米曲霉种曲培养条件的优化
沪酿3.042米曲霉产中性蛋白酶条件的优化
沪酿3.042米曲霉产中性蛋白酶条件的优化阚清华;汤斌;张庆庆;张海龙【摘要】选择了8种影响因子利用Plackett-Burman设计法,对影响沪酿3.042米曲霉产蛋白酶的主要影响因子进行筛选,试验结果表明,影响该菌产蛋白酶的主要因子为培养温度、初始pH和料水比.利用最陡爬坡试验研究了其逼近最大响应区域,采用响应面法(RSM)对产酶条件进行了优化,并得出菌株产蛋白酶的数学模型;通过对二次多项回归方程求解,得最适产酶条件:培养温度为22 ℃,初始pH为7.0,料水比为1∶0.8.优化后,酶活提高了38.3%.【期刊名称】《安徽工程大学学报》【年(卷),期】2010(025)002【总页数】4页(P26-29)【关键词】米曲霉;蛋白酶;响应面;优化【作者】阚清华;汤斌;张庆庆;张海龙【作者单位】安徽工程大学,微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽,芜湖,241000;安徽工程大学,微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽,芜湖,241000;安徽工程大学,微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽,芜湖,241000;安徽工程大学,微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽,芜湖,241000【正文语种】中文【中图分类】TQ925酱油是我国传统酿造制品,有着几千年的实践经验.纯菌种代替野生菌的成功应用,使得酱油实现了大规模工业化生产,原料蛋白质的利用率大大提高,从最初的50%左右提高到80%左右[1].特别是我国上海酿造科学研究所诱变获得的沪酿3.042米曲霉新株,成为我国酿造酱油的最主要菌种,它具有蛋白酶活力高,生长快,适应性强,安全无毒[2]等优点.随后有许多科研工作者为了获得产量更高的菌株,在沪酿3.042的基础上进行研究.孙春华等[3]研究了碳源、氮源对米曲霉的产酶影响;李秀婷等[4]对沪酿3.042在不同碳氮源及pH,温度下的进行最佳产酶的条件研究.本研究利用响应面分析法[5]对沪酿3.042的产酶条件进行分析,找出影响其产酶的显著条件,通过试验,找出其产酶的最佳条件.1 材料与方法1.1 试验菌种米曲霉(Aspergillus niger)沪酿3.042,由安徽味甲天食品酿造有限公司提供.1.2 培养基斜面培养基:将豆粕加水5倍煮沸,小火煮1 h,每1 000 g豆粕制成1000mL浓度为4～5°Bé豆汁、可溶性淀粉20 g、(NH4)2SO40.5 g、MgSO4◦7H2O 0.5 g 、KH2PO41 g、琼脂25 g 、pH 自然,121 ℃灭菌30 min;种子培养基:麸皮 80 g、面粉 10g、豆粕 10 g、水 90 g、pH 自然、121 ℃灭菌 30 min;发酵培养基:豆粕、麸皮、水、其他(草木灰、磷酸盐等)、121℃灭菌30 min[6](其配比根据不同试验来确定).1.3 单因素发酵试验在影响米曲霉产酶的诸多条件中,选取了不同原料配比、豆粕的颗粒度、培养温度、曲料的初始润水量、曲料的初始pH值、添加草木灰和添加磷酸盐(以磷酸根计)等因素对米曲霉产酶的影响做单因素试验.豆粕在115℃下干蒸15 min,再1∶1比例润水(或不同pH或不同浓度的磷酸盐的水溶液)30 min,再加入麸皮、草木灰等,放入剩余的水或水溶液再润水20 min后,121℃,30 min灭菌,接种,前18 h,30℃培养,之后在26℃下发酵66 h后测中性蛋白酶酶活[7].1.4 产酶条件优化在单因素试验的结果上,进行Plackett-Burman试验,确定爬坡路径,最终用SAS 8.2软件进行响应面条件优化.40℃下每分钟水解酪蛋白产生1 μ g酪氨酸,定义为一个蛋白酶活力单位.中性蛋白酶活力测定:Folin法[8].2 结果与讨论2.1 单因素试验原料配比试验[9],豆粕与麸皮配比为8∶2,7∶3,6∶4,5∶5,4∶6,3∶7;豆粕颗粒度试验[10],豆粕颗粒度分别为＜16目、16目、9目、6目、4目;培养温度对米曲霉产酶的影响[4],在产酶阶段分别放到18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃下培养;曲料的初始润水量指总原料和水的配比,分别为1∶0.6、1 ∶0.8、1∶1.0 、1∶1.2、1 ∶1.4;初始pH 对米曲霉产酶的影响[12],把pH 分别为 4.0、5.0、6.0 、7.0、8.0、9.0、10.0的水溶液加入到曲料中;草木灰[13]添加量分别为原料质量的0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%;添磷酸盐对米曲霉产酶的影响[12],原料的润水改用不同浓度的磷酸盐(0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mol/L)水溶液处理后灭菌接种培养,测成曲中中性蛋白酶酶活.试验结果以测得中性蛋白酶酶活为参考值,得出每个因素产酶的最佳水平分别为:原料配比为豆粕∶麸皮比为4∶6;豆粕颗粒度为6目;产酶培养温度20℃;初始料水比为1∶0.8;初始pH7.0;草木灰添加量为培养基量0.4%;磷酸盐水溶液浓度为0.04moL/L.2.2 Plackett-Burman试验由单因素试验结果,根据Plackett-Burman试验设计得到的N=12试验组合(见表1).配制培养基,接种,发酵(每组3个平行样),以发酵终期的蛋白酶酶活为响应值Y,用于筛选主要影响因子.表1 Plackett-Burman试验结果RUN X1(料比)/(豆粕:麸皮)X2(颗粒度)/目X3(温度)/℃X4 X7(误差项)X5(初始润水量)/(料水比)X6(草木灰)/%(初始pH)X8(磷酸根)/(moL◦L-1)Y(酶活)/U 1 3∶7 ＜16 30 0 1:0.6 0 10 0.05 1207.3 2 3∶7 4 18 0 1:0.6 0 4 0.05 973.4 3 8∶2 4 30 0 1:1.4 0 4 0 251.1 4 3∶7 ＜16 30 0 1:0.6 0.8 4 0 1037.5 5 3∶7 4 18 0 1:1.4 0 10 0 1287.3 6 3∶7 4 30 0 1:1.4 0.8 4 0.05 419.5 7 8∶2 4 30 0 1:0.6 0.8 10 0 630.5 8 8∶2 ＜16 30 0 1:1.4 0 10 0.05 376.4 9 8∶2 ＜16 18 0 1:1.4 0.8 4 0.05 387.3 10 3∶7 ＜16 18 0 1:1.4 0.8 10 0 1243.3 11 8∶2 4 18 0 1:0.6 0.8 10 0.05 1780.9 12 8∶2 ＜16 18 0 1:0.6 0 4 0 1056.2由表2可以看出,对沪酿3.042产蛋白酶影响最大因素是培养温度、初始润水量、初始pH值,这3个因素对产酶影响较为显著,可信度高于95%.表2 因素、水平及影响效果因素 t值检验 Pr＞|t|概率重要性因素 t值检验 Pr＞|t|概率重要性X1料比 1.53418559 0.22537 4 X5初始润水量 -2.47604 0.089583 2 X2颗粒度 0.031577 0.976792 7 X3温度 -2.55358 0.083687 1 X4 误差项X6草木灰 0.316046 0.77268 6 X7初始pH 2.184659 0.116837 3 X8磷酸根 -0.3286 0.764056 52.3 爬坡试验根据Plackett-Burman试验结果分析确定爬坡路径.减少温度、料水比,同时增加初始pH对提高沪酿3.042产蛋白酶酶活有积极意义.因此将温度每次降低2℃,料水比每次减少20%,同时每次增加pH为1.0,其他次要影响因子固定在中心点水平,试验设计及结果见表3.