微生物作业

高转化率酿酒酵母的研究

摘要：从酵母浸粉中分离筛选出一株高产乙醇的菌株DL5168，经形态学观察、生理生化学及分子生物学鉴定，确定该菌株为酵母属的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。确定菌株DL5168发酵的最适条件为：初始葡萄糖浓度180 g／L；发酵温度30℃。在此条件下，菌株发酵的最终乙醇浓度为113．9 g／L，比对照菌株的乙醇浓度提高36％；乙醇转化率为0．64 g／g，比对照提高39％。

关键词：酿酒酵母；乙醇；筛选；鉴定

1 引言

乙醇具有“绿色石油”和“液体黄金”之称，与石油相比，具有可再生、污染小、可减少温室效应等优点，是一种清洁能源。目前，乙醇的生产方法包括化学合成法和微生物发酵法L2J。前者用石油裂解产生的乙烯与水合成乙醇，随着石油资源的目益枯竭，乙醇的这一合成方法也受到限制。微生物发酵生产乙醇，利用可再生资源作为发酵底物，具有绿色环保的优点，因此，该方法在未来更具有发展前景。

酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)是工业上生产乙醇的重要菌株，能发酵葡萄糖生产乙醇。然而在发酵过程中，高浓度底物(葡萄糖)和高浓度产物(乙醇)都会抑制酿酒酵母菌的生长和乙醇生成，导致乙醇产量和转化率不高L31。因此，对野生型酿酒酵母菌株的分离、筛选和鉴定，以期获得具有遗传性状稳定、耐受高浓度底物和产物抑制、又高产乙醇的

酿酒酵母菌，是非常必要的。

本文通过筛选得到一株高产乙醇菌株，经生理生化实验和分子生物学鉴定为酵母属的酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)，对该菌株发酵条件进行了初步优化，为该菌株今后在生产乙醇方面的应用奠定良好的基础。

2实验部分

2．1材料

2．1．1菌株

新菌株分离自酵母浸粉(北京奥博星生物技术有限责任公司)。对照菌为酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)GGMCC No．2．604，购白中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。2．1．2培养基[ 4]

(1)YPD种子培养液

酵母浸粉l％(m／v)，蛋白胨2％，葡萄糖2％；若配制YPD种子固体培养基，则再向YPD种子培养液中加入2％琼脂粉，蒸馏水配制1 L，自然pH值，0．1 Mpa灭菌20 min。

(2)YPD发酵培养基

酵母浸粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖18％，蒸馏水配制1 L，pH=7．0，0．1 Mpa灭菌20min。(3)TTC培养基

下层培养基：葡萄糖3％，琼脂2％，酵母膏0．5％，蛋白胨0．5％，蒸馏水配制1 L；上层培养基：葡萄糖0．5％，琼脂2％，TTC 0．05％，蒸馏水配制1 L； 0.1 Mpa灭菌20 min。

(4)WL琼脂培养基

酵母浸粉0．5％，胰蛋白胨0．5％，葡萄糖5％，琼脂2％，磷酸二氢钾0．055％，氯化钾0．0425％，氯化钙0．0125％,氯化铁0．00025％，硫酸镁0.0l25％，硫酸锰0．00025％，溴甲酚绿0．0022％。蒸馏水配制1 L，pH=6．5，0．1 Mpa灭菌20 rain。

(5)赖氨酸培养基

溶液A：硼酸0．01％，硫酸锌0．04％，钼酸铵0．002％，硫酸锰0．004％，硫酸亚铁0．025％，加水至1 L。溶液B：葡萄糖5％，磷酸二氢钾0．2％，硫酸镁0．2％，氯化钙0.02％，氯化钠0．01％，腺嘌呤O．0002％，DL一蛋氨酸0．0001％，L一组氨酸0．0001％，DL一色氨酸 0．0001％，溶液A 1 mL，乳酸钾(50％v／V)l2 g，琼脂2％，加水至1 L，以乳酸调pH至5．0～5．5。溶液C：L一赖氨酸1％，加水1 L。溶液D：肌醇0．2％，泛酸钙0．02％，盐酸硫胺素0．004％，吡哆醇0．004％，对氨基苯甲酸O．002％，烟碱酸0．004％，核黄素0．004％，生物素0．00002％，叶酸0．00001％，加水1 L。上述溶液灭菌后在45~50℃下按照B：C：D的体积比98：1：1混合，倒入培养皿中制成平板，在37℃下保温过夜备用。

(6)糖发酵基础培养基

12．5％豆芽汁培养基：黄豆芽125 g加水1 L，煮沸0．5 h，过滤后补充蒸馏水至1 L，即制成12．5％豆芽汁。按每100 mL 12．5％豆芽汁加入2％待测糖，即为糖发酵培养基。待测糖包括葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、棉籽糖和可溶性淀粉。0．1 MPa 灭菌20 min。

(7)同化碳源基础培养基

硫酸铵O．5％，磷酸二氢钾0．1％，硫酸镁0．05％，酵母膏0．02％，琼脂2％，蒸馏水配制1 L，过滤后分装试管，0．1 MPa灭菌20min。加入不同待测碳源即为同化碳源培养基，待测碳源浓度为2％(m／v)。待测碳源有葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、棉籽糖、肌醇、柠檬酸、可溶性淀粉。若待测碳源为有机酸，可将其加入至同化碳源基础培养基后，用0．1 M NaOH调pH值至5．7后灭菌；其它同化碳源培养基用盐酸调pH

值至5．7。

(8)同化氮源基础培养基

葡萄糖2％，磷酸二氢钾0．1％，硫酸镁0．05％，酵母膏0．02％，琼脂2％，蒸馏水配制1 L，过滤后分装试管，0．1 MPa灭菌20 min。加入不同待测氮源即为同化氮源培养基，待测氮源浓度为0．5％。待测氮源包括硝酸钠、硫酸铵、亚硝酸钠、L一赖氨酸。

2．2仪器设备

HZQ—F160型全温振荡培养箱(中国科学院武汉科学仪器厂)，7GC一14B气相色谱仪(日本岛津公司)，721分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。

2.3实验方法

2.3.1酵母菌的分离

取0．05 g酵母浸粉加入到已灭菌的9 mLYPD种子培养液中，30℃、170 rpm培养24 h，增菌，再转入酒精浓度为10％(w／v)的YPD种子培养液中，30℃、170 rpm培养24 h，再转入酒精浓度为18％(w／v)的YPD种子培养液中，30℃、170 rpm培养72 h，镜检，有无活菌存在，若有则取1 mL，接入YPD种子固体培养基中，30℃培养2。3 d，待长出菌落后，选择具有典型酵母菌菌落特征的单菌落进一步划线分离2．3次，经镜检为纯种后分别转入YPD种子固体培养基上，4℃保存。

2.3.2酵母菌筛选

(1)TTC琼脂培养基初筛酿酒酵母菌 [5]

将上述YPD种子固体培养基上的酵母菌活化，然后接入YPD种子培养液中，30℃、170 rpm培养24 h，涂布于TTC上层培养基上，30℃培养48 h，直至菌落出现，肉眼可见。然后倒入融化的TTC上层培养基，在30℃培养3 h使无色的TTC上层培养基被活细胞内的脱氢酶还原，变成红色。