯化钠添加质量分数1%、0.5%，琼脂粉添加量1.5%、3.0%，在不同添加量下进行活菌计数及芽孢计数研究分析。

试验结果表明：普通培养基平板蛋白胨、牛肉粉和牛肉膏、氯化钠不同添加量条件下，该菌株枯草芽孢杆菌在平板显示菌落个数仍然比较大，菌落黏连在一起，造成计数偏低，难以形成有效的活菌计数，对产品质量无法准确判断。

针对这种情况，最终优化出一种合适平板培养基，蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、氯化钠0.5%、琼脂粉3.0%（均为质量分数），使本菌能够生长并菌落独立，计数结果准确，重复性好。

说明在活菌計数和芽孢计数中，优化培养基是某些特殊菌株（菌落黏连）的理想计数方法。

关键词：枯草芽孢杆菌;培养基;计数中图分类号： TQ016.1 文献标识码： A 文章编号： 1671-0460（2020）09-1930-04Abstract： In order to count a highly adherent bacillus subtilis which can produce multiple enzymes， in the experiment， the viable bacteria count and spore count were studied by adding 1%，0.5% peptone， 0.3% beef powder and beef extract， 1% or 0.5% sodium chloride， 1.5% or 3.0% agar powder. The results showed that the number of colonies of Bacillus subtilis was stillrelatively large on the plate with the common medium containing peptone， beef powder， beef extract and sodium chloride， and the colonies adhered together， resulting in a low count， it was difficult to form an effective count of viable bacteria， and the quality of products could not be accurately judged. In view of this situation， a suitable plate culture medium was finally optimized，containing peptone 1% ， beef extract 0.3% ， sodium chloride 0.5% and agar powder 3.0% . It was shown that the optimum medium was an ideal method for counting some special strains （colony adhesion） in the enumeration of living bacteria and spores.Key words： Bacillus subtilis; Medium; Counting枯草芽孢杆菌是我国允许使用的饲料微生物菌种，因其无毒、无害，经常被制成微生物添加剂，枯草芽孢杆菌在制剂中以内生孢子形式存在。

枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程

枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程一、实验器材准备1.带有盖子的培养皿2.加满蒸馏水的试管3.注射器及针头4.培养基、琼脂、葡萄糖、干燥棉签5.无菌铲子6.无菌尖嘴瓶7.显微镜、移液器、平板振荡器等二、样品的采集和处理1.选择代表性的土壤样品，并在24小时内用无菌探针采集5个不同位置的样品。