在豆粕:麸皮为4∶6,豆粕颗粒度为6目,产酶培养温度为22℃,初始润水量为1∶0.8,草木灰添加量为0.4%,pH为7.0,磷酸根添加量为0.04mol/L 条件下沪酿3.042产中性蛋白酶酶活最高.表3 爬坡试验结果RUN X1(料比)/(豆粕:麸皮)X2(颗粒度)/目X3(温度)/℃X4X7(误差项)X5(初始润水量)/(料水比)X6(草木灰)/%(初始pH)X8(磷酸根)/(moL◦L-1)Y(酶活)/U 1 4∶6 6 18 0 1:0.4 0.4 5 0.04 22.7 2 4∶6 6 20 0 1:0.6 0.4 6 0.04 807.9 3 4∶6 6 22 0 1:0.8 0.4 7 0.04 1532.7 4 4∶6 6 24 0 1:1.0 0.4 8 0.04 1050.3 5 4∶6 6 26 0 1:1.2 0.4 9 0.04 830.62.4 响应面(RSM)条件优化通过Plackett-Burman试验和最陡爬坡试验结果分析,利用SAS8.2统计软件,设计Box-Beheken中心组合试验;试验因素及水平见表4,以发酵终期的蛋白酶酶活(U/g湿基)的平均值为响应值Y进行试验.试验设计及结果见表5.图1和图2为响应面分析的曲面图和等高线图.表4 Box-Beheken中心组合试验结果RUN X3(温度)/℃X5(初始润水量)X7(初始pH)Y(酶活)/U RUN X3(温度)/℃X5(初始润水量)X7(初始pH)Y(酶活)/U 1 20 1:0.6 7 1558.7 9 20 1:0.8 6 1856.5 2 20 1:1 7 2011.1 3 24 1:0.6 7 1247.5 4 24 1:1 7 1120.5 5 22 1:0.6 6 1399.7 6 22 1:0.6 8 1260.7 7 22 1:1 6 1077.0 8 22 1:1 8 1114.9 10 24 1:0.8 6 1564.2 11 20 1:0.8 8 2221.8 12 24 1:0.8 8 1337.1 13 22 1:0.8 7 1451.4 14 22 1:0.8 7 1439.1 15 22 1:0.8 7 1444.5表5 回归方差分析方差来源自由度平方和均方 F Pr＞F概率 RootMSE R-sequare一次项 3 709971.7 236657.2 13.74839 0.007521 6.4733 94.35%二次项 3 568876.9 189625.6 11.01613 0.012138交互项 3 179491.8 59830.58 3.475804 0.106689总回归 9 1458340 162037.8 9.41344 0.011854Box-Beheken中心组合试验结果以蛋白酶酶活为响应值,根据Box-Beheken设计表中温度、初始润水量、初始pH量,利用统计分析软件进行多元回归分析,得出蛋白酶活(U/g)依温度、初始润水量、初始pH量三元二次回归方程为Y1=1445-297.35X1-17.8875X2+4.6375X3+285.6375X21-144.85X1X2-148.1X1X3-246.1875X22+44.225X2X3+14.2625X23 ,表5中的F值检验显示,总回归达到显著.表明培养温度、初始润水量、初始pH这3个影响因素与蛋白酶活之间存在显著的回归关系.其中一次项、二次项、交互项较高,表明温度、初始润水量、初始pH量对蛋白酶酶活的影响是显著的.决定系数为94.35%,表明回归方程的拟合程度较好.图1、图2证实拟合面有真实的最大值,即各个具体因子都有一个最佳量.对上述蛋白酶酶活的回归方程求导,可得培养温度为22℃、初始润水量料水比为1∶0.8、初始pH为7.0,此时预测最大蛋白酶活为1532.6U/g.在此条件下,经3次重复试验验证,得到中性蛋白酶平均酶活为1549.8U/g,试验值与模拟值相差在2%以内,证实了沪酿3.042产酶酶活模型的可靠性.同时在优化前培养条件下,发酵得到蛋白酶活平均值为1120.5U/g.产酶条件优化后,沪酿3.042较优化前酶活提高了38.3%.图1 温度 X1、初始润水量X2、和初始pH值 X5两两浪酿产酶曲面图图2 温度 X1、初始润水量X2与初始pH值X5两两交互影响沪酿3.042产酶等高线图3 结论本试验在单因素试验的基础上找出每个单因素的最高水平值,在此基础上进行Plackett-Burman试验,试验结果表明培养温度、初始润水量、初始pH量这3个因素对产酶影响较为显著,由此结果再进行爬坡试验确定了3种因素的浓度范围.最终用SAS8.2软件进行Box-Beheken中心组合试验和多元回归分析对此实验结果进行了验证.产酶条件优化后,沪酿3.042酶活提高了38.3%.沪酿3.042的最佳产中性蛋白酶条件是:产酶培养温度为22℃,pH7.0,初始润水量为1∶0.8,原料豆粕对麸皮配比为4∶6,豆粕颗粒度为6目,添加草木灰量为0.4%,磷酸盐(磷酸根计)水溶液浓度为0.04mol/L.参考文献:【相关文献】[1] 贾爱娟.提高高盐稀态法酿造酱油原料蛋白质利用率及氨基酸出品率的研究[D].西北农林科技大学,2006:11-12.[2] 孟颢华.沪酿3.042米曲霉的纯化复壮[J].中国调味品,2001,7(269):7-9.[3] 孙春华,燕磊,常维山.不同碳源和氮源对米曲霉产酶影响的研究[J].西南农业学报,2007,20(5):986-990.[4] 李秀婷,赵进,鲁绯,等.米曲霉固态发酵产酶条件及酶活力研究[J].ChinaBrewing,2009,203(2):26-28.[5] 赵选民.试验设计方法.科学出版社[M],2006.[6] 贠建民,张卫兵,赵连彪.调味品加工工艺与配方[M].化学工业出版社,2007:108-109.[7] 林祖申.酱油生产技术问答[M].中国轻工业出版社,2000:29-30.[8] SB/T10317-1999,蛋白酶活力测定方法[S].[9] 陈阿娜,汤斌,张庆庆,等.根霉RhizopusspTC1产酶条件的研究[J].安徽工程科技学院学报:自然科学版,2006,21(4):20-22.[10]AshokPandey.RecentProcessdevelopmentsinsolid-statefermentation[J].processBiochemistry,1992(27):109-117.[11]叶勤.发酵过程原理[M].北京:化学工业出版社,2005:106.[12]葛向阳,田焕章,梁运祥.酿造学[M].北京:高等教育出版社,2006:124.。
米曲霉培养条件及培养基配方优化的研究
米曲霉培养条件及培养基配方优化的研究作者：宗玉梅林巧赵树东杨柳炜邓远均侯云境来源：《现代食品·上》2019年第03期摘要：本文利用单因素实验对米曲霉3.042培养基组成成分和培养条件进行优化，分别研究了培养基碳源含量、氮源含量、营养因子、加水量、培养温度、培养时间、初始pH对米曲霉生长情况的影响。
结果表明：蔗糖27g·L-1，硝酸钠2.5g·L-1，硫酸镁（MgSO4.7H20）0.6g·L-1，初始pH6.5，在30°C的环境下培养72h后，米曲霉生长得最好。
关键词：米曲霉3.042;单因素实验;培养基优化中图分类号：TS201米曲霉（Aspergillusoryzae）是中国传统发酵调味食品酱油酿造过程中使用的关键菌种之一，其产酶活力的高低会影响原料的利用率及产品的品质。
酱油的生产过程一般是原料处理、制曲、发酵、浸出淋油、加热灭菌、检测、包装等，在这些过程中，涉及各种微生物的作用。
因而近年来，越来越多的研究者对酱油酿造中的微生物群落进行研究，其中，霉菌是人们首要的研究对象，霉菌就有米曲霉、黑曲霉、红曲霉等。
米曲霉更是酱油酿造过程中的重中之重，它拥有极强分解蛋白质的能力和糖化淀粉的能力，在酿造酱油的过程中，就是用种曲培养米曲霉，等米曲霉不断繁殖大量后就会分泌出各式各样的酶，其中最多也最重要的就是淀粉酶和蛋白酶”。
鉴别产品品质、提高原料利用率及降低生产成本基本上是以把酶活性的高低作为参考之一。
实际上，提高米曲霉产蛋白酶活力不仅仅能够使原料的利用率得到提高，而且能够降低在酿造过程中对环境产生不良影响的概率，在工厂实际生产发挥了十分重要作用。
