第三章 expression 酶工程与蛋白质工程 教学课件
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外源基因替换AOX1。整合率低，甲醇利用率低， 表达效率高
Gene insertion
Gene replacement
3、外源基因在毕赤酵母中的表达
表达载体构建 线性化和电击转化 转化子筛选和PCR鉴定 诱导表达和电泳检测
外源蛋白的表达方式
胞内表达
适合不含二硫键和非糖基化的蛋白，表达水平高， 但纯化较复杂
白酶缺陷的优点。
(DE3)指宿主为λDE3 溶原菌，其染色体上带有一拷
贝由lacUV5 启动子控制的T7 RNA聚合酶基因。
带有pLysS和pLysE的细胞产生溶菌酶，用于在诱导
前抑制T7 RNA聚合酶的基础表达。
Rosetta宿主菌从BL21衍生而来，可增强带有大肠
杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一 个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子AUA、AGG、AGA、 CUA、CCC和GGA的tRNAs。这样Rosetta菌株提供了 “万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用 频率导致的表达限制。
✓ 可通过改变外源基因的密码子来改善在大肠杆菌 中的表达
表达定位
细胞质：易水解；形成包涵体；纯化相对困难 细胞周质：易纯化；易折叠；不易降解；不易控制 细胞外分泌：易纯化；不易降解；不易控制 细胞质膜：用于膜蛋白 菌体表面：用于构建活疫苗、筛选文库、研究蛋白
与配体相互作用和细胞间粘附
宿主的选择
BL21是应用最广的宿主菌来源，具有lon 和ompT 蛋
AOX1启动子是目前最强有力和调控最严格的启动 子之一
表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷 贝的形式稳定整合
外源蛋白表达量高，易于分离纯化 糖基化程度低，抗原性低 培养基成分简单廉价，菌株易于进行高密度发 酵
1、表达菌株
目前，用于外源基因表达的毕赤酵母菌株主 要有：GS115，KM71和PMAD11，皆为甲醇诱 导型。SMD1168、SMD1163、SMD1165为蛋白 酶缺陷型菌株，可避免表达外源蛋白被宿主 菌同时表达的蛋白酶所降解。
第三章 重组蛋白的表达
大肠杆菌表达系统 酵母细胞表达系统 昆虫杆状病毒表达系统 哺乳动物细胞表达系统 体外翻译系统
2、影响外源基因在大肠杆菌中表达的因素
启动子 转录终止区 密码子偏好性
表达定位 宿主选择 培养条件
启动子
1，强启动子 2，本底转录低 3，诱导启动简单而经济
Lac启动子
弱启动子
培养条件
高密度培养 温度 pH 时间
营养成分 添加剂
3、真核基因在原核细胞中表达可 能遇到的问题
➢缺乏拼接机制 ✓cDNA ➢缺乏翻译和加工
➢容易降解
二、目标蛋白在酵母细胞中的表达
操作简单，易于培养，生长速度快，表达 量高，成本低。
可对外源蛋白的翻译后修饰，如糖基化、 蛋白磷酸化等。
毕赤酵母系统
多角体蛋白基因被外源基因取代后，不形成 多角体，易于在形态上与野生型区分。
1、杆状病毒表达系统的原理
1，构建能与NPV基因组DNA进行重组的转移载体质粒 作介导。
2，重组转移载体与野生型病毒DNA一起共转染昆虫 细胞，外源基因通过细胞内同源重组而插入病毒基 因组中。
3，利用空斑形态的差异进行筛选、纯化重组病毒， 再感染宿主细胞或幼虫，既可获得大量的外源基因 表达产物。
2、表达载体
1，整合型载体 2，稳定性高，拷贝数量低 3，穿梭载体：既可以在大肠杆菌中构建、 保存和扩增，线性化后又可以转入酵母细 胞中
胞内表达 pPIC3，pPIC3K，pPICZA等
分泌表达 pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1等
启动子
AOX1启动子
仅受甲醇诱导，有毒性和易燃
GAP启动子
2、杆状病毒表达系统的特点
重组蛋白具有完整的生物学功能：可为高表达
的外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配 及寡聚物的形成提供良好的环境，可使表达产物在 结构及功能上接近天然蛋白
在一些单细胞生物如E.coli、S.cerevisiae中，高 表达的基因密码子的使用偏好性一般比较大。