2.将每个样品混合均匀，取适量的土壤放入无菌容器准备使用。

三、菌液的制备1.取一个含有褐青素盐琼脂（PDA）培养基的无菌尖嘴瓶，将葡萄糖加入培养基中，按照比例加入适量的样品。

2.将培养基瓶密封并用高压灭菌器进行高温高压灭菌，杀死培养基中的已有细菌。

3.灭菌后将培养基倒入带有高度透明度的培养皿中，使其凝固。

四、制备样品的稀释液1.用蒸馏水装满试管。

2.将试管密封并用高压灭菌器进行高温高压灭菌，避免试管中的无菌水受到外界污染。

五、稀释菌液1.使用无菌针头在凝固的培养皿上划线。

2.采用无菌技术，将针头刺入活菌样品中，然后点在琼脂上。

3.在培养皿上划线的其他位置也同样操作。

4.将培养皿倒置在25°C温度下放置24-48小时，直到菌落生长到适当大小。

六、菌液的计数1.使用无菌铲子在菌落上刮取一小段。

2.将刮取物重新悬浮在无菌试管中。

3.按照适当的比例将菌液和蒸馏水混合，制备一系列的稀释液。

4.取稀释液的适量放在培养皿中，使其均匀覆盖整个琼脂表面。

5.将培养皿密封并放置在25°C下培养3-5天。

6.在培养皿上观察并计数活菌数量。

七、结果的统计和计算1.统计每个培养皿上的活菌数目，计算平均值。

2.根据样品的稀释倍数、培养皿中的活菌数目和悬液中的总体积，计算出每克样品中活菌的数量。

八、数据记录和分析1.将实验过程中的数据记录清晰，并进行相关的数据分析和比较。

2.结果的可靠性可以通过加入对照组进行验证，确保实验结果的准确性。

九、实验安全注意事项1.在实验过程中要严格遵守无菌操作的原则，避免外界污染。

2.注意实验室卫生，保持实验环境整洁。

枯草芽孢杆菌的检测方法

枯草芽孢杆菌的检测方法1、设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。

1.1恒温培养箱：37℃±1℃。

1.2冰箱：2℃～5℃。

1.3天平：感量为0.1g。

1.4均质器及无菌均质袋、均质杯。

1.5振荡器。

1.6无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

1.7无菌锥形瓶：容量250mL、500mL。

1.8无菌培养皿：直径90mm。

1.9显微镜：10倍～100倍。

1.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。

1.11恒温水浴箱80℃±1℃。

2、培养基和试剂2.1 营养琼脂培养基2.1.1 营养琼脂培养基成分蛋白胨10.0g 牛肉膏3.0g 氯化钠5.0g 琼脂16.0g蒸馏水1000mL2.1.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，补足蒸馏水至1000mL，于25℃时调节pH至7.2±0.2，分装于适宜容器中，121℃灭菌30min。

2.2营养肉汤培养基2.2.1营养肉汤培养基成分蛋白胨10.0g 牛肉膏3.0g 氯化钠5.0g 蒸馏水1000mL 2.2.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，补足蒸馏水至1000mL，于25℃时调节pH至7.2±0.2，分装于适宜容器中，121℃灭菌30min。

2.3无菌生理盐水2.3.1成分氯化钠8.5g 蒸馏水1000mL2.3.2制法称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。

2.4 革兰氏染色2.4.1结晶紫染色液2.4.1.1 成分结晶紫1g 95%乙醇20 mL 1%草酸铵水溶液80 mL2.4.1.2制法将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

2.4.2革兰氏碘液2.4.2.1 成分碘1g 碘化钾2g 蒸馏水300mL2.4.2.2 制法将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后再加蒸馏水至300mL。

统计活菌数目常用方法

统计活菌数目常用方法
统计活菌数目常用方法有：
1. 流式细胞术：通过将细菌样本稀释，并利用流式细胞仪测量细菌在流速下通过细胞孔的数目，以估计活菌数目。

2. 表面计数：将细菌样本均匀涂布在培养基上，并进行恰当的培养条件。

然后使用显微镜观察并计数活菌的数目。

3. 过筛法：通过过滤细菌样本，使较大的细胞被滤去，只保留较小的活菌，然后将过滤膜培养，并进行活菌的计数。

4. 冷冻储存法：将细菌样本冷冻保存，并在适当的时间间隔内解冻一部分样本，并进行适当的培养条件下计数活菌的数目。

5. 颜色指示剂法：使用特定的染色剂或化学试剂，可与活菌进行反应并产生特定颜色的变化，然后通过测量颜色变化的强度或浓度来估计活菌的数目。

注意：以上方法仅为常见且常用的细菌活菌数目统计方法，实际操作中可能还会有其他方法和技术的应用。

芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程

目的：建立芽孢杆菌活菌数含量的测定标准操作规程范围：本方法适用于的芽孢杆菌活芽孢的测定责任人：QC内容：1.仪器与工具：电子天平、生物显微镜、摇床、18×180mm试管、500ml三角瓶、10ml刻度吸管、1ml刻度吸管2．试剂与试液：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、无菌蒸馏水、吐温80等。

3.检测培养基配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂16g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，调至PH7.2，121℃灭菌30min。

4.检测步骤：4.1 菌液制备：采样量不少于500g，从所采的样品中精确称取10.00g试样，加入已灭菌的带玻璃珠（玻璃珠在80个左右）的500ml锥形瓶中，加入30ml已灭菌的无菌水，在摇床上200r/min摇动30min，再加入60ml已灭菌的无菌水，在摇床上200r/min摇动30min，即成母液的菌悬液。

4.2 用1ml无菌吸管吸取1ml上述母液的菌悬液，加入9ml无菌水混匀成1：1×101稀释的菌悬液，这样依此稀释，直至得到1：106；1：107；1：108；1：109等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。