提高米曲霉产蛋白酶活力可以通过优化米曲霉培养基组成和培养条件实现。
1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1菌种米曲霉3.042，由四川省生生酱园食品有限公司分离出的一株高产米曲霉。
1.1.2主要仪器及试剂电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）、乐祺电子天平（上海瑶新电子科技有限公司）、手提式不锈钢压力蒸气灭菌器、生物显微镜B204LED（重庆奥特光学仪器有限公司）、电热恒温隔水式培养箱（黄石市恒丰医疗器械有限公司）、游标卡尺、苏净安泰洁净工作台、电子调温万用电炉（天津市泰斯特仪器有限公司）、四门双机双温冷柜（产品型号：QBSL-09S，耗电量5.0kW）、KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
纯种米曲霉AS3.042制曲黄豆酱的后发酵条件优化
纯种米曲霉AS3.042制曲黄豆酱的后发酵条件优化康蕾;刘素纯;胡茂丰【摘要】以黄豆为原料,通过纯种米曲霉AS3.042制曲,以氨基酸态氮含量为考察指标,采用响应面分析法优化黄豆酱的后发酵工艺条件.结果表明:黄豆酱后发酵期为40 d的最适保持温度为40.28℃,添加盐水的最佳浓度为9.66％(质量百分数),该浓度盐水的最适添加量为74.70％(体积百分数).采用该工艺条件发酵的黄豆酱,其氨基酸态氮含量为0.837 6 g/kg,与理论值(0.841 g/kg)接近.该工艺可运用于实际生产.【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2015(031)004【总页数】5页(P203-207)【关键词】米曲霉AS3.042;黄豆酱;氨基酸态氮【作者】康蕾;刘素纯;胡茂丰【作者单位】湖南农业大学食品科学技术学院,湖南长沙410128;食品科学与生物技术湖南省重点实验室,湖南长沙410128;湖南农业大学食品科学技术学院,湖南长沙410128;食品科学与生物技术湖南省重点实验室,湖南长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,湖南长沙410128【正文语种】中文自然发酵是自制黄豆酱最常见的发酵方式，在工厂与实验室中多采用人工接种不同菌种的方式来获得不同口感的产品［1，2］。
最常见的制曲菌种为纯种米曲霉，其优势在于蛋白酶活力强［3］。
经过制曲阶段菌种分解大豆产生蛋白质、糖类等有机物，在加入盐水的制酱过程中，这些有机物会在酵母菌及乳酸菌等的作用下进行分解产生醇、醛、酸、酚、酯类物质。
其中氨基酸态氮含量［4］常作为评判酱品质的指标。
笔者［5］前期曾分别用米曲霉、高大毛霉、根霉、黑曲霉等菌种制曲制酱，发现米曲霉制曲酱的效果最好，其游离氨基酸含量为174.17mg/g（干基），挥发性物质种类多于其他3种酱，对香味有贡献的物质含量也最多，在香味和营养价值方面最理想。
吴兰芳等［6］曾对曲霉型豆豉制取工艺进行优化，但目前尚未有关于用响应面法优化纯种米曲霉AS3.042制曲黄豆酱后发酵条件的研究。
米曲霉培养条件及培养基配方优化的研究
米曲霉培养条件及培养基配方优化的研究作者：宗玉梅,林巧,赵树东,杨柳炜,邓远均,侯云境来源：《现代食品》 2019年第5期◎ 宗玉梅1,林?巧1,赵树东1,杨柳炜1,邓远均2,侯云境2(1.西昌学院,四川?西昌?615000;2.四川省生生酱园食品有限公司,四川?西昌?615000)Zong Yumei1, Lin?Qiao1, Zhao Shudong1, Yang Liuwei1, Deng Yuanjun2, HouYunjing2(1.Xichang University, Xichang?615000, China;2.Sichuan Shengshengjiangyuan Food Co., Ltd., Xichang?615000, China)摘?要:本文利用单因素实验对米曲霉3.042培养基组成成分和培养条件进行优化,分别研究了培养基碳源含量、氮源含量、营养因子、加水量、培养温度、培养时间、初始pH对米曲霉生长情况的影响。
结果表明:蔗糖27 g·L-1,硝酸钠2.5 g·L-1,硫酸镁(Mg SO4?7H2O)0.6 g·L-1,初始pH 6.5,在30 ℃的环境下培养72 h后,米曲霉生长得最好。
关键词:米曲霉3.042;单因素实验;培养基优化Abstract:The composition and culture conditions of Aspergillus 3.042 medium were optimized by single factor experiment, and the effects of carbon source content, nitrogen source content, nutrition factor, water addition, culture temperature, culture time and initial pH on the growth of Aspergillus are studied respectively. The results showed that Aspergillus 27 g·L-1 grew best when sucrose, sodium nitrate 2.5 g·L-1, ma gnesium sulfate 0.6 g·L-1, initial pH 6.5 and 72 h were cultured in 30 ℃ environment.Key words:Aspergillus 3.042; Single factor experiment; Medium optimization 中图分类号:TS201米曲霉(Aspergillus oryzae)是中国传统发酵调味食品酱油酿造过程中使用的关键菌种之一,其产酶活力的高低会影响原料的利用率及产品的品质。
米曲霉的制备
毕业论文课题名称米曲霉的制备姓名学号所在系制药与生物工程系专业年级P09生物制药指导教师职称讲师指导教师职称二O一二年六月八日摘要微生物在酱油生产制曲工艺和发酵过程中起着至关重要的作用，在高盐稀态发酵工艺过程中，培养良好的米曲霉菌种不仅可以提高酱油中总氮、氨基酸态氮含量和酱油风味,而且还可以提高原料利用率。
因此米曲霉种曲培养是生产优质酱油的有效保证。
本论文主要介绍米曲霉在不同阶段的扩大培养方法，包括试管菌种、锥形瓶菌种、种曲罐菌种、种曲等方面的培养方法及注意事项。
米曲霉培养温度为28～32℃,培养时间为72h,米曲霉生长最旺盛作用,此时,曲料的曲酶孢子数大于8×109个/g,蛋白酶活力可达1000mg/100g以上。
关键词米曲霉；温度；时间；试管菌种；三角瓶菌种；扩大培养目录引言 (1)1 菌种的种类 (1)1.1 米曲霉 (1)1.2 黑曲霉 (1)2 菌种的选择条件 (1)2.1 不产生黄曲霉毒素及其他真菌毒素 (1)2.2 酶系全、酶活力高 (2)2.3 对环境适应能力强，生长繁殖快 (2)2.4 酿制的酱油风味好 (2)3试管实验 (2)3.1 灭菌 (2)3.2 培养基的制备 (2)3.3 培养基的鉴别 (2)3.4 接种培养 (3)3.5 菌种的留选 (3)4 锥形瓶培养 (3)4.1 原料配比 (3)4.2 接种培养 (3)5种曲制备 (3)5.1 种曲原料要求 (3)5.2 做料前检查事项 (4)5.3 做料 (4)5.4 蒸料 (4)5.5 抽真空 (4)5.6 降温 (4)5.7 接种 (5)5.8 自动培养 (5)5.9 开罐 (5)5.10操作过程中应注意的问题 (5)6种曲的质量标准 (6)6.1感官特性 (6)6.1.1外观 (6)6.1.2香气 (6)6.1.3手感 (6)6.2孢子数的测定 (6)6.2.1样品的稀释 (6)6.2.2制片 (7)6.2.3观察计数 (7)6.2.4注意事项 (7)参考文献 (9)谢辞 (10)引言米曲霉是一类产复合酶的菌株，半知菌亚门，丝孢纲，属真菌中的一种常见种。
高产蛋白酶米曲霉培养条件的研究8...
