原位杂交和免疫组化双标记技术在大鼠全脑脑片培养中的应用

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首都医科大学学报第３０卷

公司。

主要自配溶液ｐＨ７．３：①解剖缓冲液：６４％ＤＭＥＭ．３２％ＨＢＳＳ，６．５ｇｅＬ的Ｄ一葡萄糖，２．９８ｍｇ／ＬＨＥＰＥＳ，１００Ｕ／ｍＬ青霉素，１００斗ｇ／ｍＬ链霉素，２．５“∥ｍＩ，两性霉素；②完全培养液：５０％ＤＭＥＭ，２５％ＨＢＳＳ，２５％马血清，６．５ｇ／ｌ。的Ｄ一葡萄糖，２．９８ｍｇ／ＬＨＥＰＥＳ，１００Ｕ／ｍＬ青霉素，１００斗ｇ／ｍＬ链霉素，２．５¨∥ｍＩ。两性霉素。

１．２方法

１）全脑脑片的制备：按照ＡｄａｍｃｈｉｋＹ等｜８ｏ的方法，取出生后３ｄ的ＳＤ大鼠１２只，用７５％乙醇浸泡消毒后，断头取脑，迅速置于顶冷的解剖缓冲液中，冷却１５ｍｉｎ之后在解剖显微镜下剥除脑膜。在铺有滤纸的活组织切片机上切取全脑腩片，厚度为４５０“ｍ。将６孔培养板各孔内加１ｍＬ的完全培养液，然后放入插入式培养皿，取完好的脑片分放在各孑Ｌ内的滤膜上，置于培养箱内培养，温度３７℃，９５％的Ｏ：＋５％ＣＯ：及饱和湿度，每周更换培养液２次一’，每次进行半换液。

２）脑片形态学观察：在倒置显微镜下每周２次观察脑片在培养过程中的变化，了解腑片的存活和生长状况以及边缘是否清晰、结构是否明显。

３）冰冻切片以及ＨＥ染色步骤：将培养后的脑片用１０％的甲醛固定６ｈ，人３０％蔗糖过夜，以２０斗ｍ的厚度进行冰冻切片。ＨＥ染色主要步骤：用１０％Ｈａｒｒｉｓａ苏木精液染色３ｍｉｎ，０．５％盐酸乙醇分化数秒，饱和碳酸锂水溶液返蓝，蒸馏水漂洗后０．５％伊红染色１ｍｉｎ，水洗之后乙醇梯度脱水，入二甲苯透明，中性树脂封片。

４）原位杂交和免疫组化双标记步骤：将准备好的冰冻切片首先进行原位杂交：３％Ｈ：Ｏ：室温１０ｍｉｎ，蛋白酶Ｋ消化６～８ｍｉｎ，洗去蛋白酶Ｋ；乙酸酐／三乙醇胺浸片１０ｒａｉｎ，ＰＢＳ洗片５ｍｉｎ；滴加预杂交液，湿盒内放置至少１０ｍｉｎ；滴加杂交液，５８℃一６０℃杂交过夜；洗片：２×ＳＳＣ室温５ｍｉｎ，２×ＳＳＣ６０ｏＣ５ｍｉｎ，０．２ＸＳＳＣ６０℃１５ｍｉｎ，０．１×ＳＳＣ６０℃５ｍｉｎ，０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳｐＨ７．２冲洗３次。进入免疫组化检测；５％山羊血清／３％ＢＳＡ封闭，室温２０ｍｉｎ；加入ａｎｔｉ—Ｄｉｇ—ＡＰ以及稀释后的一抗Ｏｌｉｇ－１４ｏＣ过液；０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ冲洗３次。加入二抗，３７ｃＣ２０ｍｉｎ，０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ冲洗３次；加入三抗ＳＡＢＣ，３７℃２０ｒａｉｎ，０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ冲洗４次；ＤＡＢ显色，镜下观察结果，待显色适当之后，终止反应，０．０１ｍｏｌＪＬＰＢＳ冲洗３次；转入原位杂交，ＢｕｆｆｅｒＩ－Ｔｗｅｅｎ洗２次，各１０ｒａｉｎ，ＢｕｆｆｅｒＩ５ｍｉｎ，Ｂｕｆｆｅｒｍ平衡；ＮＢＴ／ＢＣＩＰ显色，镜下观察结果，待显色适当之后终止反应；梯度乙醇脱水，透明、封片；显色结果：原位杂交阳性结果：组织细胞内出现蓝紫色颗粒；免疫组化检测阳性结果：细胞内出现棕黄色颗粒。

