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食品酶学实验指导书

陆剑锋、孙汉巨

03月

实验一果胶酶的特性及其应用

一、实验目的

1. 掌握果胶酶活性的检测方法;

2. 了解与掌握果胶酶的特性;

3. 了解果胶酶在果汁澄清中的作用;

二、实验原理

果胶质是指植物中呈胶状的聚合碳水化合物, 是植物细胞间层和细胞壁的重要组分。果胶质由三种化学成分: α-l, 4-聚-D-半乳糖醛酸、阿拉伯聚糖和β-1, 4-D-半乳聚糖。果胶质按其分子中D-半乳糖醛酸上羧基酯化程度不同, 可分为原果胶、果胶酸和果胶酯酸。果胶是多缩半乳糖醛酸甲酯, 为白色或黄褐色的粉末, 溶于20倍的水则成粘稠状液体, 与三倍或三倍以上的砂糖混合, 更易溶于水, 对酸性溶液较对碱性溶液稳定, 不溶于乙醇及其它有机溶剂。

果胶酶(EC.3.2.1.15)是分解植物主要成分果胶质的酶类, 与纤维酶相似, 是一群酶, 至少有8种酶分别作用于果胶分子的不同位点, 基本上分为解聚酶和果胶酯酶两大类。前者能催化果胶解聚, 后者能催化果胶分子中的酯水解。果胶水解酶澄清果汁分两步完成。首先由果胶酯酶切断果胶的甲酯基, 生成果胶酸和甲醇, 紧接着液化型的果胶酸酶使果胶质低分子化, 生成带羧基的产物。多数羧基会与金属离子或其它成分结合而凝聚。这是可能发生二次沉淀的原因。

果胶酶广泛地分布于高等植物(胡萝卜、番茄、草莓、香蕉、桔子等)和微生物中。果胶裂解酶的生产局限于霉菌。其高产菌株多为曲霉和青霉

属。解聚酶来自于霉菌、细菌等微生物和胡萝卜等植物中。果胶酯酶除在水果和蔬菜中存在外, 在细菌相霉菌亦有发现。能引起橙、梨、苹果和香蕉腐败的微生物基本上都能产果胶酶, 因为这些水果中果胶含量高。有利于分解果胶的微生物的生长和发育。虽然有不少微生物都能产果胶酶, 但在工业生产中常采用真菌, 例如产酶活力高的曲霉、青霉、核盘霉等。

果胶酶主要应用于食品工业, 特别是水果加工。由于果汁粘度高, 致使过滤困难和产率低。果实经破碎后榨汁, 果胶溶出在果汁内, 造成果汁浑浊, 在储存中又会发生沉淀。利用果胶酶分解果汁中的果胶, 是果汁和果酒澄清的最好方法, 已广泛应用于苹果汁、葡萄汁、草莓汁和柑桔汁等的生产。

果胶酶的加量按成品酶活力而定, 一般为0.003％-0.1％, 在pH值为3-5, 35～55℃条件下作用2-12h。用前以果汁或水将酶稀释10-20倍。果浆用酶和果汁用酶均不能与酶同时使用膨润土、多酚物质和SO2( 浓度要小于500mg/L) 。为了检查澄清效果, 可将一份果汁与二份( 95%乙醇99∶浓盐酸1) 混合液混合均匀, 15分钟后观察, 果胶分解完全则无絮状物出现。贮存: 本品最佳贮藏条件为4-10℃, 一般为室温贮藏, 避免阳光直射。

三、实验材料与仪器

橘子等, 果胶酶, 95%乙醇。

721分光光度计; 恒温水浴; 离心机; 移液管0.5、5毫升; 离心管; 温度计; 试管; 试管架; 玻璃烧杯; 比色管。

四、操作步骤

( 一) 温度对果胶酶活力的影响

1．取9支比色管, 分别放入约10毫升橘汁, 再分别加入1%浓度的果

胶酶( 0、0.1、1) 毫升, 再补加蒸馏水至总体积22毫升。充分摇匀, 置恒温水浴中于35、45、55℃温度下反应2 h。

2．反应结束后, 将反应液放入离心管中进行离心分离( 3000rpm, 5min) 。

3．取上清液用蒸馏水稀释5倍后于721分光光度计于600nm处测吸光值。

4．计算

果汁澄清度( %) =( OD对照-OD) ÷OD对照×100

式中:

OD对照——对照的吸光值( 用蒸馏水代替酶液, 与反应液同样操作) ;

OD——酶反应液的吸光值。

5．根据在三个温度下果汁的澄清度的比较, 取澄清度最高的温度为最适温度( 见表1-1) 。

表1-1 温度对果胶酶活力的影响

( 二) pH值对果胶酶活力的影响

1．取9支比色管, 分别放入约10毫升橘汁, 再分别加入1%浓度的果

胶酶( 0、0.1、1) 毫升, 每3个比色管分别补加pH为3、4和5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液至总体积22毫升。充分摇匀, 置恒温水浴中于45℃温度下反应2小时。

2．反应结束后, 将反应液放入离心管中进行离心分离( 3000rpm, 5min) 。

3．取上清液用蒸馏水稀释5倍后于721分光光度计于600nm处测吸光值。

4．计算

果汁澄清度( %) =( OD对照-OD) ÷OD对照×100

式中:

OD对照——对照的吸光值( 用蒸馏水代替酶液, 与反应液同样操作) ;

OD——酶反应液的吸光值。

5．根据在三个pH下果汁的澄清度的比较, 取澄清度最高的pH为最适pH( 见表1-2) 。

( 三) 加酶量对果汁澄清的影响

以横坐标为添加的酶量, 纵坐标为澄清度, 作坐标图。用上述方法测定时, 果汁的澄清度与酶量之间的关系在澄清度80%以下时, 基本上近似直线, 澄清度在80%时, 肉眼也能看到几乎是透明的, 因此将此作为反应终点。把添加0.1毫升和1毫升分别的澄清度, 在坐标图上连接起来。找出澄清度达到80%时的最少使用酶量作为所需酶量。

( 四) 果胶酶活力的确定

在( 三) 的条件下, 能使1毫升果汁有80%澄清的酶活力定为1单位。

酶澄清果汁的活力( μ/ml) = d÷V×5

式中:

d——酶的稀释倍数;

V——所需酶量( ml) 。

( 五) 果汁中果胶的检验

分别取在不同条件下作用2小时的果汁2.5毫升置比色管中, 加入95%乙醇至总体积10毫升, 振荡。因果胶不溶于乙醇中, 如有果胶存在, 则有浑浊和沉淀生成, 比较浑浊生成量, 可知果汁经果胶酶澄清效果。

表1-2 pH值对果胶酶活力的影响

五、附录:

柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液( 0.1mol/L) , 3.0—6.2

0.1mol/L柠檬酸: 含C6H8O7.H2O 21.01g/1000ml;

0.1mol/L柠檬酸三钠: 含Na3C6H5O7.2H2O 29.40g/1000ml。