摘要蛋白酶是活细胞产生的生物催化剂，应用十分广泛；米曲霉具有丰富的蛋白酶系，是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会公布的安全微生物菌株之一，也是国内酱油等发酵食品生产的主要菌株。
因此，提高米曲霉的蛋白酶活力对于发展轻工业、提高产品质量有重要意义。
本论文利用米曲霉沪酿3.042为出发菌株，通过紫外诱变筛选出一株中性蛋白酶活力较高的菌株，命名为米曲霉UV-16。
该菌株的遗传稳定性较好，并将出发菌株的中性蛋白酶活力由1996.5 U·g-1提高到2368.0 U·g-1，蛋白酶活力提高了18.6%。
实验对米曲霉UV-16的酶系进行了研究，发现该突变株其他酶系基本没发生改变。
实验研究了基质组分和发酵条件对米曲霉UV-16产中性蛋白酶的影响，通过单因素实验，我们确定了麸皮为碳源，豆粕为氮源，豆粕添加量20%，KNO3添加量0.8%，MgSO4添加量0.07%，Na2HPO4添加量0.14%，每10g培养基接种1×108个孢子，温度28℃，加水量为原料量的85%，发酵时间70h，pH自然，并且发现FeSO4对产酶有抑制作用。
经过单因素实验，蛋白酶活提高到2707.8U·g-1，酶活力在诱变的基础上提高了14.3%。
单因素实验后，对加水量、培养温度、培养时间、豆粕添加量、KNO3、MgSO4利用响应面分析法精确找出最优条件。
通过PB实验，确定了培养时间和豆粕添加量为主要影响因素；通过最陡爬坡实验，找到了响应面实验的中心点；再通过中心组合实验，确定了最佳的培养条件：培养基加水量为87%，豆粕添加量23.37%，KNO3添加量0.7%，MgSO4添加量为0.08%，Na2HPO4添加量0.14%，每10g培养基接种1×108个孢子，培养温度为29℃，培养时间67h。
米曲霉UV-16产中性蛋白酶的能力达到2824.9U·g-1，蛋白酶活力再次提高4.3%。
青稞酒曲微生物多样性分析及米根霉制曲条件优化
青稞酒曲微生物多样性分析及米根霉制曲条件优化袁亦舟;张伟国;徐建中【摘要】采用高通量测序和分离培养相结合的方法对青稞酒曲进行微生物多样性分析,分离培养酒曲中的优势微生物,制作青稞酒纯种曲.结果表明,酒曲中真菌主要有根霉属、曲霉属、线虫草属和酵母属,其中米根霉是酒曲中真菌的优势菌株,同时也是主要糖化菌;细菌主要有库克菌属、球菌属、芽孢杆菌属、微球菌属等.随后,在利用米根霉制作纯种曲时发现,培养温度30℃、麸皮青稞粉配比2∶1、料水比40％、培养时间72 h、种曲接种量3.5％时糖化酶活力为1 246.9 U/g,液化酶活力为61.4 U/g,比原曲酶活力分别提高了9.2、2.4倍.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2018(044)005【总页数】7页(P39-45)【关键词】青稞酒曲;高通量测序;米根霉;条件优化【作者】袁亦舟;张伟国;徐建中【作者单位】江南大学生物工程学院,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122【正文语种】中文青稞酒是西藏地区的特色饮品，因西藏所具有的特殊地理因素和人文因素赋予了青稞酒独特的口感[1]。
曲为酒之骨，曲菌的繁殖和产酶将淀粉、蛋白质等分解，产生葡萄糖、氨基酸等营养物质和有机酸、高级醇等风味物质，对酒的品质和出酒率都有极大的影响[2]。
对酒曲中的微生物进行分析，对于筛选功能微生物，实现青稞酒的工业化生产有重要的意义。
最初研究酒曲中微生物的方法是传统的实验室分离培养法。
然而，酒曲中除了可培养的微生物之外，还存在着大量实验室无法培养的微生物，单纯依靠分离培养法不能反映出酒曲中真实的微生物菌群。
近年来分子生物技术成为研究微生物多样性的新的工具，但传统的微生物分离培养法仍然是分离获得优势菌种的重要方法[3]。
米曲霉GN―2菌株产中性蛋白酶固体发酵条件的优化
米曲霉GN―2菌株产中性蛋白酶固体发酵条件的优化摘要：对米曲霉（Aspergillus oryaze）GN-2菌株产中性蛋白酶固体发酵的条件进行优化。
单因素试验结果表明，米曲霉的固体适宜发酵条件为发酵原料麸皮∶豆粉为4∶1（质量比，下同），培养时间60 h，培养温度25 ℃，培养基加水量10 mL，接种量1×106个/mL孢子悬液2.0 mL，培养基起始pH 6.0，0.02%（NH4）2SO4溶液1 mL。
正交试验结果表明，在温度25 ℃、加水量20 mL、麸皮∶黄豆粉为4∶1、培养时间72 h的条件下酶活力最高，达1 016.9 U/g。
关键词：米曲霉（Aspergillus oryaze）；中性蛋白酶；产酶条件中图分类号：TQ925；Q93-33 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）07-1637-04Optimizing the Solid Fermentation Conditions of Neutral Protease fromAspergillus oryzae GN-2 StrainHUANG Yan，JU Lu-ning（Minbei V ocational and Technical College，Nanping 353000，Fujian，China）Abstract：The optimal solid fermentation conditions ofneutral protease from Aspergillus oryzae GN-2 strain was studied. The results of single factor test showed that the highest neutral protease activity was obtained under the conditions of wheat bran and soybean powder addition ratio 4∶1，fermentation time 60 h，temperature 30 ℃，water addition 10 mL，inoculum amount 2.0 mL 1×106 spores/mL spore suspension，the initial medium pH 6.0，0.02%（NH4）2SO4 1 mL. The results of orthogonal experiment showed that the highest neutral protease activity was obtained when the solid fermentation was carried out at 25 ℃for 72 h，water addition 20 mL and the addition ratio of wheat bran and soybean powder 4∶1，with the highest neutral protease activity of 1 016.9 U/g.Key words：Aspergillus oryzae；neutral protease；enzyme production conditions中性蛋白酶是指最适作用pH介于6.0～7.5的一类蛋白酶，能催化蛋白质肽键水解。
米曲霉
1.菌种特点：米曲霉( Asp.oryzae) 属于真菌菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。
背面无色。
分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。
分生孢子梗2mm左右。
近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。
顶囊近球形或烧瓶形，通常40~50μm。
上覆小梗，小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。
分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。
（半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种）。
菌落生长较快，质地疏松。
初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。
是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。
也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。
会引起粮食等工农业产品霉变。
米曲霉(Aspergillus oryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶,其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。