这些偏好可能与两个原因有关：一是避免使用类似 终止密码子的密码子；二是这些偏好能够有效地翻 译密码子，因为这些密码子对应于生物体中非常丰 富的tRNA。
➢富含E.coli不常用密码子的外源基因可能 得不到有效表达
受多种碳源如葡萄糖、甘油、甲醇或油酸诱导
选择性标记
营养缺陷型
His4、Suc2、Arg4等
抗生素抗性
G418、Amp
信号肽序列
外源蛋白自身的信号肽 酵母本身信号肽
α结合因子、酸性磷酸酶和蔗糖信号肽
表达载体与毕赤酵母的整合
单交换
外源基因插入His4或AOX1的上游或下游。整合率 高，可重复发生
双交换
百度文库
密码子的偏好性
生物体中编码同一种氨基酸的同义密码子的 非均衡使用现象。
例如，在酵母基因组中， 所有精氨酸的48%由密码 子AGA确定，而其余五种编码精氨酸的同义密码子 （CGT，CGC，CGA，CGG，和AGG）则以较低的大致 相等的频率被使用（每种10%左右）。
在果蝇中，比起其它五种选择（每一种的出现频率 约为13%）来说，更倾向于使用密码子CGC（33%） 编码精氨酸。
LacUV5启动子
非cAMP依赖型启动子，弱启动子
Tac启动子
trp启动子和lacUV5的杂合启动子，强启动子
Trc启动子
trp启动子和lac启动子的杂合启动子，强启动子
依赖于噬菌体RNA聚合酶的 T7启动子系统
高特异性
只有T7RNA聚合酶才能使其启动
高效
T7RNA聚合酶的效率比大肠杆菌RNA聚合酶高5 倍左右
✓ 降低培养基pH和温度 ✓ 添加蛋白栋和酵母提前物 ✓ 选用蛋白酶缺陷型宿主菌
发酵条件
通气量：摇瓶，发酵罐 碳源：甘油，甲醇 诱导方式：两步法 诱导用量：0.5-1%甲醇 诱导时间：5天 诱导pH 添加营养物质
三、 昆虫杆状病毒表达系统
核型多角体病毒的多角体蛋白是病毒感染晚 期高效表达的基因，其缺失对病毒的复制增 殖没有影响，可作为外源基因理想的插入位 点。
分泌表达
适合不稳定蛋白或毒性蛋白，纯化方便
表达产物的翻译后加工、修饰
信号肽加工
分泌表达
糖基化
N-, O-
磷酸化
二硫键形成
影响毕赤酵母表达的因素
外源基因的特性 整合位点和方式 基因剂量/拷贝数
产物稳定性 发酵条件
外源基因的特性
A+T富含区 5’-UTR序列和长度
稀有密码子
产物稳定性
宿主菌内蛋白酶水平
Gene insertion
Gene replacement
3、外源基因在毕赤酵母中的表达
表达载体构建 线性化和电击转化 转化子筛选和PCR鉴定 诱导表达和电泳检测
外源蛋白的表达方式
胞内表达
适合不含二硫键和非糖基化的蛋白，表达水平高， 但纯化较复杂
白酶缺陷的优点。
(DE3)指宿主为λDE3 溶原菌，其染色体上带有一拷
贝由lacUV5 启动子控制的T7 RNA聚合酶基因。
带有pLysS和pLysE的细胞产生溶菌酶，用于在诱导
前抑制T7 RNA聚合酶的基础表达。
Rosetta宿主菌从BL21衍生而来，可增强带有大肠
杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一 个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子AUA、AGG、AGA、 CUA、CCC和GGA的tRNAs。这样Rosetta菌株提供了 “万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用 频率导致的表达限制。
✓ 可通过改变外源基因的密码子来改善在大肠杆菌 中的表达
表达定位
细胞质：易水解；形成包涵体；纯化相对困难 细胞周质：易纯化；易折叠；不易降解；不易控制 细胞外分泌：易纯化；不易降解；不易控制 细胞质膜：用于膜蛋白 菌体表面：用于构建活疫苗、筛选文库、研究蛋白
与配体相互作用和细胞间粘附
宿主的选择
BL21是应用最广的宿主菌来源，具有lon 和ompT 蛋
AOX1启动子是目前最强有力和调控最严格的启动 子之一
表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷 贝的形式稳定整合
外源蛋白表达量高，易于分离纯化 糖基化程度低，抗原性低 培养基成分简单廉价，菌株易于进行高密度发 酵
1、表达菌株
目前，用于外源基因表达的毕赤酵母菌株主 要有：GS115，KM71和PMAD11，皆为甲醇诱 导型。SMD1168、SMD1163、SMD1165为蛋白 酶缺陷型菌株，可避免表达外源蛋白被宿主 菌同时表达的蛋白酶所降解。