4.3 用1ml无菌吸管分别吸取不同稀释浓度菌悬液1ml，加至已灭菌的平皿中，再加入50℃左右的培养基，向每个培养平皿中倒入约12ml培养基，混合均匀，待凝固后，倒置于36℃的恒温培养箱内培养18h—24h。

每个样品取3个连续适宜稀释度，每个稀释度重复3次，同时加入无菌水的空白对照，每个稀释度取5个到10个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。

5.菌落计数： 5.1 以平板上出现30个——300个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数。

5.2 当只有一个稀释度，其平均菌落数在30个-300个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数。

5.3若有两个稀释度，其平均菌落数30个-300个之间时，应按两者菌落总数之比值来决定。

若其比例小于2应计数两者的平均数，若大于2则计数其中稀释较小的菌落总数。

活菌培养计数检验方法

3.2.8将冷至40℃～45℃的熔化营养基倒入已加入样液的平皿中，每平皿15～20ml。
3.2.9将平皿盖好立刻轻轻摇动均匀，平放于台上，待琼脂凝固后，翻转平皿，使底朝上，置35±2℃恒温箱内培养。
3.3观察、计数和报告
3.3.1每日观察细菌生长情况，培养至48小时计算最终结果的菌落数。
3.3.2培养到时间后，计数每个平板上的菌落数，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏，在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算出原始样品中每片中的菌落数，进行报告。
有限公司
文件编号
版号
A.0
活菌计数检验法
页次
生效日期
2020/01/02
1．目的
规范及指导生物指示剂（枯草芽孢杆菌菌片）样本中含有的活菌数量的测定。
2．适用范围
适用于菌片活菌数确认。
3．内容
3.1仪器设备
净化工作台、恒温培养箱、刻度吸管(1ml)、PBS(磷酸盐缓冲液)、琼脂培养基
3.2操作步骤
3.2.1每批菌片抽取8个菌片样品试验。
3.3.4.2若所有稀释度的平板菌落数均小于30，则取最低稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告。
3.3.4.3若所有稀释度的平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
3.3.5若所有稀释度的平板菌落数均不在30~300之间，其中一部分小于30或大于300时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
3.3.6若阴性对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
3.3.7菌落总数的报告以10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。
3.3.8菌片活菌数结果以cfu/片为单位报告。
编制：
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枯草芽孢杆菌培养基配方

枯草芽孢杆菌培养基配方枯草芽孢杆菌培养基的组分是由葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、碳酸钙等5种原料构成,采用L16(45)正交表,将5种原料作为枯草芽孢杆菌培养有影响的因素,通过试验数理统计的直观和理论分析,对其配方进行优化。

试验结果表明,当培养基的配方为无水葡萄糖3.50 g/L、蛋白胨0.83 g/L、酵母膏0.50 g/L、磷酸二氢钾0.35 g/L和碳酸钙0.25 g/L,温度(34±2)℃时,培养16 h即可达到生长峰值。

由于枯草芽孢杆菌光学密度(optical density,OD)与活菌数量的关系:y=0.5182x2+1.4462x+1.9714(r=0.996343),接种的枯草芽孢杆菌由1.9714×108cfu/mL提高到3.3124×108cfu/mL。

优化的枯草芽孢杆菌培养基条件能有效促进枯草芽孢杆菌生长。

培养基：1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+20g琼脂，或牛肉膏蛋白胨配方(1000ml)加10g的葡萄糖。

ph为7即可，温度30度到37度皆可——条件不是很苛刻，比较容易培养。

枯草芽孢杆菌常用培养基配方：1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+20g琼脂枯草芽孢杆菌原生质体的制备1 培养枯草芽孢杆菌取亲本菌株T4412、TT2 新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基(CM)的试管中，36℃振荡培养14 h，各取1 mL 菌液转接入装有20 mL 液体完全培养基的250 mL 锥形瓶中，36℃振荡培养 3 h，使细胞生长进入对数前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其终浓度为0.3 u/mL，继续振荡培养2 h。