米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。
米曲霉米曲霉米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。
在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。
米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真核生物活性蛋白的载体。
米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵的条件，这将有助于提高食品酿造业的生产效率和产品质量。
米曲霉40214高产中性蛋白酶发酵条件的优化
米曲霉40214高产中性蛋白酶发酵条件的优化张彬彬;杨春华;窦博鑫;刘琳琳;邹丽宏;石彦国;刘颖【摘要】Using modern biological technology, medium compositions and fermentation conditions for producing more neutral protease through the cultivation of Aspergillus oryzae were optimized. With single factor trial and orthogonal experiment, the optimal medium compositions determined were: 8.0%glucose, 4.0% yeast extract and 0.10% Na2HPO4. The optimal fermentation conditions obtained were: culture temperature of 28℃, the initial pH of 6.5 and cultivation time of 96 h, 60.0%addition of water. The activity of neutral protease was enhanced to 2 845.68 U/mL. The results provide a theoretical foundation for improving neutral protease production and application in food fermentation of Aspergillus oryzae 40214.%运用现代生物学技术，对米曲霉40214菌株发酵产中性蛋白酶的培养基组分及培养条件进行优化，旨在提高菌株产中性蛋白酶的产量。
沪酿3.042米曲霉产中性蛋白酶条件的优化
在影 响米 曲霉 产酶 的诸 多条件 中 ， 取 了 不 同原 料 配 比 、 粕 的颗 粒 度 、 养 温 度 、 选 豆 培 曲料 的初 始 润水
量、 曲料 的初始 ｐ 值 、 Ｈ 添加 草木 灰 和添 加 磷 酸盐 （ 以磷酸 根 计 ） 因素 对 米 曲 霉产 酶 的影 响 做 单 因 素试 等
研 究 了其 逼 近最 大 响 应 区 域 ， 用 响 应 面 法 （ Ｓ ） 产 酶 条 件 进 行 了 优 化 ， 得 出 菌 株 产 蛋 白酶 的 数 学 模 采 ＲＭ 对 并
型 ； 过 对 二 次 多 项 回归 方 程 求 解 ， 最适 产酶 条 件 ： 养 温 度 为 ２ 通 得 培 ２℃ ， 初始 ｐ 为 ７０ 料 水 比 为 １。 ． ． Ｈ ．。 ０ ８ 优
３０２ ． ４ 的基 础上 进行研 究 ． 春华等 研究 了碳 源 、 源对在 孙 ］ 氮 李 ．４
不 同碳 氮 源及 ｐ 温 度下 的进行 最佳 产酶 的条 件研 究． 研 究利 用 响应 面分 析法［ 对 沪酿 ３ ０ ２的产 酶 Ｈ， 本 ｓ ．４
养， 之后 在 ２ ６℃下发 酵 ６ 测 中性 蛋 白酶酶 活吲． ６ｈ后
１ ４ 产 酶 条 件 优 化 ．
在 单 因素试 验 的结 果上 ， 进行 Ｐａｋ ｔ— ｕｍａ ｌｃ ｅｔ ｒ ｎ试 验 ， Ｂ 确定 爬 坡路 径 ， 终用 Ｓ ． 最 ＡＳ８ ２软 件 进行 响 应
面条件 优化 ． ４ ０℃下 每分 钟水解 酪 蛋 白产生 １ ｇ酪氨 酸 ， 义 为一个 蛋 白酶活力 单位 ． 定 中性 蛋 白酶活 力测 定 ： ｏｉ Ｆｌ ｎ法 ． ］
摘 要 ： 择 了 ８种 影 响 因 子 利 用 Ｐａｋｔ Ｂ ｒ ｎ设 计 法 ， 影 响 沪 酿 ３ ０ ２米 曲 霉 产 蛋 白酶 的 主 要 影 响 因 子 选 ｌ ｅ － ｕｍａ ｃ ｔ 对 ．４
米曲霉产脂肪酶的发酵条件优化
米曲霉产脂肪酶的发酵条件优化邓琳芬;郑毅;王娅;刘源慧【摘要】对米曲霉产脂肪酶的发酵培养基进行优化.首先通过单因素试验确定发酵最适碳源为玉米粉,最适氮源为蛋白胨,然后通过Plackett-Burman优化选出对发酵影响最显著的因素,分别为蛋白胨、橄榄油、Na2HPO4.产脂肪酶的最适培养条件为:玉米粉0.5%,蛋白胨5%,橄榄油1.5%,NaNO3 1%,Na2HPO4 0.25%,KCl0.05%,MgSO4 0.05%,FeSO4 0.001%.【期刊名称】《海峡科学》【年(卷),期】2010(000)010【总页数】3页(P12-14)【关键词】米曲霉;脂肪酶;发酵条件【作者】邓琳芬;郑毅;王娅;刘源慧【作者单位】福建师范大学生命科学学院;福建师范大学生命科学学院;福建师范大学生命科学学院;福建师范大学生命科学学院【正文语种】中文脂肪酶广泛应用于脂肪的生产工艺、去污剂和脱脂业、食品、工艺、精细化学品合成业、造纸业、化妆品制造业以及制药业中，脂肪酶还可用于油脂垃圾和聚氨酯的快速降解，大多数工业生产的微生物脂肪酶是出自真菌和细菌的酶[1]。
随着对脂肪酶研究的日益深入,其应用领域正日渐拓宽,与此相应,新型脂肪酶的研究开发就备受关注。
通过对原有脂肪酶改性或对菌株进行优化培养可以得到新型的脂肪酶[2]。
本研究对一株米曲霉产脂肪酶的发酵条件进行优化。
1.1.1菌种米曲霉，为本实验室保藏菌种。
1.1.2培养基斜面培养基：0.2%NaNO3，0.1%Na2HPO4，0.05%KCl，0.05% MgSO4，0.001% FeSO4,3%蔗糖,1.5%~2.0%琼脂,1%麸皮.种子培养基：0.5%玉米粉，0.5%葡萄糖，2%黄豆饼粉，0.5%酵母膏，1%NaNO3，0.1%Na2HPO4，0.05%KCl，0.05% MgSO4，0.001% FeSO4。
初始设计发酵培养基：1%玉米粉，4%黄豆饼粉，1%橄榄油，1%NaNO3，Na2HPO4 0.1%，0.05%KCl，0.05% MgSO4，0.001% FeSO4。
米曲霉的培养及蛋白酶的活性分析
液一 5
1
8
6
414 500 227 5
.81
3:2
粗酶 0.13 0.13 0.42 0.42 32.3 33.3 32.8 52.0 79 10 3887
液二 0
6
6
2
879 862 665 6
.71
2:3
粗酶 0.12 0.12 0.43 0.44 33.1 34.1 33.5 56.0 80 10 3768
=[4*82*10*25.71]/[10*5*(1-52.28)]
=84328.8/23.086
=3652.81(U/g) ② m(麸皮):m(豆粕)=2:3时，y=(0.426+0.422-0.1300.136)/2=0.291,代入上式得A=x=29.49
V=80 n=10 W=56.08 m=5g
米曲霉的培养及蛋白酶的 活性分析
一、米曲霉固态培养基配方设计
• 设计目的： • 本实验中需要培养的菌种为米曲霉。米曲霉是一种好气性
真菌，菌丝一般呈黄绿色，后为黄褐色，分生孢子球形平 滑，少数有刺。培养适温为37℃。根据参考文献及其考虑 到实验室菌株的差异性，我们的配方为： • 麸皮：豆粉=4:1 麸皮：葡萄糖=9:1 • 60%水（7.5ml） 自然pH • 每100g接种10*10^8个孢子，培养30℃，48h。
实验数据
OD6 空白 空白 样品 样品 称量 称量 称量 含水 粗酶 粗酶 酶活
60 ① ② ① ② 瓶(g) 瓶+ 瓶+ 量(%) 液体 液稀 力
湿基 干基
积 释倍 (U/g
样
(g) (g)
(ml) 数 干基)
品
粗酶 0.13 0.14 0.38 0.39 36.4 35.4 34.9 52.2 82 10 3652
米曲霉全小麦制曲条件的优化
生产与科研经验
图 1 焙炒小麦的水分含量变化曲线
图 2 焙炒小麦的色泽变化曲线
2 2 焙炒时间对成曲蛋白酶活力的影响 米曲霉分泌的蛋白酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白