第三章 重组蛋白的表达
大肠杆菌表达系统 酵母细胞表达系统 昆虫杆状病毒表达系统 哺乳动物细胞表达系统 体外翻译系统
2、影响外源基因在大肠杆菌中表达的因素
启动子 转录终止区 密码子偏好性
表达定位 宿主选择 培养条件
启动子
1，强启动子 2，本底转录低 3，诱导启动简单而经济
Lac启动子
弱启动子
培养条件
高密度培养 温度 pH 时间
营养成分 添加剂
3、真核基因在原核细胞中表达可 能遇到的问题
➢缺乏拼接机制 ✓cDNA ➢缺乏翻译和加工
➢容易降解
二、目标蛋白在酵母细胞中的表达
操作简单，易于培养，生长速度快，表达 量高，成本低。
可对外源蛋白的翻译后修饰，如糖基化、 蛋白磷酸化等。
毕赤酵母系统
多角体蛋白基因被外源基因取代后，不形成 多角体，易于在形态上与野生型区分。
1、杆状病毒表达系统的原理
1，构建能与NPV基因组DNA进行重组的转移载体质粒 作介导。
2，重组转移载体与野生型病毒DNA一起共转染昆虫 细胞，外源基因通过细胞内同源重组而插入病毒基 因组中。
3，利用空斑形态的差异进行筛选、纯化重组病毒， 再感染宿主细胞或幼虫，既可获得大量的外源基因 表达产物。
2、表达载体
1，整合型载体 2，稳定性高，拷贝数量低 3，穿梭载体：既可以在大肠杆菌中构建、 保存和扩增，线性化后又可以转入酵母细 胞中
胞内表达 pPIC3，pPIC3K，pPICZA等
分泌表达 pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1等
启动子
AOX1启动子
仅受甲醇诱导，有毒性和易燃
GAP启动子
2、杆状病毒表达系统的特点
重组蛋白具有完整的生物学功能：可为高表达
的外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配 及寡聚物的形成提供良好的环境，可使表达产物在 结构及功能上接近天然蛋白
在一些单细胞生物如E.coli、S.cerevisiae中，高 表达的基因密码子的使用偏好性一般比较大。
这些偏好可能与两个原因有关：一是避免使用类似 终止密码子的密码子；二是这些偏好能够有效地翻 译密码子，因为这些密码子对应于生物体中非常丰 富的tRNA。
➢富含E.coli不常用密码子的外源基因可能 得不到有效表达
受多种碳源如葡萄糖、甘油、甲醇或油酸诱导
选择性标记
营养缺陷型
His4、Suc2、Arg4等
抗生素抗性
G418、Amp
信号肽序列
外源蛋白自身的信号肽 酵母本身信号肽
α结合因子、酸性磷酸酶和蔗糖信号肽
表达载体与毕赤酵母的整合
单交换
外源基因插入His4或AOX1的上游或下游。整合率 高，可重复发生
双交换
百度文库
密码子的偏好性
生物体中编码同一种氨基酸的同义密码子的 非均衡使用现象。
例如，在酵母基因组中， 所有精氨酸的48%由密码 子AGA确定，而其余五种编码精氨酸的同义密码子 （CGT，CGC，CGA，CGG，和AGG）则以较低的大致 相等的频率被使用（每种10%左右）。
在果蝇中，比起其它五种选择（每一种的出现频率 约为13%）来说，更倾向于使用密码子CGC（33%） 编码精氨酸。
LacUV5启动子
非cAMP依赖型启动子，弱启动子
Tac启动子
trp启动子和lacUV5的杂合启动子，强启动子
Trc启动子
trp启动子和lac启动子的杂合启动子，强启动子
依赖于噬菌体RNA聚合酶的 T7启动子系统
高特异性
只有T7RNA聚合酶才能使其启动
高效
T7RNA聚合酶的效率比大肠杆菌RNA聚合酶高5 倍左右
✓ 降低培养基pH和温度 ✓ 添加蛋白栋和酵母提前物 ✓ 选用蛋白酶缺陷型宿主菌
发酵条件
通气量：摇瓶，发酵罐 碳源：甘油，甲醇 诱导方式：两步法 诱导用量：0.5-1%甲醇 诱导时间：5天 诱导pH 添加营养物质
三、 昆虫杆状病毒表达系统
核型多角体病毒的多角体蛋白是病毒感染晚 期高效表达的基因，其缺失对病毒的复制增 殖没有影响，可作为外源基因理想的插入位 点。
分泌表达
适合不稳定蛋白或毒性蛋白，纯化方便
表达产物的翻译后加工、修饰
信号肽加工
分泌表达
糖基化
N-, O-
磷酸化
二硫键形成
影响毕赤酵母表达的因素
外源基因的特性 整合位点和方式 基因剂量/拷贝数
产物稳定性 发酵条件
外源基因的特性
A+T富含区 5’-UTR序列和长度
稀有密码子
产物稳定性
宿主菌内蛋白酶水平