2. 收集细胞各取菌液10 mL，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心。

如此洗涤两次，将菌体悬浮10 mL SMM 中，每mL 约含108～109 活菌为宜。

科诺枯草芽孢检测方法

科诺1000亿枯草活芽孢检测方法1.1 鉴别试验根据菌株的生理生化特征，并结合个体形态和群体形态特征，参照《微生物分类学》和《伯杰氏细菌鉴定手册》，对菌株进行鉴定。

见资料性附录A。

1.2 1.0×1011活芽胞/克枯草芽胞杆菌可湿性粉剂芽胞数的测定1.3 枯草芽孢杆菌原药芽孢数的测定1.3.1 方法提要本孢子浓度法用来计算每克枯草芽孢杆菌原药的活芽孢数量。

1.3.2 试剂和溶液稀释液: 氯化钠18g，吐温80 2mL，蒸馏水2000mL，加热充分溶解后分装到5个500mL的三角瓶中，灭菌备用。

营养琼脂培养基与培养皿的制备：蛋白胨：10g，酵母浸粉：5g，NaCl：10g，琼脂粉：15g，蒸馏水1000mL,pH值：7.0-7.2。

灭菌后倒培养皿，备用。

1.3.3 仪器、设备警示:所有器皿必须洁净、无菌；不得使用矿质化的玻璃器皿；移液器具用前需校正。

分析天平：精度0.1mg；立式圆形压力蒸气灭菌锅；恒温培养箱；水浴锅:0-100℃；磁力搅拌器；超声波水浴器；旋涡混合器；中性瓶:250mL；试管: 18×150 mm；刻度量筒: 100 mL；移液枪：100 uL、1000 uL；移液枪头：100 uL、1000 uL；玻璃涂棒；培养皿: 90mm。

1.3.4 测定步骤1.3.4.1 样品的预处理每个样品重复检测3次。

a) 称取0.99～1.0lg(准确至0.0002g)的试样于250mL中性瓶中。

b) 再准确量取100mL稀释液倒入中性瓶中,然后把250mL中性瓶放在磁力搅拌器平台上,混合15min，之后再猛烈摇动1min，再次磁力搅拌混合15min。

c) 将已混合好试样的250ml中性瓶放入超声水浴器中（水浴器的水平面必须等同于试样液面，中性瓶应放在超声波振源处），共超声15min（7min时停止，猛烈摇动试样瓶，然后再超声8min）。

d) 在超声之后，再次用磁力搅拌混合60min。

枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程

文件名称枯草芽孢杆菌活菌数的测定操作规程文件编号编制人编制日期年月日颁发部门审核人审核日期年月日印制份数批准人批准日期年月日生效日期年月日分发部门质量管理部、生产部目的：建立枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定标准操作规程范围：本方法适用于的枯草芽孢杆菌活芽孢的测定责任人：内容：1.仪器与工具：电子天平、生物显微镜、摇床、18×180mm试管、500ml三角瓶、10ml刻度吸管、1ml刻度吸管2．试剂与试液：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、无菌蒸馏水、等。

3.检测培养基配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂16g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，调至PH7.2，121℃灭菌30min。

4.检测步骤：4.1 菌液制备：采样量不少于500g，从所采的样品中精确称取10.00g试样，加入已灭菌的带玻璃珠（玻璃珠在80个左右）的500ml锥形瓶中，加入90ml已灭菌的无菌水，在摇床上200r/min摇动60min，即成母液的菌悬液。

4.2 用1ml无菌吸管吸取1ml上述母液的菌悬液，加入9ml无菌水混匀成1：1×102稀释的菌悬液，这样依此稀释，直至得到1：106；1：107；1：108；1：109等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。

4.3向每个灭菌培养平皿中倒入约12ml培养基，混合均匀，待凝固后备用。

4.4用1ml无菌吸管分别吸取不同稀释浓度菌悬液0.2ml，加至已凝固好的培养基中，用涂布棒涂匀，在无菌操作台中静置30min后，倒置于37℃的恒温培养箱内培养18h—24h。

5.菌落计数：5.1 以平板上出现20个——200个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数。

5.2 当只有一个稀释度，其平均菌落数在20个——200个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数。