２结果

２．１脑片培养大体观

肉眼观察脑片生长情况，随着时间的推移，脑片逐渐呈现半透明化，脑片组织生长良好，未出现污染现象。

２．２培养体系中全脑脑片生长状况

全腑脑片生长良好，随着培养时间推移，在倒置显微镜Ｆ可见脑片明显变薄，ｌ周后脑片厚度由原来的４５０斗ｍ渐减为１５０“ｍ左右，并维持这一厚度约３０ｄ。脑片结构逐渐清楚（图１）。

图１镜下观脑片培养的结果

Ｆｉｇ．１Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｂｒａｉｎｓｌｉｃｅｃｕｌｔｕｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄ

ｕｎｄｅｒｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ

ＡｒｒｏｗｓｈｏｗｓｔｈｅｓｌｒｕｅｔｕｒＰｏｆｌａｔｅｒａｌｖｅｎｔｒｉｃｌｅ（１００×）

２．３ＨＥ染色结果

直接取大鼠乳鼠的脑组织作为正常对照，取脑片培养之后进行冰冻切片并行ＨＥ染色，结果表明，与对照组相比脑片培养组的细胞结构清晰，细胞形态正常，细胞核完整（图２）。

２．４原位杂交和免疫组化双染结果

对培养的脑片经过冰冻切片之后进行原位杂交和免疫组化的双染分析，原位杂交以出现高于背景色的深蓝色颗粒为阳性结果，免疫组化以出现高于背景色的棕黄色颗粒为阳性结果。结果表明免疫组化和

原位杂交的阳性信号均出现于脑组织细胞核中，但并

第６期杨丽君等：原位杂交和免疫组化双标记技术在大鼠全脑脑片培养中的应用８１９不完全重叠，原位杂交阳性信号相对弥散，而免疫组化染色阳性信号具有明显的空间特征（图３）。

图２冰冻切片ＨＥ染色效果

Ｆｉｇ．２ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＨＥｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｆｒｏｚｅｎｓｅｃｔｉｏｎ

Ａ：Ｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（１０００×）；Ｂ：Ｔｈｅｂｒａｉｎｓｌｉｃｅｃｕｌｔｕｒｅｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｃｅｌｌｓｏｆｂｒａｉｎｓｌｉｃｅｇｒｅｗｗｅｌｌｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｃｏｎｔｒｏｌ（１０００×）

图３联合应用原位杂交和免疫组化进行少突胶质细胞系基因１的检测

Ｆｉｇ．３Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ

ｌｉｎｅａｇｅｇｅｎｅ－１（Ｏｌｉｇ－１）ｕｓｉｎｇｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ，１０００×）

ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ａ，４００×）

ａ：Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓｉｇｎａｌｏｆｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｂ：Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓｉｇｎａｌｏｆｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．

３讨论

早产儿脑损伤多发生在侧脑室周围¨０｜，一方面，利用动物模型进行有效的全脑脑片的培养成为必需；另一方面，由于培养的脑片随着培养时间的推移日益变薄，如何利用培养后的脑片顺利切片进行核酸和蛋白的检测也成为科学研究中的重点及难点问题。双标记技术因其节省切片标本以及减少样本误差的特点显示出其特有的优势。原位杂交和免疫组化双标记技术可以在同一张组织切片上同时检测核酸和蛋白，与传统的单一检测方法相比，双标记技术具有其突出的优越性，即可以克服由于切片间多种差异而引起的时空误差。以往原位杂交和免疫组化双标记技术见于检测人体组织中的病毒¨Ｈ２１以及人体特定基因的表达¨到等方面，用于检测培养中脑片的尚未有相关的报道。

本研究中，作者首先成功地建立了全脑脑片培养技术，通过本研究结果可以断定培养的脑片组织细胞存活性良好，可以进行后续的研究。基于以往研究者的经验，推荐先进行原位杂交，后进行免疫组化标记¨４。１５。。本文作者通过图３结果观察到，双染技术可

以较清晰地显示核酸和蛋白的不同表达模式以及表