酶和酸性蛋白酶, 其中中性蛋白酶和酸性蛋白酶在酱 油酿造中发挥的作用较为显著 [ 1] 。焙炒时间对成曲 蛋白酶活力的影响如图 3所示, 小麦成曲的中性蛋白 酶活力随着焙炒时间的延长逐渐增大, 在焙炒 30 m in 时达最大值 1036 U / g, 较生小麦提高 43% , 酸性蛋白 酶活力随着焙炒时 间的延长先降低后升 高, 在焙炒 30 m in时达最大值 421 U /g, 较生小麦提高 4% 。焙 炒时间延长, 成曲蛋白酶活力增强, 分析原因可能是 在焙炒过程中, 淀粉糊化, 蛋白适度变性, 同时有美拉 德反应产物生成, 使曲料更有利于米 曲霉的生长繁 殖。综上, 选定小麦经焙炒 30 m in后进行制曲培养。
在优化的米曲霉培养条件基础上, 分别添加酵母 抽提物、葡萄糖、美拉德反应产物 ( 见 1 1 3) 3 种营 养物, 并测定成曲的蛋白酶活力。 1 2 3 对比小麦成曲与大豆成曲蛋白酶活力
按照传统工艺, 将曲精与适量面粉拌匀后, 接种 至蒸煮后的大豆上, 制作 2日曲, 检测其成曲蛋白酶 活力, 并与以优化的小麦成曲进行对比。 1 3 分析方法 1 3 1 焙炒小麦水分的测定
始水分含量分别 为 40% 、45% 、50% 、55% 、60% , 各
接入 0 05% 曲精制曲, 培养 48 h, 测定成曲蛋白酶活
力。
1 2 2 3 曲精接种量的影响
按 1 2 2 1所确定的焙炒时间, 加水至 1 2 2 2
所确 定 的 曲 料 初 始 水 分 含 量, 分 别 接 入 0 04% 、
米曲霉种曲培养条件的优化
2.为确定最佳条件在各条件下测定蛋白水解酶 测定方法：福林-酚试剂法
标准曲线公式：y=0.1005x-0.1237
2.基本实验方案
(1).米曲霉在不同曲料pH条件下的酶活力 考虑到米曲霉的生长情况，选择范围为 pH为4~11。配置pH 4.0~11.0八类发酵 培养基。 (2).培养温度对米曲霉产蛋白酶活力的影响 在自然pH下，于温度分别于37℃、40℃、 43℃、46℃，在最佳的时间，测定蛋白 酶活力。 (3).培养时间对米曲霉蛋白酶活力的影响 在上述培养条件下，取40h，44h，48h 三个时间点测定米曲霉的蛋白酶活力， 确定最佳培养时间。
2.本试验创新之处
本课题在指导老师带领下，在不影响质量的前 提下，考虑价格，研究米曲霉培养条件的同时 结合废啤酒糟替代原料为研究方向，用废啤酒 糟来替代原料，为生产节约成本，创造更大的 经济效益。实验表明其成品酱油基本符合国家 二级酱油标准，若将这一方法成功推广，将 对部分农副产品延伸 产业链，降低酱油酿 造成本、提高相关企 业以及环境保护具有 积极的意义。
2.本课题研究的意义
酱油酿造过程主要依赖于米曲霉所产生的丰富的 蛋白酶、淀粉酶、酯酶等多种酶系,分解原料中的 各种成分 。生产过程中米曲霉主要作用是制曲和 发酵，制曲的目的是使米曲霉在曲料上充分生长 发育，并大量产生和积蓄所需要的酶。 其发酵机理是一个错综复杂的 物化学反应过程，其主要是淀 粉与蛋白质的分解与合成代谢 过程，通过温度和时间,让蛋 白酶分解蛋白质为氨基酸,淀 粉酶分解淀粉成葡萄糖。
传统甜面酱中米曲霉的分离与培养条件优化
传统甜面酱中米曲霉的分离与培养条件优化传统自然发酵酱的风味远比人工保温发酵产品优良，因为变温发酵过程有利于风味物质的形成。
因此对传统甜面酱种曲中的微生物进行分离、纯化和鉴定，筛选优良菌种用于工业化生产，对进一步提高甜面酱质量、改善其风味具有很重要的现实意义。
目前，甜面酱的酿制主要采用沪酿 3.042，并且甜面酱中主要功能菌株为米曲霉（Aspergillus oryzae），所以，研究重点对甜面酱种曲中的米霉菌进行分离鉴定和培养条件的优化，为对其进一步研究打下一定的理论基础。
1 材料与方法1.1 材料酱样品：于江苏省溧阳市收集的民间酱种曲样品。
培养基：菌落分离采用PDA培养基，菌种鉴定采用察氏培养基；霉菌发酵培养基（麸皮培养基）为250 mL三角瓶中加入8 g麸皮、2 g豆粕、10 mL水，于121 ℃灭菌30 min，摇散。
仪器设备：LDZX-50FBS型立式蒸汽压力灭菌锅购自上海申安医疗器械厂，数码照相机购自北京华旗资讯科技发展有限公司，SPX-300B生化培养箱购自上海跃进医疗器械厂，AIR TECH超净工作台购自苏净集团安泰公司，LHS-150SC恒温恒湿箱购自上海齐欣科学仪器有限公司。
1.2 方法1.2.1 菌种的分离与纯化在无菌条件下将曲捣碎，称取适量样品，选取适宜的稀释度用生理盐水稀释，采用含100 U/mL青霉素的PDA 培养基，采用稀释涂布平板法，每个稀释度接种3个平板，放置于30 ℃的培养箱内培养48 h，进行观察，将菌落形态不同的菌种分离，各自传代培养，至少进行3次传代分离，得到纯化菌种，保存菌种备用。
1.2.2 培养特征的观察对所有分离纯化的菌株划线平板培养后观察培养特征。
1.2.3 霉菌的鉴定湿室培养法：用接种环挑取少量待观察的霉菌孢子至载玻片上，用无菌细口滴管吸取少量60 ℃培养基，滴加到载玻片的接种处，在培养基未彻底凝固之前，用无菌镊子将皿内盖玻片盖在琼脂块薄层上，轻压。
米曲霉制曲过程中酶活性变化及其工艺优化
米曲霉制曲过程中酶活性变化及其工艺优化2007No.5?56?SerialNo.170ChinaBrewingInn.vati.nandKn.w1edgeTmsfer米曲霉制曲过程中酶活性变化及其工艺优化林祖申(上海酿造科学研究所,上海200237)摘要:国内酱油酿造主要选用纯种米曲霉,其制曲是酱油生产的一个重要工序.文中对米曲霉制各过程中水分,温度,空气,湿度,环境对米曲霉生长及酶活力的影响进行了探讨,并提出了加强制曲管理优化工艺的措施.关键词:水分;温度;酶活力;制曲管理中图分类号:TQ925文献标识码:A文章编号:2054—0571(2007)05—0056—04 ChangeofenzymeactivityinAspergillusoryzaecultivationandtechnicalopti mizationLZu—shen(InstitutionofBrewingScience,Shanghai,200237,China)Abstract:Aspergillusoryzaeisappliedtobrewsoyinourcountry.Kojimakingis animportantstepinsoyproduction.Inthispaper,theeffectsofwater,temperature,air,moisture,environmentongrowthofAspergillusoryz aeandenzymeactivityWerediscussed.Theimpo~anceof enhancingthemanagementofkojimakingandoptimizingthetechniquewereal soadvocated.Keywords:moisture;temperature;enzymeactivity;managementofkojimakin g制曲是我国传统技术,谚语:一曲,二醪,三熬油.说明制曲的重要性.古时称麴蘖,黄麈,黄衣,即由自然界野生曲霉菌在原料中生长繁殖制成的曲子.目前国内酱油酿造主要选用纯种米曲霉,以适宜的条件保证米曲霉等有益微生物生长繁殖,以优化条件使米曲霉分泌产生所需要的各种酶系,达到优质高产的目的.1制曲方法的演化酿造微生物大都是好气性的,为了适应曲霉菌的呼吸,散热,恒温等条件,一直沿用固态浅盘法制曲,如帘子,竹匾,木盘等,设备简单,劳动条件差,占厂房面积大,目前仅在农村小型企业还有存在.白改进为厚层通风制曲工艺后有先进的圆盘制曲及平面型通风制曲,实现了机械化制曲.国内厚层制曲的料层一般为25cm-30cm.风机选择中,低压离心通风机,全风压80mmH20～142mmH20,风量(ms/h)为总原料的4～5倍,如曲池总投原料1500kg,则风机的风量需为6000m/h-7500m3/h,可选择4—72—11,6通风机.2制曲的水分与质量关系微生物生长必需有适量的水.水是细胞组成部分,也是细胞吸收营养物质和排泄代谢产物的介质:微生物酶的活性也随着水分的增加而提高.此外由于水的比热高,是细胞散热的良好导体,调节细胞温度.因此水是微生物生命活动的主要成分.各类微生物对水分要求各不相同.然而微生物对水的可利用性不单纯是水分含量.在基质中存在的水分能被微生物生长利用的水分,称水分活性.表示水分活性就是水溶性的蒸气压与同温度纯水蒸气压的比值.即水在反应中的效力以Aw表示.Aw与溶液蒸气压有关,可测量蒸气中相对湿度的方法估算,例~tNAw为0.75相当于75%的相对湿度. 因此水分活性又可表示为:Aw=RH/100式中:RH为相对湿度.各种微生物都有一定的最适水分活性要求,当水分活性偏离最适要求时,微生物生长就受到抑制.曲霉的水分活性0.80～0.88;毛霉,根霉水分活性大于曲霉为0.92;一般细菌水分活性为0.92～0.97:酵母的水分活性0.88--0.94;耐盐鲁氏酵母为0.60;嗜盐细菌为0.75.从水分活性可知过高的水分有利毛霉,根霉及细菌生长.从生产实践中可知制曲水分对产品质量的有着很大的影响(见表1).收稿日期:2007.01.12作者简介:林祖申(1932.),男,浙江海盐人,高级工程师,主要从事酿造微生物,酱油工艺及调味品的研究工作.创新与借鉴中国酿造2007年第5期总第170期?57?表1制曲水分对成曲和酱油质量的影响Table1.Effectsonqualityofmaturekojiandsoybywater豆粕润水量熟料成曲细酱油质量/(g?lOOmL)水分/菌数%比例全氮游离氨澄清度成率/%慢日厦从表1可看出,随着制曲水分的增高,细菌总数也随着升高,氨基酸生成率也同步提高,54.5%水分酱油出现细菌性浑浊,42.5%水分蛋白变性不完全呈N性蛋白.以51%为宜.目前生产企业一般掌握在47o/50%.但也要视原料配比和制曲设备的保湿条件及气候条件适当上下浮动.如原料配比中麸皮比例较多时水分可略低些;制曲设备保湿条件好,水分略低些;冬季水分不易散发,夏季气候干燥水分略作浮动.3原料配比与制曲质量的关系酱油生产原料配比各异,北方地区常以豆粕:麸皮=70:30或60:40;南方地区以豆粕:小麦:麸皮=100:30~40: 10～20;日本工艺豆粕./J,麦=100:100;有些企业豆粕:面粉:麸皮=100:30:20;也有以豆粕与麸皮制曲;面粉或小麦单独制曲,最后混合发酵.笔者以为适量的麸皮有利于制曲和酶活力的提高;适当提高淀粉原料制曲增加微生物营养,有利于菌丝生长粗壮浓厚,经研究表明曲霉中肽酶和谷氨酰胺酶都是孢内酶,菌体内比菌体外高10 倍,而且菌体富含蛋白质和核酸,有利产品氨基酸的提高, 增加酱油鲜味.淀粉的六碳糖又能改善酱油的色泽红褐及光亮度,而且能被酵母利用发酵,产生风味物质.4温度与制曲关系制曲中温度,空气,湿度,以温度为中心.温度是制曲的技术关键,米曲霉在制曲过程中对温度管理分3个阶段:接种,生长,产酶.4.1接种温度要求40℃以下,理想的接种温度进入曲池后品温在(32±2)℃.米曲霉孢子虽较耐热但在接种温度76℃～80℃下lOmin便死亡.而芽孢杆菌能耐热100℃,所以较高接种温度易于污染细菌致使制曲失败.不同接种温度保持5min后放在平皿中28c《=培养,结果见表2.表2不同接种温度后28%培养18h曲料生长情况Table2.EffectsongrowthofAspergillusoryzaebyinoculation temperature注:”+”生长不好,”++”生长略好,”+++”生长良好.表3不同水分,培养温度,制曲时间的曲料酶活力(干基)比较parisonofenzymeactivityondifferentwater,temperatureandtheti meofkojimaking32h36h中酶,zk~-/%中酶,%祧20O7NO.5?58?SerialNo.170ChinaBrewingIru1ov{nionandKnow1edgeTransfer 4.2米曲霉的生长温度孢子发芽和菌丝繁殖30cI二～35cI二是米曲霉的最适温度,温度过低或过高都会影响发芽和生长速度,低于28cI二孢子发芽缓慢,对低温型微球菌,青霉,毛霉菌等杂菌容易生长.所以低温制曲要有纯净的环境为条件,否则容易污染杂菌.高于35~C枯草芽孢杆菌,根霉等耐高热性微生物容易生长繁殖,产生氨味,使曲料发黏,吐水.4.3产酶旺盛期的温度一般在翻曲之后菌丝大量繁殖,顶囊形成分子孢子开始着生,制曲时间在16h~18h后为产酶高峰期,要求低温制曲(见表3)品温28cI二～32cI二.从表3可以看出, 制曲水分与低温制曲对酶活力的影响.相同水分在低温条件下主要酶都有明显提高,相同温度条件下高水分酶活力明显高于低水分.沪酿3.042米曲霉的制曲条件与国外报道的低温制曲有利于酶的形成趋势是相似的.沪酿3.042制曲时间约在30h(见附图).但要视原料配比,水分高低,制曲条件而确定.如麸皮含量多,水分大,制曲温度偏低,制曲时间适当延长.现在国内对沪酿3.042米曲霉制曲时间大致分1d曲或2d曲.1d曲为30h左右;2d曲为36h-42h.=:=纂白酶:麟霎丞酶避+糖化酶至_r维系孵一碱性蛋白酶,,龉垛蓠霎避蜒蔷避髻附图制曲时间对酶活力的影响Attachedfigure.Relationsofdifferentenzymeactivityandthe timeofkojimaking5制曲管理曲料进箱完毕,要求立即通风调节料温,使品温均匀为30~C～32~C.如果是浅盘制曲只需要调节好室温和品温.厚层制曲还要通风调节温度.温度,空气,湿度是制曲管理的3大要素.以温度为中心.米曲霉的最适生长温度30cI二～35cI二,25cI二以下生长缓慢,40cI二以上生长困难.产酶的最适温度(30±2)cI二.米曲霉是好气性的菌株,曲霉的孢子吸收营养在4h-5h开始发芽,在发芽期本身不产生热量,需要外界保温,保持室温28cI二～30℃,品温30℃～32cI二,并首次通风数秒钟.提供少量空气有利于孢子发芽.随着菌丝生长,产生呼吸热和分解热,品温逐渐上升为35cI二～36cI二需要通入间断循环风即利用曲室内空气循环通风,既保持温度又保持湿度.接着菌丝大量繁殖产生大量热能.在制曲过程中米曲霉边生长边产酶分解蛋白质和淀粉质作为养料,部分糖分分解成CO和H2O,同时放出大量的热供培养所需的能量,大部分多余热量散发掉.由于自然热量的上升,由间断通风至连续通风.米曲霉分解淀粉并耗糖的反应式:(C6HIo05)+nH2O-÷nC6Hl206C6Hl206+602---~6CO2+6H20+738千卡热量当曲料白色菌丝布满结成块状,空气不易穿透,上下层温差加大时需翻曲1次,使曲料疏松,上下层温度均匀.此时菌丝大量繁殖热量很大,加强巡视,防止烧曲.为维持要求的品温,可适当补充室外新鲜空气,排除部分二氧化碳,调节温度.再经4h~6h,随着水分蒸发曲料开始收缩,发生裂缝,引起品温不均匀,需翻第2次曲,保证曲温均匀.一般在l6h以后是产酶旺盛期,也是顶囊和分生孢子形成期,必须掌握低温制曲,保持品温(30±2)cI二.20h以后品温逐渐下降,曲料水分散发而收缩出现跑风现象,可用铁铲以倾斜角度每隔2cm~3cm 从曲料上一铲到底,经铲曲后通风均匀.但铲曲颇费劳力,也可用机械翻3次曲代替铲曲.3次翻曲后逐渐排除室内潮湿空气(称排潮).整个制曲时f~30h左右.也有2d 曲36h~42h,视设备条件而定.制曲过程中湿度管理除了原料含有充沛的水分之外,在制曲前期0h~20h要保持曲室的湿度,湿度高有利于曲霉生长和酶的产生.特别是通风制曲水分易挥发, 通风干燥常会出现干皮,菌丝稀少,曲料似黄沙,酶活力低等缺点.在不同湿度条件下对蛋白酶活力的影响见表4.表4不同相对湿度对蛋白酶活力的影响Table4.Proteinaseactivityondifferentmoisture在夏季气候干燥条件下,要适当提高制曲水分.现在有些企业采用保湿条件好的圆盘制曲机或平面制曲机”加盖”保温,或在进风处设空调设备或在大曲房内创新与借鉴中国酿造2007年第5期总第170期?59?套小曲房有隔热保湿作用,形成良好的小气候.6成曲质量6.1感官鉴定手感曲料疏松柔软,具有弹性外观菌丝丰满粗壮,密生嫩黄色的孢子,无杂菌,无夹心,具有曲子特有香气,无霉臭及其他异昧.6.2理化指标水分(1d曲)30%～36%,(2d曲)26%-32%;福林法中性蛋白酶lO00U/g~上;成曲细菌数50x10个/g以下. 7制曲注意事项蒸料水分不低于46%,不高于51%.种曲孢子多,杂菌少,新鲜孢子发芽率高,符合种曲标准.接种要求均匀,接种后品温迅速调为30℃32℃,接种量为总原料的0.33%～0.4%,曲精0.3%～0.4%.熟原料接触的工具,竹箩,绞龙,输送带,曲池均须每次工毕清洁干净,保持卫生.特别是气流输送设备更需注意管道积料和卫生问题.制曲前期品温30℃～35℃,后期品温28℃～32℃.曲池内品温差距要缩小,不得超过2~C～3℃.8制曲中常见的污染菌8.1细菌微球菌(Micrococcus)是制曲污染的主要细菌.在低温,高湿通气量大的条件下极易生长,常在制曲初期污染,产生弱酸,使成曲pH值略有下降,少量污染能抑制枯草杆菌,大量污染造成酱油混浊及沉淀增多.粪链球菌(Screptococcusfaecalis)在高温,高湿通气不良条件下易生长,制曲前期繁殖快,产酸,少量污染能抑制枯草杆菌,污染过多影响曲霉的生长.枯草杆菌(Bacillussubtilis)是制曲污染有害菌的代表,在高温37oC~40~C,高湿通风条件好生长极快,消耗原料中的蛋白质和淀粉,产生刺鼻的氨昧,使成曲发黏吐水有异臭,手感黏糊.它具有芽孢,耐高温,不易杀灭. 8.2霉菌毛霉:菌丝呈白色,似兔毛,在低温高湿的条件容易生长,少量污染影响不大.根霉:菌丝呈白色,似蜘蛛网状,在高湿条件下易生长,有一定的糖化酶活力,少量污染影响不大.’青霉:菌丝呈灰色,孢子呈青色,在低温高湿条件下易生长.该菌生长较慢,污染后影响酱油风味.8.3酵母成曲中除了有益的鲁氏酵母,球拟酵母能增加酱油风味之外,还有有害的酵母如毕赤氏酵母,醭酵母在酱油液面形成醭(生白或霉花)消耗酱油中成分,影响酱油风味.有害酵母在低温,高湿,通风条件好时易生长,如江南霉雨季节(黄梅天)极易污染.被污染的成曲不酸不臭,色泽仍如熟原料一样.只要延长制曲时间米曲霉后来居上仍可挽回损失,但以不酸曲为前提. 9总结制曲技术决窍的5句话制曲决窍:一熟,二大,三低,四均匀,五清洁.一熟:要求原料蒸熟,达到蛋白质适度变性.二大:大水分,大风量制曲.在制好曲的前提下加大熟料水分.大风量有利好气性曲霉生长,防止嫌气性细菌繁殖.三低:接种进料温度低,制曲品温低,进风温度低.四均匀:生原料润水均匀,熟料接种均匀,装曲池疏松均匀, 曲料厚薄均匀.五清洁:曲室清洁,制曲工具清洁,接种器具清洁,熟料输送设备清洁,周围环境清洁.。
传统阳江豆豉发酵过程中米曲霉筛选及发酵条件优化
传统阳江豆豉发酵过程中米曲霉的筛选及发酵条件优化曲直，蒋爱民，孙韵，吴兰芳，栗俊广（华南农业大学食品学院，广东广州 510640）摘要：对从广东阳江豆豉的曲醅中筛选的米曲霉菌株进行培养基和发酵条件优化，结果表明，该菌产酶最适培养基的组成为添加3%的酵母粉、1%的葡萄糖、3%的硝酸钠和0.50%的氯化钙于基础PDA培养基中。
该菌株产酶最优发酵条件为温度30 ℃，pH值为7~8，250 mL三角瓶中装瓶量为120 mL。
在此最优条件下进行生长曲线绘制，培养12 h时，开始出现白色菌落，到36 h时，白色菌丝体明显增多，蛋白酶活力也持续增大，菌株培养48 h时，黄绿色孢子开始产生，蛋白酶活力达到最大值，到60 h时，菌株增长明显减慢，产生大量孢子，颜色较深，蛋白酶活力开始下降。
综合菌量和蛋白酶活力，培养48 h为最适发酵时间。
关键词：豆豉；米曲霉；纯种发酵；生长曲线文章篇号：1673-9078(2013)2-301-305Screening and Optimization of Fermentation Conditions ofAspergillus oryzae Isolated from Yangjiang Lobster SauceQU Zhi, JIANG Ai-min, SU Yun, WU Lan-fang, LI Jun-guang(College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou, China) Abstract: The optimization of medium and fermentation conditions of Aspergillus oryzae were studied, which isolated from Gguangdong yangjiang lobster sauce. The results showed that, the optimum medium contained 3% yeast powder, 1% glucose, 3% sodium nitrate and 0.50% calcium chloride in PDA. The optimal fermentation conditions was temperature 30℃and pH value 7~8. After cultivated 12 h, the medium was appeared white colony. At 36 h, white mycelium noticeably increased, protease activity also continued to increase. After 48 h, yellow-green spores were produced, protease vitality at maximize level, and at 60 h, strain growth slowed significantly, creating a large number of spore, and protease activity began to decline. So 48 h was the optimum fermentation time.Keywords: ;obster sauce; Aspergillus oryzae; pure fermentation; growth curve豆豉是利用微生物发酵的方法改变植物蛋白风味的大豆制品，以独特的工艺、细腻的品质、丰富的营养及鲜香可口的风味深受广大群众的喜欢[1~3]。
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5.酱油醅理化指标测定数据
五，小结
米曲霉菌种是酿造酱油品质优劣的 关键，本文通过一系列的研究表明 米曲霉的生命活动与其周围的环境 条件有密切的相关性。只有在适宜 的外界环境下，才能进行良好的生 长繁殖，产生人类所需的各种酶。
1.结论
本课题的实验研究表明米曲霉产蛋白酶的最佳 pH为7，最佳温度32℃，最佳培养时间为48小 时，。此外，在替代原料实验中，运用对照组 和实验组的数据对照，可以看出，啤酒糟：麸 皮=5:5与传统工艺培养的酶活基本一致，最后 根据酱油醅的理化指标分析，表明了用啤酒废 料替代原料的实践可行性。
在这样的一个经济快速发展的时代，人民生活 水平的提高,对酱油质量要求越来越高,需求量越 来越大,这与蛋白质资源缺乏的矛盾日益突出。 啤酒生产过程中产生了大量的废料，这些物质 大部分没有得到较好的利用，大多停留在原始 粗加工上，创利甚微，不但浪费资源，甚至会 污染环境。 对啤酒的废料的成分进行分析可知，废啤酒糟 中蛋白质含量为45%~50%，还有丰富的B族维 生素、有机磷、有机钙、铁等物质。
(5).米曲霉的替代原料培养 原料配比：（参照组）麸皮80% 面粉20% 水70%
四，实验结果与讨论
1.在不同初始pH下试验数据与讨论
2.不同温度下进行试验的数据与讨论
由图可看出，蛋白酶酶活力与其所处的温度有密切相 关，米曲霉产蛋白酶的最适温度为32℃。
3.不同培养时间条件下进行试验的数据与讨论
米曲霉种曲培养条件的优化
XXX 生物工程XXX班 指导老师：XXX（讲师）
一，引言
1.本课题研究的背景
米曲霉具有丰富的酶系,包括蛋白酶，淀粉酶， 纤维素酶，酯酶，果胶酶等多种酶，且其稳 定性高，被广泛的应用于食品、饲料、酿造 等发酵工业。 沪酿3042米曲霉是一个优良的菌株，不仅蛋 白酶活力高而且酶系较全，从20世纪60年代 末期开始，在酱油生产中广泛应用，至今已 40多年，无论是传统工艺生产还是速酿工艺 生产，都仍十分受欢迎。
二，实验内容
（1）通过米曲霉的活化，观察菌 种的菌丝体形状，颜色等来得到 纯化米曲霉； （2）单因子研究影响因素，主要 包括不同的pH、温度、培养时间 条件下对种曲的蛋白酶活力分布 的影响； （3）通过米曲霉的优化证明啤酒 下脚料完全有可能全部或部分替 代豆粕进行酱油酿造。
三，实验方法
1.米曲霉的分离纯化
2.本试验创新之处
本课题在指导老师带领下，在不影响质量的前 提下，考虑价格，研究米曲霉培养条件的同时 结合废啤酒糟替代原料为研究方向，用废啤酒 糟来替代原料，为生产节约成本，创造更大的 经济效益。实验表明其成品酱油基本符合国家 二级酱油标准，若将这一方法成功推广，将 对部分农副产品延伸 产业链，降低酱油酿 造成本、提高相关企 业以及环境保护具有 积极的意义。
因此，从理论上来说啤酒 糟完全可以替代全部或部 分豆粕作为酿造酱油的原 料。
本课题在指导老师的指导下展开 研究，主要切入点是针对酱油酿 造菌株-米曲霉蛋白酶活力低的问 题,为了提高原料的利用率, 降低 生产成本等问题，将研究菌种在 不同培养条件下的生长形状，生 长速度及其产酶活力情况来选育 优良的米曲霉菌种。
2.本课题研究的意义
酱油酿造过程主要依赖于米曲霉所产生的丰富的 蛋白酶、淀粉酶、酯酶等多种酶系,分解原料中的 各种成分 。生产过程中米曲霉主要作用是制曲和 发酵，制曲的目的是使米曲霉在曲料上充分生长 发育，并大量产生和积蓄所需要的酶。 其发酵机理是一个错综复杂的 物化学反应过程，其主要是淀 粉与蛋白质的分解与合成代谢 过程，通过温度和时间,让蛋 白酶分解蛋白质为氨基酸,淀 粉酶分解淀粉成葡萄糖。
2.为确定最佳条件在各条件下测定蛋白水解酶 测定方法：福林-酚试剂法
标准曲线公式：本实验方案
(1).米曲霉在不同曲料pH条件下的酶活力 考虑到米曲霉的生长情况，选择范围为 pH为4~11。配置pH 4.0~11.0八类发酵 培养基。 (2).培养温度对米曲霉产蛋白酶活力的影响 在自然pH下，于温度分别于37℃、40℃、 43℃、46℃，在最佳的时间，测定蛋白 酶活力。 (3).培养时间对米曲霉蛋白酶活力的影响 在上述培养条件下，取40h，44h，48h 三个时间点测定米曲霉的蛋白酶活力， 确定最佳培养时间。
从图可得，米曲霉的蛋白酶的活力和培养时间有密切 的关系，在40~44小时之间，蛋白酶活力成直线上升， 44小时之后，酶活力下降，在44小时达到最高峰， 所以最佳培养时间为44小时。
4.替代原料的米曲霉酶活试验数据与讨论
从米曲霉的生长表观指标来看，除全部替代组菌种生 长明显较差外，其余各实验组菌体均生长良好。 从表数据结果可看出，啤酒糟：麸皮=5:5配比组酶活 最高。
（1）米曲霉的分离纯化（平皿培养） 30℃保温箱内培养2d，选取菌落半径比值大，菌落 生长快，孢子多的单一菌落。 （2）米曲霉的斜面培养 在恒温箱30℃培养2—3d，直至长满茂盛的黄绿色 孢子。 （3）米曲霉的二次扩大培养（三角瓶培养） 在30℃保温箱内培养3d左右，瓶内曲料上布满白斑 及菌丝，孢子充分长满曲料